人白蛋白重組表達(dá)的最新研究進(jìn)展-ppt

1、人血清白蛋白的酵母重組表人血清白蛋白的酵母重組表達(dá)研究進(jìn)展達(dá)研究進(jìn)展 2011.04.012011-04-011人血清白蛋白供需不平衡 監(jiān)管?chē)?yán)格 采血站數(shù)量下降 血液傳染病病毒泛濫 不再審批新的生產(chǎn)企業(yè) 進(jìn)口受到嚴(yán)格限制 需求量巨大 2011年02月12日有文章稱(chēng)血液制品血液制品“告告荒荒” 國(guó)內(nèi)血液制品的嚴(yán)重短缺。這類(lèi)產(chǎn)品，除了人血白蛋白，其他的血液制品如乙肝免疫球蛋白、靜脈丙種球蛋白等都處于嚴(yán)重短缺的狀態(tài)。 來(lái)源網(wǎng)址：鳳凰網(wǎng)財(cái)經(jīng)頻道http:/ 國(guó)內(nèi)外進(jìn)展國(guó)內(nèi)外進(jìn)展 酵母表達(dá)體系的建立酵母表達(dá)體系的建立 rHSA在畢赤酵母的表達(dá)在畢赤酵母的表達(dá) 影響酵母表達(dá)外源蛋白的因素影響酵母表達(dá)外源蛋

2、白的因素 提高提高rHSA表達(dá)的一些策略表達(dá)的一些策略 rHSA在漢遜酵母中的表達(dá)與純化在漢遜酵母中的表達(dá)與純化 新型集成干擾素新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化分泌表達(dá)和純化 rHSA 結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)分析 rHSA 的應(yīng)用展望的應(yīng)用展望2011-04-013國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 Lawn R .M. 等在1981年首次報(bào)道了重組人血白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin ,rHSA)cDNA序列和首次采用色氨酸(Trp)啟動(dòng)子，色氨酸引導(dǎo)肽及來(lái)自質(zhì)粒pBR322的Tcr和Ampr基因構(gòu)建了第一個(gè)表達(dá)重組人

3、血白蛋自的表達(dá)載體pHSAI并在大腸桿菌(E.coli)中得到了成功表達(dá)。HSA在大腸桿菌中表達(dá)量為細(xì)胞總蛋白的7%，但由于HSA含有大量的二硫鍵使得其在體外極難完成正確折疊，未能得到有生物功能的蛋白;同時(shí)細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖造成熱反應(yīng)也帶來(lái)很多麻煩。2011-04-014國(guó)外研究進(jìn)展 國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室和公司在重組白蛋白方面進(jìn)行了大量研究，如英國(guó)的DELTA公司，美國(guó)的GENETECH公司以及日本的三菱公司等。日本在重組人血白蛋白方面的研究走在了最前面。1994年日本的綠十字GREEN CROSS（三菱公司的前身)公司被批準(zhǔn)進(jìn)人二期臨床，現(xiàn)在日本三菱公司已完成三期臨床。該公司已經(jīng)建廠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，

4、一期工程完畢可達(dá)12.5噸/年的生產(chǎn)能力，并計(jì)劃逐步提高到40噸/年，已預(yù)定商品名“Albrec”,所生產(chǎn)的產(chǎn)品純度可達(dá)99.999999%,英DELTA公司已經(jīng)完成一期臨床試驗(yàn)，美國(guó)等正處于臨床前研究階段。2011-04-015國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展 近幾年來(lái)，我國(guó)也掀起了重組HSA的研究熱潮，華北制藥集團(tuán)、中科院上海生化所、華東理工大學(xué)、中山醫(yī)科大學(xué)、中科院微生物所、過(guò)程工程研究所，以及安徽中科大亞杰科技股份有限公司等單位己經(jīng)開(kāi)始利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)白蛋白的研究;目前我國(guó)在這方面的研究工作已經(jīng)取得一定進(jìn)展。 華東理工大學(xué)郭美錦，儲(chǔ)炬等于2000年發(fā)表文章稱(chēng)該校生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用 P

