(10檢本)第七章 熒光免疫技術(shù)

1、檢驗(yàn)學(xué)院 何 濤教學(xué)目的要求： 掌握免疫熒光顯微鏡技術(shù) 掌握時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù) 了解熒光免疫測(cè)定的臨床應(yīng)用1、概述、概述熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來(lái)的一種方法，是免疫性結(jié)合起來(lái)的一種方法，是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種檢測(cè)標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種檢測(cè)方法。方法。 近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一系列新的儀器和技術(shù)問(wèn)世，使熒光技術(shù)不斷完善，已儀器和技術(shù)問(wèn)世，使熒光技術(shù)不斷完善，已從原來(lái)僅限于檢測(cè)固定標(biāo)本，如檢測(cè)組織切從原來(lái)僅限于檢測(cè)固定標(biāo)本，如檢測(cè)組織切片或細(xì)胞表面的抗原，

2、擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分片或細(xì)胞表面的抗原，擴(kuò)大到進(jìn)行活細(xì)胞分類(lèi)檢測(cè)及多種成分定量檢測(cè)。熒光技術(shù)已被類(lèi)檢測(cè)及多種成分定量檢測(cè)。熒光技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和科學(xué)研究。廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)和科學(xué)研究。2、技術(shù)分類(lèi)： 熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù)) 抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判 定結(jié)果的檢測(cè)方法。 免疫熒光測(cè)定技術(shù)： 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定 熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn)第一節(jié)熒光免疫技術(shù)的特點(diǎn) 熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來(lái)處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱(chēng)為熒光（fluorescence）。

3、一、熒光的基本知識(shí)（一）發(fā)射光譜（一）發(fā)射光譜 指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到的樣品發(fā)射熒光的相對(duì)強(qiáng)度。（二）（二） 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品所記錄到的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變（三）熒光的效率：熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率成熒光的百分率熒光效率熒光效率發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）（四）熒光壽命（四）熒光壽命 熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度所用的時(shí)間。 各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。（五）熒光的淬滅（五）熒

4、光的淬滅 熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退成為熒光淬滅。例如紫外線(xiàn)照射、高溫、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（六）熒光偏振（六）熒光偏振二、熒光物質(zhì)二、熒光物質(zhì)第二節(jié) 熒光抗體的制備一、抗體要求二、熒光素要求三、熒光素標(biāo)記抗體的方法四、熒光素標(biāo)記抗體的純化五、熒光抗體的鑒定六、熒光抗體的保存第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù)第三節(jié)免疫熒光顯微技術(shù) 免疫熒光顯微技術(shù)的免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理基本原理是：熒光抗是：熒光抗體可與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原體可與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可

5、見(jiàn)明熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見(jiàn)明亮的特異熒光，即可對(duì)標(biāo)本中的抗原物質(zhì)亮的特異熒光，即可對(duì)標(biāo)本中的抗原物質(zhì)進(jìn)行鑒定。進(jìn)行鑒定。一、標(biāo)本的制作一、標(biāo)本的制作熒光顯微技術(shù)主要是靠觀察切片標(biāo)本上熒熒光顯微技術(shù)主要是靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行鑒定和定光抗體的染色結(jié)果來(lái)對(duì)抗原進(jìn)行鑒定和定位。因此，標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢位。因此，標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測(cè)結(jié)果。測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大常見(jiàn)的臨床標(biāo)本有：組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類(lèi)，可分別制成切片、印片和涂片。類(lèi)，可分別制成切片、印片和涂片。 組織切片：組織切片：冷凍切片、石蠟切片（最常用）冷凍切片、石蠟切片

6、（最常用） 印片：印片：肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織肝、脾、淋巴結(jié)等器官或組織 涂片：涂片：各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和各種體液、穿刺液、細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液 培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞：?jiǎn)螌优囵B(yǎng)細(xì)胞（人喉癌上皮細(xì)單層培養(yǎng)細(xì)胞（人喉癌上皮細(xì)胞胞HEP-2)標(biāo)本的固定和保存：標(biāo)本的固定和保存：固定劑：固定劑： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：保存：4、-20 二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷二、熒光抗體染色與結(jié)果判斷于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體抗體 置置25-37 30min或或4 過(guò)夜過(guò)夜 用用PBS充分洗滌充分洗滌 鏡檢。鏡檢。

