耐酸耐熱菌庫(kù)克的檢測(cè)方法

1、耐酸耐熱菌（庫(kù)克）的檢測(cè)方法1適用范圍本方法適用于清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測(cè)。2儀器和試劑2.1 恒溫水?。?0 1 Co2.2 恒溫培養(yǎng)箱：40 1 Co2.3 滅菌培養(yǎng)皿：直徑為 90mm o2.4 滅菌試管：18X 180mm。2.5 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。2.6 酵母粉。2.7 蛋白月東。2.8 瓊脂粉。2.9 葡萄糖。2.10 吐溫 80。2.11 12.5% 蘋果酸。2.12 滅菌蒸儲(chǔ)水。2.13 K氏培養(yǎng)基平板：在1000ml的三角瓶中放入 500ml蒸儲(chǔ)水，加入1.25g酵母粉、2.50g 蛋白月東、6.50g瓊脂粉、0.5g葡萄糖和0.5ml吐溫

2、80,使其溶解，輕輕蓋上三角瓶的蓋子， 在121c滅菌25分鐘；在一個(gè)小燒杯中加入10ml蒸儲(chǔ)水和1.25克的蘋果酸，攪拌直至溶解，將蘋果酸的水溶液用 0.45um的濾膜過(guò)濾，將處理過(guò)的蘋果酸水溶液加入到滅菌的K氏培養(yǎng)基中，攪拌均勻，使其 pH值達(dá)到3.70.1。當(dāng)冷卻到大約50c時(shí)，將K氏培養(yǎng)基傾注 到培養(yǎng)皿中，凝固后在 0-5C的冰箱中儲(chǔ)存，有效期 60天，并記錄配制日期。3操作步驟3.1 樣品處理3.1.1 濃縮清汁：打開水浴鍋，調(diào)整溫度到801C。以無(wú)菌操作，取10ml濃縮清汁于15ml滅菌的試管中，再移取10ml濃縮清汁于另一帶有溫度計(jì)的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管

3、的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達(dá)到801C,開始計(jì)時(shí)，維持13分鐘（用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)）。冷卻至室溫，用 90-100ml的滅菌蒸儲(chǔ)水將熱處理過(guò) 的樣品轉(zhuǎn)入滅菌容器中，搖勻。將稀釋后的樣品溶液用0.45um的濾膜真空過(guò)濾。3.1.2 清汁、水：打開水浴鍋，調(diào)整溫度到801C。以無(wú)菌操作，取 150ml清汁（或水）于已滅過(guò)菌的玻璃樣品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一帶有溫度計(jì)的玻璃樣品瓶中，作為溫度控 制用，蓋上樣品瓶的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達(dá)到801C,開始計(jì)時(shí)，維持13分鐘（用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)）。將熱處理過(guò)的樣品冷卻至室溫，用0.45um

4、的濾膜真空過(guò)濾。 3.1.3濁汁：打開水浴鍋，調(diào)整溫度到801CO以無(wú)菌操作，取20ml濁汁于已滅過(guò)菌的試管中，再移取20ml濁汁于另一帶有溫度計(jì)的20mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子。將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達(dá)到80 1C時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持 13分鐘（用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)）。冷卻至室溫，將熱處理的樣品用0.45um的濾膜真空過(guò)濾。3.2 培養(yǎng)及計(jì)數(shù)取掉過(guò)濾器的上部裝置，用滅菌的鐐子，將過(guò)濾膜從過(guò)濾器上取下放在K氏培養(yǎng)基上， 輕敲數(shù)次，以保證濾膜與培養(yǎng)基接觸。倒置于 40-41 C恒溫培養(yǎng)箱中，在恒溫培養(yǎng)箱底部放 置一個(gè)有水的盤子， 以調(diào)整恒溫培養(yǎng)箱的濕度，培養(yǎng)

