第三章 細(xì)胞分離技術(shù)

1、1v第一節(jié)、細(xì)胞分離第一節(jié)、細(xì)胞分離v第二節(jié)、細(xì)胞破碎第二節(jié)、細(xì)胞破碎v第三節(jié)、胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性第三節(jié)、胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性23 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，請用生物工程學(xué)的原理和方設(shè)計(jì)試驗(yàn)，請用生物工程學(xué)的原理和方法生產(chǎn)治療糖尿病的胰島素？法生產(chǎn)治療糖尿病的胰島素？4 分離胞內(nèi)產(chǎn)物與胞外產(chǎn)物的差別是什么？分離胞內(nèi)產(chǎn)物與胞外產(chǎn)物的差別是什么？v為回收和提純胞內(nèi)產(chǎn)品為回收和提純胞內(nèi)產(chǎn)品, 必須先將它們從必須先將它們從胞內(nèi)釋放到胞外胞內(nèi)釋放到胞外, 然后進(jìn)行分離純化。然后進(jìn)行分離純化。v可以采用分泌性宿主使胞內(nèi)產(chǎn)物直接分可以采用分泌性宿主使胞內(nèi)產(chǎn)物直接分泌到胞外泌到胞外;v也可用破碎細(xì)胞的方法使其釋放出來。也可

2、用破碎細(xì)胞的方法使其釋放出來。5v細(xì)胞與液體物質(zhì)的分離又稱為固液分離，細(xì)胞與液體物質(zhì)的分離又稱為固液分離，固液分離方法包括過濾與離心沉降。固液分離方法包括過濾與離心沉降。一、過濾一、過濾 指利用多孔性介質(zhì)截流固體懸浮液中的指利用多孔性介質(zhì)截流固體懸浮液中的固體顆粒，進(jìn)行固液分離的方法。固體顆粒，進(jìn)行固液分離的方法。 過濾不但是傳統(tǒng)的化工單元，而且是過濾不但是傳統(tǒng)的化工單元，而且是目前工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細(xì)胞和不溶性物目前工業(yè)生產(chǎn)中用于分離細(xì)胞和不溶性物質(zhì)的主要方法。質(zhì)的主要方法。6過過 濾濾一般過濾：微生物、動(dòng)植物細(xì)胞一般過濾：微生物、動(dòng)植物細(xì)胞膜過濾：膜過濾：蛋白質(zhì)等物質(zhì)的選擇性分離蛋白質(zhì)等物

3、質(zhì)的選擇性分離一般過濾：以壓力差作為推動(dòng)力。一般過濾：以壓力差作為推動(dòng)力。7v沉降法沉降法：指固體顆粒在外力作用下與液體：指固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)做相對運(yùn)動(dòng)最終實(shí)現(xiàn)固液分離的技術(shù)。物質(zhì)做相對運(yùn)動(dòng)最終實(shí)現(xiàn)固液分離的技術(shù)。v沉降法根據(jù)作用外力的不同，可分為沉降法根據(jù)作用外力的不同，可分為重力重力沉降沉降和和離心沉降離心沉降。8v離心沉降是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降離心沉降是利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進(jìn)行的一項(xiàng)分離、系數(shù)或浮力密度的不同而進(jìn)行的一項(xiàng)分離、濃縮或提取條件。濃縮或提取條件。1）離心沉降的原理：）離心沉降的原理： 固體和液體之間存在一定的固體和液體之間存在一定

4、的密度差密度差，且，且固體密度大于液體的密度。固體密度大于液體的密度。2）影響離心沉降速度的）影響離心沉降速度的因素因素密度差密度差、顆粒大小顆粒大小、液體粘度液體粘度、離心力大小離心力大小9vu=d2(s) r2/18 1)密度差越大密度差越大(s)，離心沉降速度越快；，離心沉降速度越快；2)固體顆粒尺寸越大，越容易離心固體顆粒尺寸越大，越容易離心;3)液體粘度液體粘度越大，越不容易離心；越大，越不容易離心；4)離心力離心力r2的大小對固液分離影響很大。的大小對固液分離影響很大。10v3） 離心機(jī)的分類離心機(jī)的分類分離因數(shù)分離因數(shù) Fr r2g分離因數(shù)分離因數(shù) Fr 的大小分為的大小分為11

