MMP2PTEN在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

1、MMP2、PTEN在骨肉瘤組織中的表達(dá)及臨床意義【摘要】 目的 探討基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP2)及張力蛋白和輔助蛋白同源、第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶(PTEN)的表達(dá)在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)40例骨肉瘤組織、20例骨軟骨瘤組織中MMP2、PTEN蛋白的表達(dá)情況，并分析兩者之間表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 MMP2在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性率為65%（26/40），而在骨軟骨瘤組織中的陽(yáng)性率為0，差異具有顯著性（2=7.253，P<0.01）。PTEN蛋白在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為55%（22/40），而在骨軟骨瘤組織中為90%（18/20），兩者相

2、比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.164，P<0.05）。在骨肉瘤組織中，MMP2和PTEN表達(dá)強(qiáng)度之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.403，P<0.05）。結(jié)論 MMP2和PTEN與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，且兩者具有相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)MMP2和PTEN的表達(dá)將對(duì)骨肉瘤的早期診斷、預(yù)后判斷有一定指導(dǎo)意義。 【關(guān)鍵詞】 骨肉瘤 明膠酶A PTEN 免疫組織化學(xué) 骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后較差。轉(zhuǎn)移是骨肉瘤病人死亡的主要原因，也是腫瘤治療中的一大難題。腫瘤細(xì)胞在侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中必須破壞由細(xì)胞基質(zhì)及基膜構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)屏障（ECM），而在參與破壞ECM的

3、酶類中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）屬于明膠酶，是一種鋅離子依賴蛋白酶，激活的MMP2在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。抑癌基因的失活是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一。張力蛋白和輔助蛋白同源、第10號(hào)染色體丟失的磷酸酶(PTEN)是1997年被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因。研究顯示，PTEN與多種腫瘤如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳癌、前列腺癌等有關(guān)，但PTEN在骨肉瘤中的作用目前僅有少量報(bào)道且認(rèn)識(shí)不一致。本研究采用免疫組化SP法對(duì)MMP2和PTEN在骨肉瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)及其相互作用進(jìn)行了初步研究。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集青島大學(xué)

4、醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科2001年1月2005年6月手術(shù)切除標(biāo)本，其中骨肉瘤標(biāo)本40例，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。40例病人中，男28例，女12例；平均年齡19.6歲（960歲）。Enneking外科分期：級(jí)8例，級(jí)21例，級(jí)11例。組織學(xué)分型：骨母細(xì)胞型16例，纖維母細(xì)胞型13例，軟骨母細(xì)胞型7例，其他類型（血管擴(kuò)張型、混合型）4例。選取同期青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔骨軟骨瘤標(biāo)本20例作為對(duì)照。標(biāo)本均經(jīng)100 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，3 m厚連續(xù)切片。 1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法。鼠抗人MMP2單克隆抗體和鼠抗人PTEN單克隆抗體以及SP試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。實(shí)驗(yàn)步驟

5、嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。石蠟切片脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)0.03的過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，正常羊血清封閉20 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，中性樹膠封固。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 1.3 結(jié)果判定 參照FROMOWITZ等級(jí)方法進(jìn)行，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞，取平均值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。按著色程度分為：基本未著為0分；著淺色為1分；中度著色為2分；強(qiáng)陽(yáng)性著色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞百分率分為：染色細(xì)胞數(shù)5%為0分；6%25%為1分；26%50%為2分；>50%為3分。將每張切片著

6、色強(qiáng)度與著色細(xì)胞百分率得分相乘，為其最后得分。其中：01分為陰性（-），23分為弱陽(yáng)性（+）；45分為中度陽(yáng)性（）；6分為強(qiáng)陽(yáng)性（）。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件包中的2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2 結(jié) 果 2.1 MMP2、PTEN在骨肉瘤、骨軟骨瘤組織中的表達(dá) MMP2陽(yáng)性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜上，為棕黃色顆粒。PTEN陽(yáng)性染色主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿，亦為棕黃色顆粒。MMP2在骨肉瘤組織中的表達(dá)率為65%（26/40），顯著高于其在骨軟骨瘤組織中的表達(dá)率（0），差異有顯著意義（2=7.253，P<0.01）。PTEN在骨肉