5、ichia pastoris 進(jìn)行了高密度高表達(dá)發(fā)酵研究,表達(dá)水平已達(dá)到5 克/ 升左右。2011-04-016來(lái)源網(wǎng)址：http:/ 華北制藥：華北制藥： 藥用基因工程重組人血白蛋白研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目藥用基因工程重組人血白蛋白研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目 華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司從1997年開(kāi)始采用畢赤酵母作為宿主菌分泌表達(dá)重組人血白蛋（rHSA ）。經(jīng)過(guò)多年的努力，通過(guò)與國(guó)內(nèi)外有關(guān)單位協(xié)作，已建立了從菌種構(gòu)建至發(fā)酵、純化的完整工藝。已得到穩(wěn)定高效表達(dá)人血白蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株完成了中試研究，開(kāi)發(fā)了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的純化工藝路線(xiàn)。制定了重組人血白蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案，中試規(guī)模制備的樣品各項(xiàng)指標(biāo)

6、檢定合格。 本項(xiàng)目?jī)?nèi)容為按照現(xiàn)行CMP 要求開(kāi)發(fā)規(guī)模生產(chǎn)藝建設(shè)藥用重組白蛋白生產(chǎn)基地，年生產(chǎn)規(guī)模達(dá)到噸級(jí)。市場(chǎng)分析，白蛋白總銷(xiāo)售量為120-150噸左右。 2011-04-017外界傳聞：華北制藥：馬上要公告獲得人造白蛋白華北制藥：馬上要公告獲得人造白蛋白。 事實(shí)上有消息源確認(rèn)重組人血白蛋白馬上投產(chǎn)就等批文事實(shí)上有消息源確認(rèn)重組人血白蛋白馬上投產(chǎn)就等批文 可以理解為一旦批文下發(fā)，馬上投產(chǎn) 市場(chǎng)價(jià)人造白蛋白市場(chǎng)價(jià)人造白蛋白10克克500塊塊 公司設(shè)計(jì)產(chǎn)能公司設(shè)計(jì)產(chǎn)能15噸噸 15噸產(chǎn)能，預(yù)計(jì) 2010 年底建成，2011 年初投產(chǎn) 新聞： 2011中國(guó)人血白蛋白制品360產(chǎn)業(yè)論壇 時(shí)間： 201

7、1-3-18 至 2011-3-19 地點(diǎn)：上海和頤酒店 主辦單位： 世易傳媒 2011-04-018基因重組人血白蛋白與華北制藥基因重組人血白蛋白與華北制藥王平王平 華北制藥股份有限公司董事長(zhǎng)華北制藥股份有限公司董事長(zhǎng) 關(guān)于產(chǎn)品簡(jiǎn)介：重組人血白蛋白未來(lái)將成為重磅產(chǎn)品 同人血白蛋白相比，重組人血白蛋白不僅純度更高，而且可以有效地避免人血白蛋白攜帶病毒的風(fēng)險(xiǎn)，另外還可以解決血源供應(yīng)的周期性等問(wèn)題。因此，重組人血白蛋白實(shí)現(xiàn)大規(guī)模量產(chǎn)在血液制品行業(yè)將具有革命意義。 受益于國(guó)內(nèi)血制品行業(yè)的高景氣度，該產(chǎn)品的市場(chǎng)潛力巨大。人血白蛋白市場(chǎng)供應(yīng)缺口較大，并且這種局面不會(huì)在短時(shí)間改善?；蛑亟M人血白蛋白是人血

8、白蛋白的替代產(chǎn)品。至今，在國(guó)際上掌握重組至今，在國(guó)際上掌握重組白蛋白的廠商也只有三家，日本綠十字、英國(guó)白蛋白的廠商也只有三家，日本綠十字、英國(guó) Delta 公司和美國(guó)的默公司和美國(guó)的默克。克。國(guó)內(nèi)除華北制藥外尚無(wú)單位能規(guī)?；a(chǎn)重組白蛋白項(xiàng)目。華北華北制藥外尚無(wú)單位能規(guī)?；a(chǎn)重組白蛋白項(xiàng)目。華北制藥除培養(yǎng)基級(jí)白蛋白外還掌握了更高級(jí)別的白蛋白技術(shù)，白蛋白產(chǎn)制藥除培養(yǎng)基級(jí)白蛋白外還掌握了更高級(jí)別的白蛋白技術(shù)，白蛋白產(chǎn)品純化技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際上先進(jìn)水平。品純化技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際上先進(jìn)水平。2011-04-019rHSA 表達(dá)體系的建立 隨著基因重組技術(shù)所表達(dá)蛋白的復(fù)雜性越來(lái)越高，酵母作為真核生物具有能