5、) Fr3000 常速離心機(jī)常速離心機(jī)12) Fr 30005 000 中速離心機(jī)中速離心機(jī)13) Fr 5000 高速離心機(jī)高速離心機(jī)14) Fr=2104106 超速離心機(jī)超速離心機(jī)11v離心分離法根據(jù)其操作方式的不同，又可分為離心分離法根據(jù)其操作方式的不同，又可分為差差速離心速離心和和密度梯度離心密度梯度離心。如果所要的蛋白質(zhì)如果所要的蛋白質(zhì)(或生物大分子或生物大分子)主要集中在某主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性的細(xì)胞質(zhì)等；性的細(xì)胞質(zhì)等；則可利用則可利用差速離心（差速離心（differential centrifugati

6、on）方法方法將它們分開收集，該細(xì)胞組分作為下步純化將它們分開收集，該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。的材料。 12優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：可以一下子除去很多雜蛋白質(zhì)，使純：可以一下子除去很多雜蛋白質(zhì)，使純化工作容易得多。化工作容易得多。 如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)如果碰上所要蛋白質(zhì)是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。 13差速離心是利用不同差速離心是利用不同離心速度離心速度產(chǎn)生產(chǎn)生不不同離心力同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分別分開。顆粒分別分開。

7、不同物質(zhì)有不同的形狀、大小、質(zhì)量不同物質(zhì)有不同的形狀、大小、質(zhì)量和密度，當(dāng)在介質(zhì)中離心時(shí)，它們的和密度，當(dāng)在介質(zhì)中離心時(shí)，它們的沉降速度沉降速度各有差異。各有差異。14大的顆粒碎片在低速時(shí)很快沉降，被大的顆粒碎片在低速時(shí)很快沉降，被分離的物質(zhì)留在上清液中分離的物質(zhì)留在上清液中; 逐步增加離心力，進(jìn)一步離心上清液，逐步增加離心力，進(jìn)一步離心上清液，使中等顆粒沉降，使中等顆粒沉降，最后是大小和密度最小的顆粒沉降。最后是大小和密度最小的顆粒沉降。1注意：每次得到的沉淀，必須經(jīng)過幾次注意：每次得到的沉淀，必須經(jīng)過幾次洗滌后，反復(fù)懸浮和離心，才能得到比洗滌后，反復(fù)懸浮和離心，才能得到比較純的部分。較純的

8、部分。 1516為了將細(xì)胞中各種組分純化分離，首先為了將細(xì)胞中各種組分純化分離，首先要在等滲緩沖液中把細(xì)胞破碎勻漿要在等滲緩沖液中把細(xì)胞破碎勻漿; ;然后用差速離心的方法，把勻漿液中的然后用差速離心的方法，把勻漿液中的各種組分分離各種組分分離; ;在離心場中，不同大小的顆粒沉向離心在離心場中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速率不同。管底部的速率不同。171當(dāng)離心力低，離心時(shí)間短時(shí)，當(dāng)離心力低，離心時(shí)間短時(shí)，細(xì)胞核細(xì)胞核即可沉到管底；即可沉到管底；1加大離心力后，又可分離出加大離心力后，又可分離出線粒體線粒體；1離心力再加大，才能分離出離心力再加大，才能分離出微粒體微粒體和和核糖體核糖體。1最后

9、幾步的超離心力，可超過地心引力的最后幾步的超離心力，可超過地心引力的10萬倍以上，萬倍以上， 懸液經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液，則是由懸液經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液，則是由細(xì)胞原生質(zhì)的可溶性部分細(xì)胞原生質(zhì)的可溶性部分和和極微小的顆粒極微小的顆粒所組成，這所組成，這些組分則需要更嚴(yán)格的離心方法才能分離出來些組分則需要更嚴(yán)格的離心方法才能分離出來 18v也稱分級區(qū)帶離心，有：也稱分級區(qū)帶離心，有：1）蔗糖密度梯度離心）蔗糖密度梯度離心2）氯化銫密度梯度離心）氯化銫密度梯度離心1用于用于RNA-DNA混合物、核蛋白體亞單混合物、核蛋白體亞單位和其他細(xì)胞成分的分離位和其他細(xì)胞成分的分離1

