絲氨酸對寧南霉素生物合成的影響

1、絲氨酸對寧南霉素生物合成的影響    作者：代煥梅 陳家任 胡厚芝 龍章富    【摘要】 研究寧南霉素發(fā)酵過程中如何通過加入前體來提高寧南霉素的產量，進行了添加前體種類選擇、前體加入量和加入時間對比實驗。結果表明，絲氨酸是較佳的合成前體。添加間接前體物A和B，對寧南霉素生物合成也有明顯促進作用。在發(fā)酵24、36和42h分別添加絲氨酸、前體物A和B，寧南霉素發(fā)酵效價為對照的143%、130%和141%。    【關鍵詞】 寧南霉素 絲氨酸 前體  

2、0; Effect of serine on biosynthesis of ningnanmycin    ABSTRACT In the fermentation process of ningnanmycin, the improvement of the production of ningnanmycin by adding precursors was studied. Parallel experiments such as the selecting of precursors, the amount and the diffe

3、rent adding time were investigated. Results showed that, serine was the better synthetic precursor. Addition of indirect precursors A and B could also obviously promote the biosynthesis of ningnanmycin. Serine, precursors A and B added at the 24h, 36h and 42h in the fermentation process, the ferment

4、ation titer of ningnanmycin was increased by 43%, 30% and 41% than the control, respectively.    KEY WORDS Ningnanmycin; Serine; Precursors    龍章富，lzf0028    寧南霉素(ningnanmycin)是中國科學院成都生物研究所、四川抗菌素工業(yè)研究所研發(fā)的一種高效、廣譜、低毒、低殘留、無蓄積、具有我國自主知識產權和且具有新化學結

5、構的農用抗生素，于1997年獲得中國專利權1。它能有效誘導植物產生酸性和堿性病情相關蛋白2，抑制植物病毒外殼蛋白的合成3，對許多植物病毒病的預防和治療效果均高達80%46，廣泛應用于水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯、煙草、香蕉、木瓜、西瓜、番茄、辣椒、胡椒、大白菜、油菜、蘭花等五個科，30多種植物病毒病的預防和治療。銷售推廣到除西藏、青海以外的我國各省市以及東南亞、韓國和西班牙等海外各國，被視為目前最優(yōu)良、應用最廣泛的防治植物病毒病的生物農藥之一。目前，世界各國的農藥研發(fā)已進入優(yōu)先確保對環(huán)境友好、利于人類健康為前提的新時代，因此，寧南霉素具有良好的研究和開發(fā)價值。寧南霉素對植物無藥害且對植物病毒

6、病具有很好的治療效果，因此它具有廣闊的市場前景。前期，通過對產生菌的菌種選育和發(fā)酵條件研究7，工業(yè)化生產發(fā)酵效價已達到15000g/ml。但尚未涉足發(fā)酵代謝調控研究。    在抗生素發(fā)酵過程中加入前體調控代謝提高效價已有許多報道812，在紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素、納他霉素、梅嶺霉素的發(fā)酵過程中添加前體均明顯提高了發(fā)酵效價，青霉素發(fā)酵中添加苯乙酸前體已在現代工業(yè)化生產中成功應用。    寧南霉素屬胞嘧啶核苷類抗生素，它的分子結構(Fig.1)由胞嘧啶、己糖、肌氨酸、絲氨酸等四部分組成13，這些組成單位既是糖氮代謝

7、的初級產物，又是生物合成寧南霉素的前體，因此，通過添加外源性前體物，有可能使已培養(yǎng)好的菌體直接利用現成的添加物進行生物合成，提高發(fā)酵效價。    Fig.1    Molecular structure of ningnanmycin    1 材料與方法    1.1 菌種    諾爾斯鏈霉菌西昌變種(Streptomyces noursel var. xichangensis)，經原生質體細胞

8、融合、P32處理和氮離子注入誘變篩選獲得N?12菌株，搖瓶發(fā)酵效價19884g/ml，以下試驗結果中的相對效價均以此為100%計。    1.2 培養(yǎng)基    斜面培養(yǎng)基(%) 可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，硝酸鉀1.0，花生餅粉2.0，磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，氯化鈉0.5，碳酸鈣0.5，瓊脂2.0，滅菌前pH7.27.4。    種子培養(yǎng)基(%) 玉米粉2.0，葡萄糖2.0，花生餅粉2.5，酵母粉0.15，磷酸氫二鉀0.02，硫酸鎂0.0025，硫酸銨0.2，氯化