7、試驗(yàn)類(lèi)型試驗(yàn)類(lèi)型 1 直接法 2 間接法 3 雙標(biāo)記法 兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色。返回?zé)晒饪贵w染色結(jié)果判斷熒光抗體染色結(jié)果判斷 設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 區(qū)分特異和非特異染色區(qū)分特異和非特異染色 陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布:胞質(zhì)型、胞核型和膜表胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型面型抗核抗體抗核抗體(均質(zhì)型均質(zhì)型)抗核抗體抗核抗體(斑點(diǎn)型斑點(diǎn)型)抗核抗體抗核抗體(核膜型核膜型) “-”：無(wú)或僅見(jiàn)極微弱熒光。無(wú)或僅見(jiàn)極微弱熒光。 “+”：熒光較弱但清楚可見(jiàn)。熒光較弱但清楚可見(jiàn)。 “+”：熒光明亮。熒光明亮。

8、“+”：耀眼強(qiáng)熒光。耀眼強(qiáng)熒光。 特異熒光強(qiáng)度特異熒光強(qiáng)度“+”以上判定為陽(yáng)性，對(duì)照以上判定為陽(yáng)性，對(duì)照光應(yīng)呈光應(yīng)呈“-”或或“”。 根據(jù)呈根據(jù)呈+的血清最高稀釋度判定特異性抗的血清最高稀釋度判定特異性抗體效價(jià)。體效價(jià)。 三、熒光顯微鏡檢查三、熒光顯微鏡檢查 利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察定性、定位、定量觀察檢測(cè)。檢測(cè)。 經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光微鏡下觀察。需要在熒光微鏡下觀察。一般要求染色后立刻鏡一般要求染色后立刻鏡檢

9、，以防熒光消褪，造檢，以防熒光消褪，造成假陰性結(jié)果。成假陰性結(jié)果。熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu) 光源：光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)舾邏汗療?、氙燈或鹵素?zé)?濾光片：濾光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片隔熱、激發(fā)和吸收濾光片 光路：光路：透射光、落射光透射光、落射光 聚光器：聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光明視野、暗視野和相差熒光聚光器器 鏡頭：鏡頭：消色差鏡頭消色差鏡頭 隔熱濾光片：隔熱濾光片：阻斷紅外線(xiàn)通過(guò)而隔熱。阻斷紅外線(xiàn)通過(guò)而隔熱。 激發(fā)濾光片：激發(fā)濾光片：位于光源和物鏡之間，能選位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過(guò)紫外線(xiàn)可見(jiàn)波長(zhǎng)擇性地透過(guò)紫外線(xiàn)可見(jiàn)波長(zhǎng) 的光域，提供的光域，提供合

10、適的激發(fā)光。合適的激發(fā)光。 吸收濾光片：吸收濾光片：位于物鏡和目鏡之間，阻斷位于物鏡和目鏡之間，阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，保護(hù)眼睛。激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，保護(hù)眼睛。返回透射熒光顯微鏡光路透射熒光顯微鏡光路(a) 落射熒光顯微鏡光路落射熒光顯微鏡光路(b) 透射光：透射光：照明光線(xiàn)從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。照明光線(xiàn)從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。 落射光：落射光：照明光線(xiàn)從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)照明光線(xiàn)從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。基本原理：基本原理：將抗原抗體反應(yīng)與熒光將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)物質(zhì)發(fā)光

11、分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。第四節(jié)第四節(jié) 熒光免疫分析熒光免疫分析熒光免疫測(cè)定的方法類(lèi)型熒光免疫測(cè)定的方法類(lèi)型 非均相熒光免疫測(cè)定：非均相熒光免疫測(cè)定： 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定、熒光酶免疫測(cè)時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定、熒光酶免疫測(cè)定定 均相熒光免疫測(cè)定：均相熒光免疫測(cè)定： 熒光偏振免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定(TR-FIA) 基本原理：基本原理：是用鑭系稀土元素螯合物（如是用鑭系稀土元素螯合物（如Eu3+）標(biāo)記抗