9、對(duì)所表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)逐漸取代大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白。在HSA的重組研究過(guò)程中，人們分別采用了釀酒酵母、漢遜醉母、裂殖酵母、克魯維氏酵母、畢赤酵母等作為宿主細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物來(lái)分泌表達(dá)重組人血白蛋白。2011-04-0110人重組白蛋白不同表達(dá)體系的對(duì)比技術(shù)可行性表達(dá)量提取、純化安全性活性細(xì)菌可行毫克級(jí)難度高，后修飾困難-低酵母可行克級(jí)。國(guó)外有報(bào)道，達(dá)到5g/L,7g/L難度小。外分泌，可完成信號(hào)肽切除高高動(dòng)物技術(shù)不成熟，實(shí)驗(yàn)室階段高容易安全高植物可行，在馬鈴薯有成功表達(dá)，不成熟-2011-04-0111酵母表達(dá)體系的建立 畢赤酵母由于分泌蛋白量高、表達(dá)

10、穩(wěn)定，且70年代人們?cè)鴱V泛使用畢赤酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，已基本掌握其生長(zhǎng)規(guī)律及大規(guī)模高密度發(fā)酵技術(shù)，采用甲醇誘導(dǎo)強(qiáng)啟動(dòng)子AOX，起始轉(zhuǎn)錄人血白蛋白，將表達(dá)質(zhì)粒整合到Pichia pastoris的基因組染色體上，表達(dá)質(zhì)粒不會(huì)因酵母?jìng)鞔鴣G失，可穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物，且表達(dá)量高，用甲醇誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)率可占分泌總蛋白的80%以上。這非常有利于產(chǎn)物的提取。2011-04-0112酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中常用載體2011-04-0113不同酵母表達(dá)體系比較 釀酒酵母 畢赤酵母 漢遜酵母2011-04-0114rHSA 常用表達(dá)系統(tǒng)中的比較-12011-04-0115rHSA 在不同表達(dá)系統(tǒng)中的比較-22011-04

11、-0116 目前除英國(guó) DETLA 公司采用釀酒酵母作為宿主表達(dá) rHSA 以外，其他公司和單位普遍采用畢赤酵母作為 rHSA 的表達(dá)宿主。2011-04-0117畢赤酵母表達(dá)重組人血清白蛋白 表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 信號(hào)序列選擇很多異源蛋白分泌表達(dá)時(shí)已具有成熟蛋白正確的 N 端氨基酸序列,且大部分分泌表達(dá)的異源蛋白是以它們自己同源信號(hào)序列引導(dǎo)的,分泌表達(dá)rHSA 亦可以采用其自身的信號(hào)肽序列,即 HSA 引導(dǎo)肽序列。rHSA 的分泌也可用酵母宿主菌本身的同源信號(hào)序列，如來(lái)自 Pichia pastoris 的 PHO5 引導(dǎo)序列和來(lái)自 S . cerevisiae 的-雜交因子(AMF)引導(dǎo)序列。 基

12、因劑量表達(dá)載體單元插入到宿主菌表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可采用質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化到宿主菌細(xì)胞中呈附加體型載體( Episomal vector) 存在,也可通過(guò)線(xiàn)型特異位點(diǎn)整合到酵母菌的染色體上。當(dāng)外源基因表達(dá)單元呈整合型( Integrative type) 存在于染色體上時(shí),因隨染色體的復(fù)制而復(fù)制,遺傳極其穩(wěn)定。2011-04-0118畢赤酵母表達(dá)重組人血清白蛋白 rHSA 的發(fā)酵過(guò)程包括二個(gè)階段, 以甘油為碳源積累生物量的生長(zhǎng)期和以甲醇為碳源的rHSA 誘導(dǎo)表達(dá)期。 甲醇的流加速率控制在培養(yǎng)基中的濃度小于1 % , 一般誘導(dǎo)表達(dá)150300h 左右。整個(gè)過(guò)程的pH 控制在610 左右, 溶氧控制在10 %以