9、鈉0.3，碳酸鈣0.5，滅菌前pH7.0。    發(fā)酵培養(yǎng)基(%) 玉米粉2.5，葡萄糖0.5，糊精3.5，花生餅粉3.5，酵母粉0.30，磷酸氫二鉀0.1，硫酸鎂0.05，氯化鈉0.3，硫酸銨0.3，碳酸鈣0.5，滅菌前pH7.0。    1.3 培養(yǎng)條件    斜面培養(yǎng)條件 28恒溫培養(yǎng)1012d。    種子瓶培養(yǎng)條件 28，裝量30ml/250ml三角瓶，搖瓶轉速200220r/min，培養(yǎng)3234h。  &

10、#160; 發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件 28，裝量30ml/250ml三角瓶，搖瓶轉速200220r/min，接種量3ml，通氣振蕩培養(yǎng)6070h。    1.4 發(fā)酵效價檢測    用微生物杯碟法測定，檢定菌為臘狀芽孢桿菌。    2 結果與分析    2.1 發(fā)酵液中己糖和氨基酸含量    在寧南霉素發(fā)酵產素高峰末期取樣，對其氨基酸種類、含量(結果見Tab.1)和己糖進行分析，己糖含量為13.0

11、80mg/ml，由此可見，在產素期末期，與寧南霉素化學結構組成部分代謝相關聯的氨基酸仍處在較高含量水平，這為添加前體物研究提供了參考信息。    2.2 己糖種類和添加時間、添加量對寧南霉素發(fā)酵的影響    斜面培養(yǎng)試驗表明，寧南霉素產生菌可以利用多種己糖作碳源，在預先的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入等量碳源，發(fā)酵62h，以普通培養(yǎng)基作對照，結果如Tab.2。從Tab.2可以看出，與酮糖相比較，醛糖是更適宜的碳源，無論是單糖或聚糖，醛糖的發(fā)酵效價比酮糖高出近二倍。而在醛糖中，己糖的發(fā)酵效價均為聚糖的1/2，糖分析表明，在產素過程

12、中，聚糖作碳源的己糖含量始終維持在15mg/ml左右，保證了寧南霉素生物合成的需要。    為進一步闡明己糖對寧南霉素合成的作用，在產素期間添加不同濃度的己糖，發(fā)酵65h，以普通培養(yǎng)基作對照，結果如Tab.3。從Tab.3看出，在產素的發(fā)酵時間添加適量的己糖，都不同程度地提高寧南霉素的發(fā)酵效價。從Tab.3的數據還可以看出，與普通培養(yǎng)基相比較，在36h前添加適量的醛糖或酮糖，均能明顯提高寧南霉素的發(fā)酵效價，其中醛糖提高26%，酮糖發(fā)酵效價提高23%。酮糖雖然不是發(fā)酵的理想碳源，但也可以作為寧南霉素生物合成的良好前體物。   

13、 2.3 氨基酸種類對生物合成的影響    寧南霉素是一種胞嘧啶核苷類抗生素，與其它胞嘧啶核苷類抗生素的最大差別，是寧南霉素的己糖C4位置上擁有絲氨酸肌氨酸二肽13，因此，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加絲?肌二肽或外源性氨基酸，都有可能促進寧南霉素產生菌的生物合成。本研究分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入絲氨酸、肌氨酸或其他A、B、C、D幾種氨基酸進行發(fā)酵試驗，以不加前體的普通培養(yǎng)基作對照，發(fā)酵65h后測定生物效價，結果如Tab.4。    從Tab.4看出，加入絲氨酸、肌氨酸和其他氨基酸A和B都能促進寧南霉素產生菌的生物合成，