10、9v一般密度梯度離心法一般密度梯度離心法：把樣品鋪放在：把樣品鋪放在一個(gè)一個(gè)連續(xù)連續(xù)的液體密度梯度上，然后進(jìn)的液體密度梯度上，然后進(jìn)行離心，并控制離心分離的時(shí)間，使行離心，并控制離心分離的時(shí)間，使得粒子完全沉降之前，在液體梯度中得粒子完全沉降之前，在液體梯度中移動(dòng)而形成移動(dòng)而形成不連續(xù)不連續(xù)的分離區(qū)帶。的分離區(qū)帶。2021v等密度梯度離心法等密度梯度離心法：不同粒子存在：不同粒子存在密度密度差差時(shí)，在離心力場作用下，粒子或向下時(shí)，在離心力場作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們沉降，或向上浮起，一直移動(dòng)到與它們密度恰好相等的位置上（即密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)等密度點(diǎn)）并形

11、成區(qū)帶，此即并形成區(qū)帶，此即等密度梯度離心法等密度梯度離心法。2223v1 1）離心過濾的原理）離心過濾的原理以以離心力離心力作為推動(dòng)力完成作為推動(dòng)力完成過濾操作過濾操作, ,具有具有離心離心和和過濾過濾的雙重作用。的雙重作用。2 2）影響離心過濾速度的因素）影響離心過濾速度的因素 過濾面積和離心力過濾面積和離心力24v離心過濾機(jī)可分離固體密度大于或離心過濾機(jī)可分離固體密度大于或小于液體密度的懸浮液。小于液體密度的懸浮液。v可分為可分為: : 連續(xù)式離心機(jī)連續(xù)式離心機(jī)和和間歇式離間歇式離心機(jī)心機(jī)。25v細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎：指選用指選用物理物理，化學(xué)化學(xué)，酶酶或或機(jī)械機(jī)械的方的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)

12、胞膜。法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。26細(xì)胞壁化學(xué)組成非常復(fù)雜細(xì)胞壁化學(xué)組成非常復(fù)雜, 取決于取決于1微生物類型微生物類型1細(xì)胞的年齡細(xì)胞的年齡1細(xì)胞的生長生理學(xué)細(xì)胞的生長生理學(xué)1多糖，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上的排多糖，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上的排列方式列方式2728v破碎率：破碎率： 被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。百分?jǐn)?shù)。1）直接記數(shù)法）直接記數(shù)法2）間接記數(shù)法）間接記數(shù)法29v平板計(jì)數(shù)技術(shù)平板計(jì)數(shù)技術(shù)需時(shí)長；只有活細(xì)胞才能計(jì)數(shù)；會(huì)產(chǎn)生需時(shí)長；只有活細(xì)胞才能計(jì)數(shù)；會(huì)產(chǎn)生誤差誤差v血球細(xì)胞器上用顯微鏡計(jì)數(shù)血球細(xì)胞器上用顯微鏡計(jì)數(shù)快速而簡單，但細(xì)胞小計(jì)數(shù)困難快

13、速而簡單，但細(xì)胞小計(jì)數(shù)困難30在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。將破碎后的細(xì)胞懸液離心去掉固體（完整細(xì)將破碎后的細(xì)胞懸液離心去掉固體（完整細(xì)胞和碎片），然后對上清液進(jìn)行含量或活性胞和碎片），然后對上清液進(jìn)行含量或活性分析。分析。酶活性是破碎程度的很好指示參數(shù)。酶活性是破碎程度的很好指示參數(shù)。31破碎方法破碎方法機(jī)械法機(jī)械法非機(jī)械法非機(jī)械法固體剪固體剪切作用切作用液體剪液體剪切作用切作用珠珠磨磨法法壓壓榨榨法法高高壓壓勻勻漿漿超超聲聲破破碎碎酶酶溶溶法法化化學(xué)學(xué)法法物物理理法法32作

