實驗三顯微鏡油鏡的使用及細菌形態(tài)觀察

1、實驗三 油鏡使用和細菌形態(tài)觀察1、顯微鏡油鏡的使用2、細菌形態(tài)的觀察（示教）（示教）3、革蘭氏染色4、芽胞染色一、實驗目的一、實驗目的n學習并掌握普通光學顯微鏡的構造和油鏡學習并掌握普通光學顯微鏡的構造和油鏡的使用技術及維護的基本知識的使用技術及維護的基本知識（一）顯微鏡油鏡的使用（一）顯微鏡油鏡的使用二、二、顯微鏡及油鏡使用原理顯微鏡及油鏡使用原理n顯微鏡的構造顯微鏡的構造 1.1.光學部分光學部分目鏡目鏡 、 物鏡物鏡 、 照明裝置照明裝置( (聚光鏡、聚光鏡、 虹彩虹彩光圈、光圈、 反光鏡等反光鏡等) )。它使。它使檢視物放大檢視物放大, ,生成物象。生成物象。2.2.機械部分機械部分:

2、 :鏡座、鏡鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺器、載物臺、載物臺轉移器、粗調節(jié)器、轉移器、粗調節(jié)器、細調節(jié)器等部件細調節(jié)器等部件. .它它起著支持、調節(jié)、起著支持、調節(jié)、 固定等作用固定等作用. .圖圖1-1-2 光學顯微鏡的成像原理光學顯微鏡的成像原理倒立的虛像倒立的虛像n顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率 1.1.放大倍數(shù)：物鏡放大倍數(shù)放大倍數(shù)：物鏡放大倍數(shù)目鏡放大倍目鏡放大倍數(shù)數(shù) 2.2. 顯微鏡的分辨率顯微鏡的分辨率: :是表示顯微鏡辨析兩是表示顯微鏡辨析兩點之間距離的能力?？捎霉奖硎緸椋狐c之間距離的能力?？捎霉奖硎緸椋?D=/2nsin(

3、/2 ) D=/2nsin(/2 ) 式中式中D D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。離。 ：可見光的波長（平均可見光的波長（平均0.550.55 m) m) n:n: 物鏡和被檢標本間介質的折射率。物鏡和被檢標本間介質的折射率。 ：鏡口角（即入射角）。鏡口角（即入射角）。D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰n油鏡使用的原理油鏡使用的原理 油鏡，即油浸接物鏡。當光線由油鏡，即油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)

4、生散射，同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的降低了視野的照明度。若中間的介質是一層油（介質是一層油（其折射率與玻片其折射率與玻片的相近的相近），則幾乎不發(fā)生折射，），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。象更加清晰。u根據(jù)公式根據(jù)公式D=/2nsin(/2 ) D=/2nsin(/2 ) ，增大分母，使得，增大分母，使得D D值減小，分辨率增大值減小，分辨率增大。1.1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件, ,以免損壞。以免損壞。2.2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度鏡面只能用擦鏡紙

5、擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.3.觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節(jié)器，以免壓接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。碎玻片或損傷鏡面。4.4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。不可傾斜拿。5.5.油鏡使用結束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油鏡使用結束后，物鏡用擦鏡紙擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第

6、三遍再用干凈的擦油；第二遍擦鏡紙蘸上二甲苯再擦鏡頭；第三遍再用干凈的擦鏡紙擦去多余的二甲苯。鏡紙擦去多余的二甲苯。6.6.顯微鏡應存放在陰涼用擦鏡紙擦干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐顯微鏡應存放在陰涼用擦鏡紙擦干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片蝕鏡片。顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項三三. .顯微鏡油鏡觀察操作方法顯微鏡油鏡觀察操作方法 在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，然后在高倍鏡或低倍鏡下找到要觀察的樣品區(qū)域后，然后將油鏡轉到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域將油鏡轉到工作位置。在待觀察的樣品區(qū)域滴加香柏滴加香柏油油，從側面注視，用粗調節(jié)器使油鏡浸在鏡油中并幾，從側面