5、 5天。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄該培養(yǎng)溫度下 濾膜上的菌落數(shù)。根據(jù)對(duì)樣品的污染情況，可選擇稀釋度。用滅菌吸管吸取25ml樣品，加入到225ml滅菌蒸儲(chǔ)水中，做成 1: 10的稀釋度；用滅菌吸管吸取1: 10的稀釋液25ml,加入到225ml滅菌蒸儲(chǔ)水中，做成 1: 100的稀釋度，稀釋后的樣品的檢測(cè)方法同上。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄 濾膜上的菌落數(shù)，并按相應(yīng)的稀釋度進(jìn)行計(jì)算。4數(shù)據(jù)處理結(jié)果報(bào)告10ml的濃縮清汁樣品中含有的菌落數(shù)，報(bào)告單位為cfu/10ml o結(jié)果報(bào)告150ml的清汁（或水）樣品中含有的菌落數(shù)，報(bào)告單位為cfu/150ml。結(jié)果報(bào)告20ml的濁汁樣品中含有的菌落數(shù)，報(bào)告單位為 cfu/20ml

6、。參考資料：庫(kù)克實(shí)驗(yàn)室耐熱耐酸菌的檢測(cè)方法。NDM耐酸耐熱菌檢驗(yàn)1適用范圍本方法適用于清汁、濁汁、水和濃縮果汁中的耐酸耐熱菌的檢測(cè)。2儀器和試劑1.1 恒溫水浴鍋：701C1.2 恒溫培養(yǎng)箱：45 1 Co1.3 滅菌培養(yǎng)皿：直徑為 90mm。1.4 濾膜：0.45um水系一次性濾膜。1.5 滅菌三角瓶：500ml。1.6 滅菌蒸儲(chǔ)水。1.7 YSG培養(yǎng)基的配制：A組：酵母粉（MERCK）:2.0g葡萄糖：1.0g可溶性淀粉（MERCK） :2.0g蒸儲(chǔ)水：500ml把A組用1-2N硫酸或鹽酸調(diào)至 PH為3.7 0.1;B組：瓊脂（MERCK）:15.0g蒸儲(chǔ)水：500ml把A組和B組分別在1

7、21c 15分鐘條件下滅菌，冷卻至50-60 C,把兩者混合。3 操作步驟3.1 取樣品50ml于一個(gè)無(wú)菌瓶中， 另取同樣品同體積于一個(gè)相同的瓶中做溫度控制用，在溫度控制瓶中插入溫度計(jì)。3.2 把兩個(gè)瓶都放入到 70c的水浴中。（水浴鍋中的水面應(yīng)高于瓶中的樣品）,當(dāng)溫度控制瓶中的溫度計(jì)達(dá)到 70c時(shí)，開始計(jì)時(shí)20分鐘。3.3 20分鐘后，迅速將樣品放入冰浴。3.4 將經(jīng)過(guò)熱處理的樣品加滅菌水稀釋，稀釋倍數(shù)約10倍左右。用真空泵將此樣品全部通過(guò)0.45 m的濾膜。用滅菌蒸儲(chǔ)水沖洗這個(gè)瓶子和過(guò)濾器。確信這張膜被真空抽干。將這張濾膜放到Y(jié)SG培養(yǎng)基上。為了防止氣泡，小心的使濾膜滾貼到 YSG培養(yǎng)基上

8、，并且用無(wú)菌 的鐐子輕敲濾膜，使濾膜的邊緣緊貼在培養(yǎng)基上。3.5 將此培養(yǎng)基在 45c培養(yǎng) 3-5天。3.6 計(jì)數(shù)平板上所有的菌落4 數(shù)據(jù)處理檢出的耐酸耐熱菌以 cfu/50ml報(bào)告。參考資料：日本 NDM公司耐熱耐酸菌的檢測(cè)。純品耐熱耐酸菌的檢測(cè)方法1目的檢測(cè)濃縮汁中環(huán)脂芽抱桿菌和其它的耐酸耐熱菌。這個(gè)程序含有經(jīng)過(guò)改進(jìn)的檢測(cè)方法和NFPA的建議。2原理/概述它是以這個(gè)程序描述了果汁和濃縮汁中環(huán)脂芽抱桿菌和其它的耐酸耐熱菌的檢測(cè)方法?？篃嵫勘У纳L(zhǎng)為基礎(chǔ)進(jìn)行檢測(cè)的?？篃嵫勘г谳^高溫度和酸性環(huán)境中萌發(fā)生長(zhǎng)。通過(guò)ribotyping和2-甲氧基酚（俞創(chuàng)木粉）的化學(xué)測(cè)試來(lái)檢定環(huán)脂芽抱桿菌，俞創(chuàng)木粉是