13、上。 在兩段法的發(fā)酵條件優(yōu)化方面, 發(fā)現(xiàn)將甘油和甲醇混合流加可提高rHSA 產(chǎn)量, 也就是誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)首先流加甲醇, 在確保醇氧化酶被誘導(dǎo)后, 開(kāi)始混合流加。混合流加時(shí)嚴(yán)格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率, 使發(fā)酵液中甘油不積累, 同時(shí)甲醇濃度不超過(guò)0.5 %。2011-04-0119影響酵母表達(dá)外源蛋白的因素 外源基因特性外源基因特性 主要涉及外源基因 mRNA 5端非翻譯區(qū)、A + T 組成和密碼子的使用頻率 外源基因拷貝數(shù)和穩(wěn)定性外源基因拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 釀酒酵母和一些其他的酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒是建成高拷貝表達(dá)載體基礎(chǔ)?？寺∥稽c(diǎn)影響外源基因表達(dá)的高效穩(wěn)定。 一般情況下,畢赤甲醇酵母中外源基

14、因整合的拷貝數(shù)愈高,則蛋白表達(dá)量愈大。2011-04-0120影響酵母表達(dá)外源蛋白的因素 表達(dá)條件的優(yōu)化表達(dá)條件的優(yōu)化 表達(dá)條件的優(yōu)化主要包括通氣量、培養(yǎng)基、搖菌密度、蛋白酶、誘導(dǎo)劑的含量等。 充足的通氣量對(duì)于誘導(dǎo)階段外源蛋白的表達(dá)是極其重要的。 有報(bào)道認(rèn)為, 如果用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng), 外源蛋白的表達(dá)水平要比普通搖瓶發(fā)酵高出10 100 倍。 通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的p H 值,在培養(yǎng)基中添加1 %酪氨酸蛋白水解物等措施來(lái)抑制蛋白酶活性,使降解程度減至最低。此外選用蛋白酶缺陷的受體菌是減弱蛋白酶作用的有效方法 誘導(dǎo)期間培養(yǎng)基中定期補(bǔ)充誘導(dǎo)劑,對(duì)于誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白十分重要。如對(duì)于畢赤甲醇酵母誘導(dǎo)期間培養(yǎng)基

15、中每天應(yīng)補(bǔ)加甲醇,以彌補(bǔ)甲醇的消耗和蒸發(fā)。 誘導(dǎo)時(shí)間也是影響外源蛋白表達(dá)量的重要因素, 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短表達(dá)量低, 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則外源蛋白降解增加2011-04-0121提高表達(dá)的一些策略 啟動(dòng)子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個(gè)組成型三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子PGAG ,在它的控制下- LabZ 基因表達(dá)率比甲醇誘導(dǎo)下PAOX1 驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)量更高,由于該組成型啟動(dòng)子不需要甲醇誘導(dǎo),發(fā)酵工藝更簡(jiǎn)單,同時(shí)其產(chǎn)量更高,所以成為代替PAOX1最有潛力的啟動(dòng)子。 整合位點(diǎn)：酵母核糖體RNA 的基因rDNA 在染色體中具有100200 個(gè)重復(fù),是提高外源基因拷貝數(shù)的最佳整合位點(diǎn)之一。 宿主菌選擇：根據(jù)利用甲醇

16、的能力不同, 巴斯德畢赤酵母菌分為Mut+ 、Muts 和Mut- 3種表型。蛋白酶缺失的宿主菌可減少表達(dá)蛋白的酶解消化, 有利于外源蛋白的穩(wěn)定。 信號(hào)肽修飾：信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的改變(如突變、修飾、融合等) 可能會(huì)提高分泌效率。有研究發(fā)現(xiàn)，改造了的信號(hào)肽大大提高了外源蛋白表達(dá)量。2011-04-0122降解控制 改造P. pastoris 表達(dá)宿主菌株, 缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因, 使目的基因穩(wěn)定。 在培養(yǎng)液中補(bǔ)加一些富含氨基酸的組分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物, 或在培養(yǎng)基中加入YP (酵母提取物+ 蛋白胨) , 提供給酵母細(xì)胞蛋白酶過(guò)量的底物, 以減少目的蛋白的降解 加入蛋白酶抑制劑 畢