7、瘤組織中的表達(dá)率為55%（22/40），顯著低于其在骨軟骨瘤組織中90%（18/20）的表達(dá)率，差異具有顯著性（2=4.164，P<0.05）。 2.2 MMP2、PTEN在骨肉瘤組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 MMP2、PTEN在不同性別、年齡及病理類型的骨肉瘤組織中的表達(dá)差異無(wú)顯著性（P>0.05）。MMP2在各Enneking外科分期骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)差異有顯著性（2=6.538，P<0.05），隨著Enneking外科分期的增高，MMP2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度也呈增強(qiáng)趨勢(shì)。PTEN陽(yáng)性表達(dá)率與骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移相關(guān)（2=3.961，P<0

8、.05）。見表1。 2.3 MMP2、PTEN在骨肉瘤組織中表達(dá)相關(guān)性 MMP2與PTEN在骨肉瘤組織中的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.403，P<0.01）。見表2。表1 MMP2、PTEN在骨肉瘤組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系例表2 MMP2、PTEN在骨肉瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性（例）PTENnMMP2+-+22814-18180 3 討 論 惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞穿越ECM和基底膜這些自然屏障時(shí)，必須依賴于能降解ECM和基底膜成分的分泌1。MMPs是腫瘤細(xì)胞分泌的主要基質(zhì)降解酶之一，它能降解所有ECM成分，其中MMP

9、2在腫瘤介導(dǎo)的ECM降解中起關(guān)鍵作用2。MMP2能降解型膠原，促進(jìn)腫瘤血管形成和影響細(xì)胞間黏附作用。華成舸等3研究顯示，骨和軟組織惡性腫瘤與良性腫瘤中的MMP2表達(dá)率有顯著性差異。MMP2能切斷基底膜的支架即型膠原，破壞小血管、淋巴管的基底膜，從而引起血行和淋巴轉(zhuǎn)移。同時(shí)，MMP2降解腫瘤細(xì)胞ECM，亦造成骨肉瘤的局部浸潤(rùn)。MIYAKE等4研究顯示，表達(dá)MMP2的腫瘤細(xì)胞株穿越基底膜的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組，表明MMP2降解基底膜能力與細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，MMP2的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲程度密切相關(guān)，是腫瘤惡性進(jìn)展的標(biāo)志5。SIER等6研究結(jié)果顯示，MMP2的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移及

10、較差的預(yù)后密切相關(guān)。本研究顯示，40例骨肉瘤標(biāo)本中，MMP2陽(yáng)性率為65%，而骨軟骨瘤中MMP2的陽(yáng)性率為0，差異具有顯著性。MMP2在骨肉瘤Enneking外科分期各期中的陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異。隨著Enneking外科分期的增高，MMP2的陽(yáng)性表達(dá)程度也增高，說(shuō)明MMP2表達(dá)的增強(qiáng)有可能促進(jìn)了骨肉瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。 PTEN基因位于人類10q23，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因，能使磷酸化的酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸去磷酸化，通過(guò)去磷酸化作用而發(fā)揮抑癌功能。PTEN基因編碼的蛋白具有磷酸酯酶的特征和作用，可負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，對(duì)抗PI3K途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的生長(zhǎng)和生存信號(hào)，抑

11、制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤組織中PTEN基因突變導(dǎo)致其磷酸酶活性劇降，腫瘤細(xì)胞惡性增殖能力增強(qiáng)7。PTEN基因在不同腫瘤組織中突變率的差異可能與不同組織類型有關(guān)。劉偉等8對(duì)43例非小細(xì)胞肺癌組織和20例癌旁正常肺組織PTEN表達(dá)情況的研究顯示，PTEN在肺癌組織中的表達(dá)率為46.5%，而在癌旁組織中的表達(dá)率為95.0%，兩組間比較差異有顯著性。PTEN蛋白的表達(dá)與肺癌組織的細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及病人的預(yù)后密切相關(guān)。但在骨肉瘤中的表達(dá)情況報(bào)道較少。LEVINE等9報(bào)道，在犬的骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中都可看見PTEN蛋白表達(dá)下降。本研究結(jié)果表明，PTEN蛋白在骨肉瘤與骨軟骨瘤中陽(yáng)性表達(dá)率的差