9、通過(guò)氣相色譜分析的方法（固相微提?。﹣?lái)進(jìn)行檢測(cè)。3范圍和應(yīng)用檢測(cè)濃縮汁中的環(huán)脂芽抱桿菌，從不同種類的果汁和濃縮汁中分離耐酸耐熱菌，例如橙汁、白葡萄汁、酸果蔓的果實(shí)、懸鉤子、梨和西紅柿。4儀器和化學(xué)藥品2.1 恒溫培養(yǎng)箱：431C。2.2 高壓滅菌鍋。2.3 恒溫水浴鍋：80 1 Co2.4 K氏培養(yǎng)基。2.5 25%無(wú)菌蘋果酸。2.6 滅菌吸管：1ml和10 ml。2.7 滅菌培養(yǎng)皿。2.8 無(wú)菌20 x 50mm螺旋蓋的蓋子。2.9 基的制備（酸化K氏培養(yǎng)基）酵母浸膏：2.5g蛋白月東：5.0-g瓊脂粉：15.0-g葡萄糖：1.0-g吐溫 80:1.0-ml3.1 將上述試劑加入到 990m

10、l蒸儲(chǔ)水中，溶解后混勻，煮沸，然后在 121c滅菌15分鐘。3.2 在燒杯中，將25克蘋果酸加入到100ml去離子水中，混勻。3.3 用0.20um的濾膜過(guò)濾除菌，然后將過(guò)濾液10ml加入到990ml在121c滅菌15min且冷卻到45 C 1C的培養(yǎng)基中。3.4 檢測(cè)PH,如果需要，用無(wú)菌蘋果酸或1N NaOH調(diào)整PH至U 3.70.1。3.5 也可以從International Bioproducts購(gòu)買脫水 K氏培養(yǎng)基。按照廠家的說(shuō)明，將培養(yǎng)基冷卻到48 C,用6ml的25%的過(guò)濾除菌的蘋果酸調(diào)整PH為3.7 0.1。6樣品采集用無(wú)菌容器采集樣品。采集樣品時(shí)要小心，防止交叉污染。7樣品制

11、備5.1 濃縮果汁5.1.1 將10ml樣品加入到無(wú)菌瓶中或無(wú)菌的帶有螺旋蓋的20x 50mm的試管中。5.1.2 將樣品放在80c的水浴鍋中，用一樣的試管或瓶子，合適的溫度計(jì)檢測(cè)溫度，當(dāng)樣品溫度達(dá)到80 C時(shí)開始計(jì)時(shí)10分鐘。5.1.3 確保果汁的上液位應(yīng)在水面下面。5.1.4 熱沖擊結(jié)束后，將樣品放在冷水或冰水中迅速冷卻。5.2 原汁5.2.1 取10 ml樣品加入到無(wú)菌瓶中或無(wú)菌的帶有螺旋蓋的20X 50mm的試管中。5.2.2 不進(jìn)行熱沖擊。6平板制備6.1 向每個(gè)Petri dishes平板上傾注1ml樣品，平行三份。6.2 在每個(gè)平板上傾注 23ml PH 3.7的溫度為45c 1

12、 C的K氏培養(yǎng)基。6.3 傾注時(shí)，培養(yǎng)基應(yīng)厚一些，防止在 43c變干。6.4 將培養(yǎng)基已經(jīng)凝固的平板在43 C 1C培養(yǎng)3天。為了觀察到好的菌落形態(tài)，如果必要，培養(yǎng)時(shí)間可以延長(zhǎng)1-2天，也可將平板放在袋中進(jìn)行培養(yǎng)以防止變干。8數(shù)據(jù)分析濃縮汁/原汁：對(duì)三個(gè)平行平板上的菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果以 cfu/3ml報(bào)出。9討論9.1 分離的菌落是不透明的、奶油色、微凸。在顯微鏡下，中間成桿狀，末端有芽抱。對(duì)于腐敗的微經(jīng)過(guò)熱處理的果汁，必須進(jìn)一步確認(rèn)以驗(yàn)證這種微生物時(shí)代有芽抱的。分離的菌落也可以用PH為3.5的土豆右旋葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基在43 士 1 C培養(yǎng)5天以使抱子形成。在無(wú)菌水中的懸浮抱子，也可用這種方法進(jìn)行

