組織培養(yǎng)實驗室及操作技術(shù)1-1

1、植物組織培養(yǎng)實驗室及操作技術(shù)植物組織培養(yǎng)實驗室及操作技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 實驗室設(shè)置及基本技術(shù)實驗室設(shè)置及基本技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制與滅菌培養(yǎng)基的配制與滅菌第一節(jié) 實驗室設(shè)置及基本技術(shù)一、實驗室組成二、基本設(shè)備三、培養(yǎng)器皿及實驗用具四、洗滌技術(shù)五、滅菌技術(shù)六、無菌操作 組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察一一、實驗室組成基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準(zhǔn)備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實驗室溫 室生化分析實驗室基本實驗室布局平面圖實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌

2、臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖室緩沖室無菌室無菌室培養(yǎng)室培養(yǎng)室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實驗室緩沖室培養(yǎng)室無菌室（一）無菌室（二）二、儀器與設(shè)備1、基本設(shè)備 冰箱、電爐、酸度計、純水器、天平、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計電爐天平純水器培養(yǎng)基分裝器攪拌器2、滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）3、無菌操作設(shè)備 超凈工作臺無菌接種箱4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 搖 床培養(yǎng)架HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱 150C 250D 光照培養(yǎng)箱 5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)研

3、究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質(zhì)用具鑷子 解剖刀接種針?biāo)?、洗滌技術(shù)1、玻璃器皿洗滌、玻璃器皿洗滌新購置玻新購置玻璃器皿璃器皿1%稀HCl浸漬浸漬12h洗衣粉洗衣粉洗滌洗滌清水清水沖洗沖洗晾干晾干備用備用已用過的已用過的玻璃器皿玻璃器皿2、塑料用品洗滌、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即用新的塑料器皿打開即用已用過的已用過的塑料器皿塑料器皿2%NaOH浸泡浸泡12h清水清水沖洗沖洗2%5%鹽鹽酸浸泡酸浸泡30min清水清水沖洗沖洗蒸餾水蒸餾水沖洗沖洗晾干備用晾干備用3、金屬用品洗滌、金屬用品洗滌熱洗衣粉水熱洗衣粉水洗

4、凈洗凈沖洗沖洗擦干擦干配方成分弱液次強液強液常用配方重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）501001000100200100060800200100200800清潔液配方五、滅菌技術(shù)物理方法： 物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等化學(xué)方法： 消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法、滅菌方法2、滅菌、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在9.810410.8104Pa 溫度在121 滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力溫度（）飽和蒸汽壓力溫度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00

5、.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿滅菌： 多采用高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用（5）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室接種室超凈工超凈工作臺作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射（6）外植體滅菌流水沖洗

6、流水沖洗1020min或更長時間或更長時間70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗45次次在在10%的次氯酸鈉、的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡飽和漂白粉浸泡30min左右左右備用備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度（%）去除難易消毒時間（min）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好六、無菌操作實驗員消毒實驗室、無菌臺滅菌實

7、驗器材的滅菌無菌接種消 毒實驗臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)1、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。2、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。3、開啟過濾室風(fēng)機，使無菌風(fēng)吹拂工作臺面和四周的臺壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉

8、超凈工作臺。注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二節(jié)第二節(jié) 植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境植物組織培養(yǎng)所需的環(huán)境 條件及營養(yǎng)成分條件及營養(yǎng)成分一一、所需環(huán)境條件 與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的材料的生長要受到溫度、光照、濕度等各種物理條件，不同氣體、培養(yǎng)基的組成、pH值和滲透壓等各種化學(xué)條件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個重要問題。溫度光照濕度氣體培養(yǎng)基的滲透壓pH值植物材料一般最適溫度在252之間環(huán)境條件最常用的光周期是光照16h，黑暗8h 一般情況下，

9、培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80% 氧氣是愈傷組織生長所必需的 調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手 植物組織培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5二、營養(yǎng)成分 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：a、組成各種化合物，參與機體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；b、構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；c、元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn) 定、電荷平衡等點化學(xué)方面的作用；d、發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、 器官建成。Arnon和和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的素的3個

10、標(biāo)準(zhǔn)個標(biāo)準(zhǔn)A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充改元素來預(yù)防和恢復(fù)C、改元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進而產(chǎn)生的間接效果。國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種微量營養(yǎng)元素：占干物