7、注視，用粗調節(jié)器使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接。然后用細調節(jié)器調節(jié)，在目鏡下找到乎與標本相接。然后用細調節(jié)器調節(jié)，在目鏡下找到最合適的觀察點。最合適的觀察點。 p油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭油鏡使用畢后：上升鏡筒，取下載玻片，用擦鏡紙拭去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏去鏡頭上的鏡油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留的油跡，最后用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。n本實驗室按學號使用固定編號的顯微鏡，顯微鏡的保本實驗室按學號使用固定編號的顯微鏡，顯微鏡的保養(yǎng)由對應學號的

8、同學負責。實驗過程中如果所用顯微養(yǎng)由對應學號的同學負責。實驗過程中如果所用顯微鏡不能使用，自行與其他同學調節(jié)。但顯微鏡如果出鏡不能使用，自行與其他同學調節(jié)。但顯微鏡如果出現(xiàn)問題，由對應學號的同學承擔責任。現(xiàn)問題，由對應學號的同學承擔責任。一、實驗目的一、實驗目的 進一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初進一步熟悉使用油鏡觀察微生物的方法，初步認識細菌的基本形態(tài)和特殊結構特征步認識細菌的基本形態(tài)和特殊結構特征（二）細菌形態(tài)的觀察（二）細菌形態(tài)的觀察二、觀察內容二、觀察內容基本形態(tài)：桿菌，球菌基本形態(tài)：桿菌，球菌（注意大小、染色性、（注意大小、染色性、排列）排列）特殊結構：鞭毛，芽胞，莢膜特殊結構：

9、鞭毛，芽胞，莢膜（先找到菌體，（先找到菌體，再仔細觀察特殊結構）再仔細觀察特殊結構）以畫圖的方式完成該實驗的報告以畫圖的方式完成該實驗的報告桿菌（大腸桿菌，桿菌（大腸桿菌，G G- -）畫圖注意事項：畫圖注意事項：1 1、以圓圈表示視野、以圓圈表示視野 2 2、注意菌體大小比例合適、注意菌體大小比例合適 3 3、標出菌體顏色，顯示典型排列方式、標出菌體顏色，顯示典型排列方式 4 4、特殊結構標出菌體和特殊結構所在位置、特殊結構標出菌體和特殊結構所在位置（三）革蘭氏染色（三）革蘭氏染色一、實驗目的一、實驗目的學習微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術學習微生物涂片、革蘭氏染色的基本技術二、二、 革蘭氏

10、染色的工作原理革蘭氏染色的工作原理n革蘭氏染色法是細菌學中重要的鑒別染色法。有芽革蘭氏染色法是細菌學中重要的鑒別染色法。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌孢的桿菌和絕大多數(shù)球菌以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應。性的無芽孢桿菌都呈現(xiàn)陰性反應。n根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間細胞壁的結根據(jù)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌之間細胞壁的結構差異來達到染色的目的的。構差異來達到染色的目的的。n先用結晶紫初染，所有的細菌都被染成初染料的藍先用結晶紫初染，所有的細菌都被染成初染料的藍紫色；紫

11、色；n然后用碘媒染，它與結晶紫結合成結晶紫然后用碘媒染，它與結晶紫結合成結晶紫碘復合碘復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。物，從而增強了染料與細菌的結合力。n然后再用乙醇脫色處理然后再用乙醇脫色處理n由于革蘭氏陽性菌細胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結構、由于革蘭氏陽性菌細胞壁主要由肽聚糖形成網(wǎng)狀結構、壁厚、類脂質含量低，脫色時網(wǎng)孔收縮，結晶紫壁厚、類脂質含量低，脫色時網(wǎng)孔收縮，結晶紫碘碘不易被洗脫而保留在細胞內，復染時仍保持藍紫色。不易被洗脫而保留在細胞內，復染時仍保持藍紫色。n而革蘭氏陰性菌由于細胞壁的肽聚糖層較薄、類脂含而革蘭氏陰性菌由于細胞壁的肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時類脂被