17、赤酵母在非緩沖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表達(dá), 將pH 降到3 或更低, 使得許多中性pH 蛋白酶失活 共表達(dá)蛋白酶抑制物來(lái)抑制蛋白酶活性, 減少目的蛋白降解 將目的蛋白連上一個(gè)過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)使其被分揀轉(zhuǎn)運(yùn)入過(guò)氧化物酶體貯存起來(lái), 免受蛋白酶降解, 還可減少對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用2011-04-0123重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)與純化 漢遜酵母同巴斯德畢赤酵母一樣均是甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，有相似的特性 二者啟動(dòng)子類(lèi)型、外源基因整合方式、甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控機(jī)制、篩選標(biāo)記等方面存在差異 漢遜酵母重組菌遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、表達(dá)量和分泌效率高、適合于大規(guī)模發(fā)酵，是當(dāng)前國(guó)際上公認(rèn)的最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)

18、之一 國(guó)內(nèi)大連漢信生物制藥生產(chǎn)的漢遜酵母重組乙肝疫苗自2004年投放市場(chǎng)由于其更高的抗體水平、更高的陽(yáng)轉(zhuǎn)率、更高的母嬰阻斷率而備受市場(chǎng)青睞2011-04-0124重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)與純化2006年，大連漢信生物制藥有限公司與大連理工大學(xué)合作開(kāi)發(fā)研究年，大連漢信生物制藥有限公司與大連理工大學(xué)合作開(kāi)發(fā)研究 試驗(yàn)方法：試驗(yàn)方法： 優(yōu)化HSA編碼基因密碼子 選用畢赤酵母最偏愛(ài)或次偏愛(ài)的密碼子對(duì)HAS基因密碼序列進(jìn)行優(yōu)化 構(gòu)建rHSA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母細(xì)胞 篩選重組表達(dá)株 液培，誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blotting分析得到相對(duì)高表達(dá)的菌株 20

19、11-04-0125重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)與純化 發(fā)酵 分離純化 Streamline SP 離子交換層析、Phenyl Sepharose HP疏水層析、DEAE Sepharose CL-6B 陰離子交換層析 抗原性分析ELISA、免疫雙擴(kuò)散測(cè)定2011-04-0126實(shí)驗(yàn)結(jié)果 證實(shí) rHSA 在漢遜酵母中可得到高效表達(dá)，在搖瓶培養(yǎng)條件下表達(dá)量可占外泌蛋白的80%以上。 重組菌經(jīng)高密度發(fā)酵，其表達(dá)量可達(dá)到1.033g/L，由發(fā)酵時(shí)間與rHSA濃度關(guān)系曲線(xiàn)分析：影響產(chǎn)量和產(chǎn)率的主要因素為蛋白酶的降解作用，降低蛋白酶的降解作用進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化后 rHSA 表達(dá)量會(huì)有大幅度提升，可以

20、進(jìn)行工藝放大研究。 分離純化手段有待提高2011-04-0127人血清白蛋白融合技術(shù)研制長(zhǎng)效蛋白藥物 蛋白融合技術(shù)，是通過(guò)基因重組手段將蛋白質(zhì)藥物基因與特定的載體蛋白基因融合，由同一調(diào)控元件控制基因表達(dá)產(chǎn)物，目前使用最多的蛋白載體是和抗體片段。 干擾素是一類(lèi)重要的家族性細(xì)胞因子，具有抵抗病毒感染，抑制腫瘤生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。但是干擾素分子量大約19kDa，易被腎小球?yàn)V過(guò)，血漿半衰期短而治療周期長(zhǎng)，需要頻繁注射給藥，患者依從性較低。 中國(guó)藥科大學(xué)田碩、姚文兵等報(bào)道利用白蛋白融合技術(shù)構(gòu)建了能夠分泌表達(dá)與高活性新型干擾素（）的融合蛋白的巴斯德畢赤酵母工程菌株，獲得了高純度的長(zhǎng)效新型干擾素分

21、子。 新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化2010-中國(guó)生物工程雜志2011-04-0128新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化 基本步驟： 全基因合成質(zhì)粒：pBluscript KS（+）-NFIN-HSA 合成質(zhì)粒與畢赤酵母表達(dá)載體體 pPIC3.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母、陽(yáng)性克隆篩選 重組畢赤酵母的PCR鑒定 重組子的誘導(dǎo)表達(dá) HSA-NIFN的純化 Western blot 鑒定重組蛋白 質(zhì)譜和氨基酸序列分析 融合蛋白體 HAS-NIFN 外抗病毒活性測(cè)定2011-04-0129“新型集成干擾素-人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化”應(yīng)用的一部分策略 根據(jù)已報(bào)道的基因序列及巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因的偏愛(ài)密碼子，設(shè)計(jì)了編碼 HSA-NIF