14、用機(jī)理：作用機(jī)理：v 微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞懸浮液懸浮液與極細(xì)的與極細(xì)的研磨研磨劑劑在攪拌漿作用下充分混勻，珠子之在攪拌漿作用下充分混勻，珠子之間及珠子與細(xì)胞之間相互間及珠子與細(xì)胞之間相互剪切剪切、碰撞碰撞，促使細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。促使細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。33影響因素：影響因素：1轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速：破碎比速度與轉(zhuǎn)盤速度成正比。：破碎比速度與轉(zhuǎn)盤速度成正比。1細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度：最佳濃度應(yīng)由實(shí)驗(yàn)確定。濃度：最佳濃度應(yīng)由實(shí)驗(yàn)確定。濃度大，產(chǎn)生的熱量大，但單位細(xì)胞重量所消耗大，產(chǎn)生的熱量大，但單位細(xì)胞重量所消耗的功率小。的功率小。1珠粒大小珠粒大?。涸谝欢ǚ秶鷥?nèi)，磨珠越小，破：在一定范圍內(nèi)，

15、磨珠越小，破碎速度越快，但也不能過小。碎速度越快，但也不能過小。341溫度溫度：將溫度控制在：將溫度控制在540對破碎物對破碎物影響較小。影響較小。1流量流量：流量大，加工單位質(zhì)量細(xì)胞消：流量大，加工單位質(zhì)量細(xì)胞消耗的能量減小，但細(xì)胞的破碎程度和蛋耗的能量減小，但細(xì)胞的破碎程度和蛋白質(zhì)的釋放量會(huì)降低。白質(zhì)的釋放量會(huì)降低。35v珠磨機(jī)是采用珠磨機(jī)是采用夾套冷卻夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫的方式實(shí)現(xiàn)溫度控制的，一般情況下能將溫度控制度控制的，一般情況下能將溫度控制在要求的范圍內(nèi)；在要求的范圍內(nèi)；v珠磨機(jī)的能耗與細(xì)胞破碎率成正比；珠磨機(jī)的能耗與細(xì)胞破碎率成正比；v高的破碎率會(huì)提高分離的成本。高的破碎率會(huì)提高

16、分離的成本。36作用機(jī)理作用機(jī)理 從高壓室壓出的細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過從高壓室壓出的細(xì)胞懸浮液，經(jīng)過閥座的中心孔道從閥座的中心孔道從閥座閥座和和閥桿閥桿之間的小之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達(dá)幾百米每秒。這環(huán)隙中噴出，速度可達(dá)幾百米每秒。這種高速噴出的懸液又射擊到靜止的種高速噴出的懸液又射擊到靜止的碰撞碰撞環(huán)環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。上，被迫改變方向從出口管流出。37v活性物質(zhì)在破碎過程中的失活問題?；钚晕镔|(zhì)在破碎過程中的失活問題。v 蛋白質(zhì)和酶的失活主要由蛋白質(zhì)和酶的失活主要由勻漿過程中產(chǎn)勻漿過程中產(chǎn)生的熱生的熱引起。如果能將溫度控制在引起。如果能將溫度控制在35C以下，以下，酶失活的損失可以忽

17、略。提高壓力有利于細(xì)酶失活的損失可以忽略。提高壓力有利于細(xì)胞破碎，但需增加能耗。胞破碎，但需增加能耗。v 機(jī)械破碎的能耗主要包括機(jī)械破碎的能耗主要包括提供動(dòng)力提供動(dòng)力消耗消耗的能量及的能量及低溫操作低溫操作消耗的能量。消耗的能量。38v作用機(jī)理作用機(jī)理 聲頻高于聲頻高于1520KHz的超聲波在高的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入可以引起強(qiáng)度聲能輸入可以引起空化現(xiàn)象空化現(xiàn)象，使氣，使氣泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。泡形成、脹大和破碎的現(xiàn)象。39此法多適用于微生物材料、細(xì)胞培養(yǎng)材此法多適用于微生物材料、細(xì)胞培養(yǎng)材料的破碎；料的破碎；因超聲波處理時(shí)產(chǎn)熱較多，故應(yīng)用此法因超聲波處理時(shí)產(chǎn)熱較多，故應(yīng)用此法時(shí)，需要采取