14、而氨基酸C和D無此作用。    2.4 氨基酸添加時間對生物合成的影響    當發(fā)酵至24、36、42、48h時，向培養(yǎng)基中分別加入絲氨酸和氨基酸A與B，以不添加氨基酸的培養(yǎng)基作對照，發(fā)酵65h后測定寧南霉素產量，結果如Tab.5。從Tab.5可知，在48h之前添加絲氨酸，寧南霉素產量比對照有所提高，其中在3642h之間添加絲氨酸的效果較好，其它相關聯的氨基酸A與B則不同，氨基酸A在24h加入對促進生物合成效果最好，氨基酸B加入最佳時間則在48h。兩者的寧南霉素發(fā)酵效價為不添加氨基酸培養(yǎng)基的126.3%和127.1

15、%。    2.5 氨基酸添加量對寧南霉素產量的影響    在發(fā)酵42h時分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的絲氨酸和氨基酸A和B，發(fā)酵65h后杯碟法測定發(fā)酵效價，結果如Tab.6。從Tab.6的數據可知，加入適量的外源性氨基酸作為前體，較大程度地提高寧南霉素產生菌的合成，在14mmol/L的絲氨酸濃度下，寧南霉素的產量為對照的143%。根據絲氨酸、肌氨酸合成代謝可以預測，如果在發(fā)酵過程中采用加入其他促進絲氨酸、肌氨酸合成的化合物，可能會取得與添加絲氨酸、肌氨酸同樣的效果。因此，本研究設計了添加其他氨基酸A、B、C和D

16、。試驗數據表明，氨基酸A和B也有很好的促進作用。氨基酸B添加14mmol/L濃度時發(fā)酵效價為對照的141%。    3 討論    氨基己糖胞嘧啶核苷類抗生素為一類蛋白質合成抑制劑，分子結構由己糖、胞嘧啶組成基本母核，己糖C?4連接不同的側鏈結構。寧南霉素擁有絲氨酸?肌氨酸二肽側鏈，在寧南霉素發(fā)酵過程中，向其培養(yǎng)液中添加寧南霉素母核的外源性前體或添加寧南霉素側鏈的外源性前體物，都可能調控寧南霉素的代謝，促進寧南霉素產生菌的生物合成，而在大環(huán)內酯類抗生素生物合成中添加外源性合成內酯環(huán)前體物或其側鏈前體物均能促進其生物

17、合成便是成功的佐證。本實驗在寧南霉素發(fā)酵過程中添加外源性合成基本母核的己醛糖、己酮糖或添加合成基本側鏈的肌氨酸、絲氨酸，也都能促進寧南霉素生物合成。由于絲膠中含有大量絲氨酸，來源方便，因此，本文重點考察了添加絲氨酸對寧南霉素生物合成的影響。研究表明，在發(fā)酵3642h添加14mmol/L絲氨酸，發(fā)酵產量比對照提高43%。添加與其合成代謝相關聯的氨基酸A與B也能明顯促進寧南霉素的合成。但由于它們與絲氨酸合成代謝所處位置不同，作用模式完全不同14，因此，添加氨基酸A和B的時間有很大的差異。    致謝：中國科學院成都生物研究所童佳瓊同志參與大量具體工作；部分生

18、物效價測定得到四川抗菌素工業(yè)研究所方雪萍同志的協(xié)助，在此一并表示感謝。    【參考文獻】 1 Hu H Z, Xiang G X, Chen J R, et al. A new agricultu?ralantibiotic?ningnanmycin P. China patent: ZL93104287.9,1997?09?132 Liu Z, Du L F, Deng G B, et al. Induced expression of acidic pathogenesis?related proteins in tobacco by ningna

19、nmycin J. Chin J Appl Environ Biol(應用與環(huán)境生物學報),2005,11(5):5493 Qin S R, Zhang N H, Deng G B, et al. Effects of TMV or ningnanmycin treatment on protein composition in leaves and thylakoid membranes of tobacco J. Chin J Appl Environ Biol(應用與環(huán)境生物學報),2004,10(2):1584 Deng G B, Wan B, Hu H Z, et al. Biolo

20、gical activity of ningnanmycin on tobacco mosaic virus J. Chin J Appl Environ Biol(應用與環(huán)境生物學報),2004,11(6):6995 Hu H Z, Xiang G X, Chen J R, et al. Studies on application of ningnanmycin to mosaic diseases of tobacco J. Chin J Appl Environ Biol(應用與環(huán)境生物學報),1998,4(4):3906 Hu H Z, Xiang G X, Yi Y H, et a

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