12、乙醇溶解，細胞壁透量高，所以當脫色處理時類脂被乙醇溶解，細胞壁透性增大，結晶紫性增大，結晶紫碘復合物被洗脫，復染時細胞被染碘復合物被洗脫，復染時細胞被染上復染劑的顏色（紅色）。上復染劑的顏色（紅色）。大腸桿菌大腸桿菌葡萄球菌葡萄球菌三、革蘭氏染色的操作方法三、革蘭氏染色的操作方法無菌操作無菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 鏡檢鏡檢（1 1）涂片：）涂片：先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平先在載玻片上滴一滴生理鹽水，再在菌平板上取一小環(huán)培養(yǎng)板上取一小環(huán)培養(yǎng)2424小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球小時的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌體于生理鹽水中涂片（，分別于斜面上挑取少

13、許菌菌體于生理鹽水中涂片（，分別于斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開，菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜），把菌液充分涂開，使其分布均勻。使其分布均勻。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚菌不宜過多，涂片要均勻，不可過于濃厚載玻片水滴菌體涂片染色前染色前必須固定必須固定細菌，其目的是：細菌，其目的是：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上。一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上。二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原化學固定兩種

14、方法。固定時盡量維持細胞原有的形態(tài)。有的形態(tài)。 干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。干燥：把上面涂好的片于室溫下自然干燥。 涂面朝上，在火焰上方過幾次以熱固定菌體（此操涂面朝上，在火焰上方過幾次以熱固定菌體（此操作的目的是使得細胞質凝固，以固定細胞形態(tài)，并作的目的是使得細胞質凝固，以固定細胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上）。固定時通過火焰使之牢固附著在載玻片上）。固定時通過火焰1212次即可。次即可。注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改注意：不可過熱，以載玻片不燙手為宜，溫度過高會改變甚至破壞細胞形態(tài)。變甚至破壞細胞形態(tài)。 初染：滴數(shù)滴結晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌初染：滴數(shù)滴

15、結晶紫于菌膜上（以剛好完全覆蓋菌膜為宜）初染膜為宜）初染1-21-2分鐘分鐘minmin，水洗。，水洗。 媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min1min，水洗。，水洗。 脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，脫色：用濾紙吸去載玻片上面的殘水，將玻片傾斜，用用9595酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約約2030s2030s，立即用水沖凈酒精。，立即用水沖凈酒精。 注意：革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是整個操注意：革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是整個操作的關鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，作的關鍵

16、環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。復染：用番紅液染復染：用番紅液染12min,12min,水洗。水洗。鏡檢：干燥后（室溫下晾干），置油鏡觀察（先在鏡檢：干燥后（室溫下晾干），置油鏡觀察（先在低倍鏡，然后在油鏡下觀察菌體細胞的形態(tài)）。革低倍鏡，然后在油鏡下觀察菌體細胞的形態(tài)）。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。注意：以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于注意：以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。密集的細菌，常常呈假陽性。（9 9）同法在一載玻片上以大腸桿

17、菌與金黃色葡萄球菌）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比?；旌现破鞲锾m氏染色對比。 (10). (10). 實驗結果的記錄：實驗結果的記錄： 要求在用顯微鏡觀察要求在用顯微鏡觀察（左眼觀察）的同時在實驗記錄本上畫下你所觀（左眼觀察）的同時在實驗記錄本上畫下你所觀察到的細菌的形態(tài)。察到的細菌的形態(tài)。n本實驗每人做一張。本實驗每人做一張。n實驗報告中要畫圖表示結果。實驗報告中要畫圖表示結果。思考題思考題1.1.涂片為何要固定？固定加熱時間過長會怎樣涂片為何要固定？固定加熱時間過長會怎樣2.2.分析影響革蘭氏染色結果的因素。分析影響革蘭氏染色結果的因素。一、實驗目

18、的一、實驗目的熟悉芽胞染色的方法熟悉芽胞染色的方法（四）芽胞染色（四）芽胞染色二、芽胞染色的原理二、芽胞染色的原理 細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若細菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色( (芽胞呈無色芽胞呈無色透明狀透明狀) )。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染。芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色上色后又難以脫色這一特點而設計的。所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外，還需要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，要加熱，以促進芽胞著色。當染芽胞時，菌體也會著色，然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后水洗，芽胞染上的顏色難以滲出，而菌體會脫色。然后用對比度強的染料對菌體復染，使菌體和芽胞呈現(xiàn)然后用對比度強的染料對菌體復