18、降溫措施；時(shí)，需要采取降溫措施；另外，某些核酸及酶對超聲波敏感，慎另外，某些核酸及酶對超聲波敏感，慎用此法。用此法。 40超聲波破碎過程效率的影響因素：超聲波破碎過程效率的影響因素：1聲頻聲頻1聲能聲能1處理時(shí)間處理時(shí)間1細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度1菌種類型菌種類型41v 用用化學(xué)藥品化學(xué)藥品改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含而使內(nèi)含 物有選擇地滲透出來，這種處理方式物有選擇地滲透出來，這種處理方式稱為稱為化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法。作用機(jī)理作用機(jī)理 化學(xué)滲透取決于化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑化學(xué)試劑的類型及的類型及細(xì)胞壁細(xì)胞壁和和膜膜的結(jié)構(gòu)與組成。不同試劑對各種微生物細(xì)的結(jié)構(gòu)與組成。不同

19、試劑對各種微生物細(xì)胞作用的部位和方式有所差異。胞作用的部位和方式有所差異。42v有機(jī)溶劑（苯、甲苯）有機(jī)溶劑（苯、甲苯）v表面活性劑表面活性劑有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（二烷基磺酸鈉（SDS）表面活性劑處理表面活性劑處理法使細(xì)胞膜破壞。法使細(xì)胞膜破壞。v 金屬螯合劑（金屬螯合劑（EDTA）v變性劑（鹽酸胍、脲）變性劑（鹽酸胍、脲）43v 用用生物酶生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法?；芙獾姆椒?。v 溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、

20、肽鏈內(nèi)切酶等。糖苷酶、肽鏈內(nèi)切酶等。44v作用機(jī)理作用機(jī)理 溶酶具有高度溶酶具有高度專一性專一性，蛋白酶只，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只能水解葡能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞聚糖，因此，利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的使用次序。適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的使用次序。45v酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品釋放的選擇性高產(chǎn)品釋放的選擇性高抽提的速率和收率高抽提的速率和收率高產(chǎn)品的破壞最少產(chǎn)品的破壞最少對對pH和溫度等外界條件要求低和溫度等外界條件要求低不殘留細(xì)胞碎片不殘留細(xì)胞碎片46滲透壓沖擊

21、法滲透壓沖擊法反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法1多用于動(dòng)物細(xì)胞。多用于動(dòng)物細(xì)胞。1將細(xì)胞在將細(xì)胞在-20以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 低溫玻璃化法低溫玻璃化法 指從超微結(jié)構(gòu)上損傷細(xì)胞，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜指從超微結(jié)構(gòu)上損傷細(xì)胞，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等成分遭受破壞。等成分遭受破壞。47分類分類具體方法具體方法優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法珠磨法珠磨法破碎率高，適用范圍廣，但后處理復(fù)雜破碎率高，適用范圍廣，但后處理復(fù)雜高壓均漿法高

22、壓均漿法破碎率高，可大規(guī)模操作，適用范圍小破碎率高，可大規(guī)模操作，適用范圍小超聲波破碎超聲波破碎適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模操作適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模操作物理破碎法物理破碎法凍融法凍融法操作簡便，但不適用于對冷凍敏感的細(xì)胞操作簡便，但不適用于對冷凍敏感的細(xì)胞低溫玻璃化低溫玻璃化成本高，適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)成本高，適用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模生產(chǎn)化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法加入特定化加入特定化學(xué)試劑學(xué)試劑選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但作用時(shí)間長，適用范圍小作用時(shí)間長，適用范圍小酶溶法酶溶法加入酶加入酶選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但選擇性高，細(xì)胞碎片大，后處理容易；但成本高，適用

23、范圍小成本高，適用范圍小48v多種破碎方法相結(jié)合多種破碎方法相結(jié)合v與下游過程相結(jié)合與下游過程相結(jié)合破碎過程要易于細(xì)胞碎片的除凈。破碎過程要易于細(xì)胞碎片的除凈。v與上游過程相結(jié)合與上游過程相結(jié)合培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)等培養(yǎng)基、生長期、操作參數(shù)等。49一、包含體及其形成一、包含體及其形成二、包含體的分離和溶解二、包含體的分離和溶解三、蛋白質(zhì)復(fù)性三、蛋白質(zhì)復(fù)性50 1) 包含體的概念包含體的概念 在基因在基因工程菌工程菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的重組重組蛋白蛋白，常?；ハ嘟宦?lián)在一起，形成，常?；ハ嘟宦?lián)在一起，形成不溶性的不溶性的聚積物聚積物，通常稱為，通常稱為包含體包含體。511包含體在相差顯微鏡