12、體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中的抗）標(biāo)記抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中的抗原或抗體。此螯合物具有較長(zhǎng)熒光壽命，原或抗體。此螯合物具有較長(zhǎng)熒光壽命，得用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測(cè)量時(shí)間，得用時(shí)間分辨熒光分析儀延緩測(cè)量時(shí)間，可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得可排除標(biāo)本中非特異性熒光的干擾，所得信號(hào)完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒信號(hào)完全是稀土元素螯合物發(fā)射的特異熒光。光。時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖時(shí)間分辨檢測(cè)原理示意圖 自發(fā)熒光壽命自發(fā)熒光壽命短短:1ns10ns 鑭系元素壽命鑭系元素壽命長(zhǎng)長(zhǎng):10s1000s 短壽命熒光完全衰變短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系后再測(cè)定鑭系 元素特異熒光元素特異熒光時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（

13、雙抗體夾心法）示意圖時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（雙抗體夾心法）示意圖方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用方法評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用 靈敏度高：最小檢出量靈敏度高：最小檢出量10-18mol/L 標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng)標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長(zhǎng) 測(cè)量快速，易自動(dòng)化測(cè)量快速，易自動(dòng)化 易受污染，本底增高易受污染，本底增高 因此因此,是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分是很有發(fā)展前途的超微量物質(zhì)免疫分析技術(shù)。析技術(shù)。第五節(jié)第五節(jié) 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用熒光抗體技術(shù)在臨床上可用作腫瘤細(xì)熒光抗體技術(shù)在臨床上可用作腫瘤細(xì)胞的診斷；細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢驗(yàn)及胞的診斷；細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的檢驗(yàn)及自身免疫病的協(xié)助診斷等方面。自身免疫

14、病的協(xié)助診斷等方面。一、熒光顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用二、熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用思考題思考題1 1熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是熒光、熒光效率、熒光壽命和熒光淬滅的概念是什么？什么？2 2常用的熒光物質(zhì)有哪些？常用的熒光物質(zhì)有哪些？3 3熒光免疫技術(shù)有哪些類(lèi)型？熒光免疫技術(shù)有哪些類(lèi)型？4 4熒光抗體技術(shù)的基本原理是什么？熒光抗體技術(shù)的基本原理是什么？3 3什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗什么是熒光抗體？如何制備、純化和鑒定熒光抗體？體？4 4熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應(yīng)原理是什熒光抗體染色有哪些方法？各自的反應(yīng)原理是什么？么？ 5 5熒光免疫測(cè)定的基本原理是什么？有哪些方法類(lèi)熒光

15、免疫測(cè)定的基本原理是什么？有哪些方法類(lèi)型型? ?課堂練習(xí)1、用于標(biāo)記熒光抗體的熒光素應(yīng)符合下列要求，除外A 與蛋白質(zhì)分子形成離子鍵B 熒光效率高，與蛋白結(jié)合后仍能保持較高的熒光效率C 熒光色澤與背景組織色澤對(duì)比鮮明D 與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化和免疫學(xué)性質(zhì)E 標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒（A）2、熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)中，與普通光學(xué)顯微鏡相同的是 A 光源 B 濾板 C 聚光器 D 目鏡 E 物鏡 （D）3、不能作為熒光顯微鏡光源的是 A 高壓汞燈 B 氚燈 C 紫外燈 D 氙燈 E 鹵素?zé)?（C）4、熒光抗體染色技術(shù)中，特異性最高，非特異性染色最低的方法是 A 直接法 B 間接法 C 補(bǔ)體結(jié)合法 D 雙標(biāo)記法 E 以上都不對(duì) (A)5、目前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)抗核抗體的方法是 A ELISA B 放射免疫技術(shù) C 直接凝集實(shí)驗(yàn) D 直接熒光法 E 間接熒光法 (E)6、FITC在紫外光的激發(fā)下，所產(chǎn)生的熒光為 A 灰藍(lán)色 B 黃綠色 C 橙色 D 暗紅色 E 橙紅色 （B）7、雙標(biāo)記熒光抗體技術(shù)的主要用途是 A 提高熒光強(qiáng)度 B 提高熒光效率 C 可同時(shí)檢測(cè)同一標(biāo)本中兩種抗原 D 使用一種標(biāo)記物可檢測(cè)多種抗原 E 減少非特異性熒光 （C）8、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定特點(diǎn)中不包括