13、檢測(cè)。經(jīng)過(guò)熱處理存活的抱子通過(guò)酸化的K氏培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)。9.2 通過(guò)ribotyping和/或氣相色譜分析測(cè)試俞創(chuàng)木粉來(lái)鑒定環(huán)脂芽抱桿菌。9.3 用5890 series!氣相色譜和 5970型質(zhì)譜儀(Hewlett-Packard)在70電子伏特離子能量 下進(jìn)行分析。用分流和無(wú)分流注射器。9.4 最低檢測(cè)限是1.5ppb的2-甲氧基酚，在腐敗的果汁(耐酸抱子生長(zhǎng))中，2-甲氧基酚的含量等于或大于1.5ppb, 2-甲氧基酚的限量為 5.0ppb。參考資料：Evancho,G.M. and I. Walls . 2001.Aciduric flat sour sporeformers,p.

14、 245-24 。雀巢耐熱耐酸菌的檢測(cè)方法1應(yīng)用的范圍和領(lǐng)域這個(gè)方法是用來(lái)測(cè)定果汁中的TAB ,脂肪酸結(jié)合到環(huán)脂芽抱桿菌的細(xì)胞膜中，使它更能夠抵抗食品中的低酸和商業(yè)無(wú)菌食品加工中的高溫。環(huán)脂芽抱桿菌，一種革蘭氏陽(yáng)性芽抱桿菌，通常能夠在土壤中發(fā)現(xiàn)。 水果罐頭中不合適的清洗引起加工設(shè)備的污染以及最終引起 成品的污染。環(huán)脂芽抱桿菌的芽抱能夠在一些食品的低酸和商業(yè)無(wú)菌食品加工中的高溫中生存，而這個(gè)高溫是經(jīng)常用來(lái)在加工中破壞食品中的芽抱的。當(dāng)這種生物體在加工中幸存而引起不知名的危害食品事件的發(fā)生時(shí)，會(huì)給生產(chǎn)廠家?guī)?lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2原理一個(gè)果汁樣品進(jìn)行熱沖擊和用0.45叩的濾膜進(jìn)行無(wú)菌的過(guò)濾。此過(guò)濾膜貼

15、在 K氏培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)后進(jìn)行計(jì)數(shù)并用顯微鏡來(lái)檢查芽抱。3設(shè)備3.1 恒溫水浴鍋：80 1 C3.2 溫度計(jì)：0-100 C3.3 滅菌移液管：10ml。3.4 帶蓋子的滅菌試管和試管架：20 x 150 mm。3.5 培養(yǎng)箱：431C。3.6 培養(yǎng)皿：60 x 15 mm, #1007, B-D , Falcon Plastics, Oxnard , CA。3.7 0.45um 濾膜：滅菌的微孔過(guò)濾器，TYPE HA , #HAWG047S0 , Millipore Corp ,Bedford , MA 01730。3.8 塑料袋。3.9 顯微鏡，微生物載玻片，蓋玻片。3.10 滅菌

16、鐐子。4化學(xué)試劑4.1 蘋果酸。4.2 滅菌的50 ml蒸儲(chǔ)水空白。4.3 根據(jù)廠家提供的說(shuō)明書準(zhǔn)備。分裝 100 ml能整除的并且在121 C滅菌15分鐘。冷卻 到45C時(shí)，用25%的蘋果酸溶液調(diào)節(jié) 100 ml的培養(yǎng)基使pH達(dá)到3.7。在使用之前記錄 加入到每100 ml的培養(yǎng)基中的總數(shù)。 每次使用打開新的培養(yǎng)基都要檢查pH。如果此培養(yǎng)基難以買到，可以用下面的方法配制：蛋白月東5 g酵母粉2.5 g葡萄糖1.0 g吐溫801.0 g瓊脂粉15 g.把這些成分加入到 990 ml的蒸儲(chǔ)水中，加熱使其沸騰。高壓滅菌121C 15分鐘，使用之前冷卻到45 C,用25%滅菌的蘋果酸溶液調(diào)節(jié)pH達(dá)到