11、質(zhì)重量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種按照國際植物生理協(xié)會的建議： 所需濃度 0.5mmol/L的元素為大量元素 所需濃度 0.5mmol/L的元素為微量元素1、大量元素N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)

12、構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。2、微量元素 在微量元素中，鐵的使用最大 ： 一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀 硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運輸有著密切的關(guān)系 銅是某些氧化酶的成分，能夠促進離體根的生長 錳參與植物的光合、呼吸代謝 鉬參與氮素的代謝 氯是光合作用水光解的活化劑 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯

13、焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時，新梢頂端枯死。引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時，新梢頂端枯死。 桃樹桃樹缺銅癥狀：缺銅癥狀： 新梢頂端葉片的葉尖失綠新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點至擴大變成深褐色，引起落葉。擴大變成深褐色，引起落葉。 枝頂端生長不良，其下部枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的的芽開始生長，形成叢生的細(xì)枝。細(xì)枝。 菊花菊花缺錳典型癥狀：缺錳典型癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。由幼葉開始。 菜豆菜豆缺鉬典型癥狀：缺鉬典型癥狀：葉較小，葉脈間失綠葉較小

14、，葉脈間失綠,有壞有壞死斑點，且葉邊緣焦枯，死斑點，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時葉片十字花科植物缺鉬時葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。焦。 白菜白菜缺硼典型癥狀：缺硼典型癥狀： 受精不良受精不良,籽粒減少籽粒減少 ，“花而不實花而不實”， “蕾而不蕾而不花花”； 根尖、莖尖的生長點停止根尖、莖尖的生長點停止生長，而形成簇生狀；生長，而形成簇生狀； 常引起各種腐爛病。常引起各種腐爛病。 馬鈴薯馬鈴薯3、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點： 具有熱易變的性質(zhì) 利于吸收和利用 使用濃度一般在2%5% 提供能源和調(diào)

15、節(jié)滲透壓4、維生素類 以各種輔酶的形式存在 參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進作用 主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素 常用維生素有VB1和VB6 5、肌醇 環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動 促進活性物質(zhì)發(fā)揮作用6、氨基酸 蛋白質(zhì)的組成成分 有機氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用 培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸7、天然復(fù)合物 促進某些愈傷組織和器官的生長 化學(xué)成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、瓊脂 是使用最普遍的凝固劑用量一般在610g/L之間顏色以淺、透明度高好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用瓊脂糖、結(jié)冷膠

16、等。9、活性炭 吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進培養(yǎng)物生長和分化 促進生根缺點： 沒有選擇性10、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成的污染活性炭活性炭11、生長素類 促進細(xì)胞伸長和分裂 促進生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實 誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生長素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)12、細(xì)胞分裂素類 促進細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控 溶于

17、0.51.0mol/L的鹽酸或稀薄的NaOH中 常用的細(xì)胞分裂素： KT (激動素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(異戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素類和脫落酸 A、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用 加速細(xì)胞的伸長生長 促進細(xì)胞的分裂 主要是GA3 B、脫落酸 抑制細(xì)胞分裂和伸長 促進脫落和衰老 促進休眠和提高抗逆能力培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一一、培養(yǎng)基的種類第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存培養(yǎng)基的配制、滅菌與保存1、MS培養(yǎng)基 無機鹽濃度高 高含量的氮、

18、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機附加物二、幾種常見培養(yǎng)基的特點2、White培養(yǎng)基 1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計 1963年作了改良，提高MgSO4的濃度和增加硼元素 無機鹽濃度較低 使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果大量元素大量元素含量含量微量元素微量元素含含量量鐵鹽鐵鹽含量含量有機物有機物含含量量其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸煙酸0.3瓊脂瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.

19、0鹽酸硫胺鹽酸硫胺素素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡哆鹽酸吡哆辛辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO4200附表：White培養(yǎng)基3、B5培養(yǎng)基 1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計 含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分 數(shù)量(mg/l）組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 煙酸

20、 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨 10 Na2-EDTA37.3 B5培養(yǎng)基的組成和配方4、N6培養(yǎng)基 1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計 KNO3和（NH4）SO4含量高，不含鉬組成成分 數(shù)量(mg/l) 組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47