24、下呈現(xiàn)為許多個(gè)高度包含體在相差顯微鏡下呈現(xiàn)為許多個(gè)高度折光的折光的顆粒顆粒，含有這些包含體的大腸桿菌，含有這些包含體的大腸桿菌的菌體的菌體變大變大，并出現(xiàn)，并出現(xiàn)突起突起部分。部分。1在電鏡下，包含體是無明顯的膜存在，大在電鏡下，包含體是無明顯的膜存在，大致為致為圓形圓形，直徑可達(dá)，直徑可達(dá)1微米。微米。521存在于包含體內(nèi)的重組蛋白通常存在于包含體內(nèi)的重組蛋白通常無無生物活性，生物活性，其形成與否取決于蛋白質(zhì)的類型。其形成與否取決于蛋白質(zhì)的類型。1含有含有二硫鍵二硫鍵的真核生物蛋白質(zhì)，在原核生物的真核生物蛋白質(zhì)，在原核生物中進(jìn)行表達(dá)，常常因重組蛋白內(nèi)及分子間二中進(jìn)行表達(dá)，常常因重組蛋白內(nèi)及分

25、子間二硫鍵的錯(cuò)配，而產(chǎn)生無活性的蛋白質(zhì)，成為硫鍵的錯(cuò)配，而產(chǎn)生無活性的蛋白質(zhì)，成為不溶性的物質(zhì)。不溶性的物質(zhì)。53產(chǎn)生少量蛋白時(shí)，可溶，量過多時(shí)，產(chǎn)生少量蛋白時(shí)，可溶，量過多時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)超過其在細(xì)胞內(nèi)超過其溶解度溶解度而沉淀；而沉淀；蛋白質(zhì)合成蛋白質(zhì)合成速度太快速度太快，肽鏈來不及形，肽鏈來不及形成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間因疏水成正常的折疊構(gòu)象，導(dǎo)致分子間因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影響；作用聚合而不溶，生物活性受影響；54高表達(dá)的蛋白沒有形成高表達(dá)的蛋白沒有形成正常的二硫鍵正常的二硫鍵，或，或宿主細(xì)胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同宿主細(xì)胞內(nèi)氧化還原等條件不同而生成不同的的-S-S-；蛋

26、白的溶解需要與其他成分蛋白的溶解需要與其他成分結(jié)合結(jié)合或經(jīng)其他或經(jīng)其他成分成分誘導(dǎo)誘導(dǎo)形成適當(dāng)?shù)男纬蛇m當(dāng)?shù)目扇苄詷?gòu)象可溶性構(gòu)象，當(dāng)產(chǎn)生的，當(dāng)產(chǎn)生的蛋白量過多，所需其他成分相對不足，如折蛋白量過多，所需其他成分相對不足，如折疊酶，分子伴侶等。疊酶，分子伴侶等。55包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定包含體的形成亦與蛋白質(zhì)自身穩(wěn)定性有關(guān)。性有關(guān)。56v包含體存在于細(xì)胞質(zhì)中，其分離：包含體存在于細(xì)胞質(zhì)中，其分離：破碎細(xì)胞（如高壓勻漿，或超聲波破碎細(xì)胞（如高壓勻漿，或超聲波處理，或溶菌酶等）處理，或溶菌酶等）離心（離心（5000-20 000 r/min，15min）得到包含體沉淀得到包含體沉淀571)溶解常用試劑溶解常用試劑:尿素尿素鹽酸胍鹽酸胍去污劑去污劑SDS2)二硫鍵的還原劑二硫鍵的還原劑:二硫基蘇糖醇二硫基蘇糖醇(DTT)2-巰基已醇巰基已醇破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)破壞肽鏈之間的疏水作用破壞肽鏈之間的疏水作用使二硫鍵處于可逆斷裂狀態(tài)使二硫鍵處于可