17、3.7。4.4 25%的蘋果酸，必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾并且在使用之前加到K氏培養(yǎng)基中。5操作步驟5.1 樣品準(zhǔn)備5.1.1 用一個(gè)10 ml的廣口吸管，以無(wú)菌操作移取15 ml樣品并且將其加到 20X 150 mm的無(wú) 菌試管中。另外再取15 ml樣品加入到另一個(gè)試管中（溫度控制用），給此試管中插入一個(gè)溫 度計(jì)。5.1.2 將兩個(gè)試管都放入到 80C的水浴中。當(dāng)溫度控制用的試管中的溫度計(jì)達(dá)到80C時(shí)，開始計(jì)時(shí)10分鐘。水浴鍋中的水面應(yīng)高于試管中的樣品。5.1.3 10分鐘后，迅速將試管放入冰浴。5.1.4 將10 ml經(jīng)過(guò)熱處理的樣品加到50 ml的滅菌水中。5.1.5 用真空泵將此60 ml全部通

18、過(guò)0.45 的濾膜。用10-20 ml的滅菌蒸儲(chǔ)水沖洗這個(gè)瓶 子和過(guò)濾器。確信這張膜被真空抽干。將這張濾膜放到K氏培養(yǎng)基上。為了防止氣泡，小心的使濾膜貼到 K氏培養(yǎng)基上，并用無(wú)菌的鐐子輕敲濾膜，使濾膜的邊緣緊貼在培養(yǎng)基上。5.1.6 用密封的容器（塑料袋）將此培養(yǎng)基在43 C培養(yǎng)3-5天。6數(shù)據(jù)處理6.1 計(jì)數(shù)平板上所有的菌落并且報(bào)告每10 ml中檢出的耐酸耐熱菌的結(jié)果。6.2 表面菌落應(yīng)該是不透明的，奶油色，輕微的凸起。6.3 用顯微鏡來(lái)檢查桿菌形成的生物體，這些芽抱輕微的膨脹在芽抱囊的頂端，接近端點(diǎn)和 中央部位。6.4 環(huán)脂芽抱桿菌形成抱子的速度很快，可能在 24小時(shí)就可以形成。7注意事項(xiàng)

19、7.1 在熱沖擊時(shí)，保證水浴鍋的水面超過(guò)試管中樣品的液面是很重要的。7.2 提到的美國(guó)雀巢的 NQA-00.4496的方法，微生物室的內(nèi)控計(jì)劃。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)該建立 自己的內(nèi)控計(jì)劃，頻率能夠適應(yīng)樣品的數(shù)目，記錄內(nèi)控計(jì)劃的結(jié)果。7.3 安全預(yù)防：已經(jīng)制定的實(shí)驗(yàn)室安全要求必須在所有時(shí)間內(nèi)遵守，包括在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的保護(hù)眼睛的措施。此方法中列出的化學(xué)藥品不是危險(xiǎn)品；但是，當(dāng)處理任何化學(xué)藥品和反應(yīng)試劑時(shí)都應(yīng)該小心。配備合適的個(gè)人防護(hù)設(shè)備。8精度8.1 再現(xiàn)性：在同樣的條件（同樣的化驗(yàn)員，同樣的儀器設(shè)備，同樣的實(shí)驗(yàn)室和短暫的時(shí)間 間隔）下，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)兩次的結(jié)果的差異不超過(guò)：CVr =5%8.2 重復(fù)能力：在不同的條件（不同的化驗(yàn)員，不同的儀器設(shè)備，不同的實(shí)驗(yàn)室和不同的時(shí) 間）下，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)兩次的結(jié)果的差異不超過(guò)：CVR = 15%定義r:repeatability 再現(xiàn)性R:Reproducibility 重復(fù)能力CVr:Coefficient of Variation of the repeatability 再現(xiàn)性變化的系數(shù)CVR:Coefficient of Variation of the Reproducibility 重復(fù)能力變化的系數(shù)見美國(guó)雀巢方法NQA-00.0100關(guān)于統(tǒng)計(jì)評(píng)