12、異均有顯著性，提示PTEN蛋白在骨肉瘤中表達(dá)下降，從而失去對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控功能，細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。并且，PTEN還與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。 PTEN可以作為骨肉瘤預(yù)后判斷的一個(gè)指標(biāo)。 關(guān)于MMP2和PTEN相關(guān)性方面的研究，國(guó)外已有類似報(bào)道。FURUKAWA 等10研究表明,把野生型PTEN基因?qū)肽X惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中后，MMP2 mRNA水平降低，MMP2和MMP9的活性受到抑制，并且發(fā)現(xiàn)MMPs抑制劑TIMP2表達(dá)水平上調(diào)。TAO等11通過(guò)對(duì)41例胰頭癌組織和10例正常胰腺組織中的PTEN、MMP2等蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行比較，結(jié)果隨著PTEN表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)，MMP2等的標(biāo)記指

13、數(shù)亦隨著下降，差異有顯著意義，表明PTEN和MMP2之間有明顯的負(fù)相關(guān)。但二者在骨肉瘤中的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，在骨肉瘤組織中，二者具有相關(guān)性。目前，關(guān)于二者協(xié)同作用的機(jī)制仍然未完全明確，有待進(jìn)一步研究。 綜上所述，MMP2、PTEN參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中二者具有協(xié)同作用。通過(guò)往人體內(nèi)導(dǎo)入野生型PTEN降低MMP2蛋白含量，或者使用選擇性MMPs抑制劑可能會(huì)預(yù)防腫瘤發(fā)生和早期浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。深入研究MMP2和PTEN協(xié)同作用方面的機(jī)制，將會(huì)對(duì)惡性腫瘤的預(yù)防、臨床治療及病人的預(yù)后判斷有重要的影響。 【參考文獻(xiàn)】 1KLEINER D E, STETLERSTE

14、VENSON W G. Matrix metalloproteinases and metastasisJ. Cancer Chemother Pharmacol, 1999,43(1):4251. 2封國(guó)生,譚毓銓. 基質(zhì)金屬蛋白酶及型膠原在胃癌中的表達(dá)及意義J. 中華外科雜志， 2000,38(9)：775777. 3華成舸,溫玉明,王昌美,等. 骨和軟組織腫瘤中明膠酶的定位與活性分析J. 華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,31(1):8285. 4MIYAKE H, HARA I, GOHJI K, et al. Relative expression of matrix metallopr

15、oteinases2 and tissue inhibitor of metalloproteinasess in mouse renal cell carcinoma cells regulates their metastatic poteintialJ. Clin Cancer Res, 1999,5(10):28242829. 5ROYE G D, MYERS R B, BROWN D, et al. CD44 expression in dyeplastic epithetlim and squamouscell carcinoma of the esophagusJ. Int J

16、Cancer, 1996,69(4):254. 6SIER C F, KUBBERN F J, GANEAH S, et al. Tissue levels of matrix metalloproteinases MMP2 and MMP9 are related to the overall survival of patients with gastric carcinomaJ. Br J Cancer, 1996,74(3):413417. 7PENNISI E. New tumor suppressor foundtwiceJ. Science, 1997,275(5308):187

17、61878. 8劉偉,于文成,時(shí)衍同,等. PTEN在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義J. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志， 2005,20(3)：217221. 9LEVINE R A, FOREST T, SMITH C. Tumor suppressor PTEN is mutated in canine osteosarcoma cell lines and tumorsJ. Vet Pathol, 2002,39:372378. 10FURUKAWA K, KUMON Y, HARADA H, et al. PTEN gene transferr suppresses the invasive potentiall of human malignant gliomas by regulating cell invasionrelated molec