課程論文基于LDHs的膽堿電流型酶生物傳感器

1、存檔日期： 存檔編號(hào): Xxxx大學(xué)研究生課程論文課程名稱： 酶學(xué)與生物催化 課程代號(hào)： Bio520 任課教師： xxxxxxx 完成日期： 2015年 5 月15日 專 業(yè)： xxxxxxxxxxxxxxx 學(xué) 號(hào)： 2014051073 姓 名： xxxxx x x 成 績(jī)： 目錄摘要1（一） 文獻(xiàn)綜述21、 生物傳感器21.1 生物傳感器的概念21.2 生物傳感器的原理21.3 生物傳感器的分類1432、 酶生物傳感器32.1 酶生物傳感器的分類32.2 酶的固定化方法62.3 酶的固定化材料63、 無(wú)機(jī)/有機(jī)納米復(fù)合材料73.1 水滑石73.2血紅蛋白的結(jié)構(gòu)9（二） 課題目標(biāo)、研究?jī)?nèi)

2、容以及難點(diǎn)、創(chuàng)新點(diǎn)分析131選題的立論、目的和意義132研究?jī)?nèi)容：133研究方案134本課題難點(diǎn)分析135創(chuàng)新之處14參考文獻(xiàn)15致謝17摘要 本文從傳感器的發(fā)展出發(fā)，簡(jiǎn)要介紹了生物傳感器的歷史、現(xiàn)狀及未來(lái)；水滑石作為電化學(xué)應(yīng)用中具有發(fā)展前景的一種新型材料在酶固定化中的應(yīng)用以及氨基酸序列相關(guān)結(jié)構(gòu)。主要研究一種基于LDHs的膽堿電流型酶生物傳感器。帶負(fù)電荷的生物酶通過(guò)靜電作用有效地固定在帶正電荷的LDHs層板間。以期獲得滲透性能好、靈敏度高以及操作簡(jiǎn)便的新型生物傳感器。關(guān)鍵詞：生物傳感器，酶固定化，水滑石，靈敏度基于LDHs的膽堿電流型酶生物傳感器（一） 文獻(xiàn)綜述生物傳感器1是在化學(xué)傳感器的基礎(chǔ)

3、上發(fā)展起來(lái)的，是現(xiàn)代生物技術(shù)與微電子學(xué)、化學(xué)等多學(xué)科交叉結(jié)合的產(chǎn)物。它與傳統(tǒng)的化學(xué)傳感器和離線分析技術(shù)(HPLC或質(zhì)譜)相比，具有方便、省時(shí)、選擇性高、精度高、分析速度快、操作簡(jiǎn)易、儀器價(jià)格低廉、便于計(jì)算機(jī)收集和數(shù)據(jù)處理，又不會(huì)或很少損傷樣品和造成污染等優(yōu)點(diǎn)，而且可以進(jìn)行在線甚至活體分析。目前，生物傳感器已經(jīng)成功應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷2-4、食品工業(yè)5-8、環(huán)境檢測(cè)9,10、國(guó)防軍事11及人類衛(wèi)生保健12等諸多領(lǐng)域。1、 生物傳感器1.1 生物傳感器的概念生物傳感器是一種精致的分析器件，它結(jié)合一種生物的或生物衍生的敏感元件與一只理化換能器，能夠產(chǎn)生間斷或連續(xù)的數(shù)字信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度與被分析物成比例13。1

4、.2 生物傳感器的原理生物傳感器一般有兩個(gè)組成部分：一部分是分子識(shí)別元件(感受器)，由生物活性物質(zhì)構(gòu)成，直接和待檢測(cè)物質(zhì)接觸，具有分子識(shí)別能力，有的還能夠放大反應(yīng)信號(hào)。另一部分是信號(hào)轉(zhuǎn)換器(換能器)，主要是電化學(xué)或光學(xué)檢測(cè)元件。它可以將生物識(shí)別事件轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的信號(hào)。當(dāng)待測(cè)物與分子識(shí)別元件特異性地結(jié)合后，所產(chǎn)生的復(fù)合物(或光、熱等)通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?hào)、光信號(hào)等，從而達(dá)到分析監(jiān)測(cè)的目的。生物傳感器的原理可用下圖1.1來(lái)表示。圖1.1 生物傳感器的原理示意圖1.3 生物傳感器的分類14由于生物傳感器的種類繁多，分類方法也多種多樣，一般有兩種分類法，即分子識(shí)別元件分類法和器件分類法

5、：根據(jù)分子識(shí)別元件的不同可分為酶?jìng)鞲衅?、免疫傳感器、酶免疫傳感器、組織傳感器、細(xì)胞器傳感器、核酸傳感器、微生物傳感器、分子印跡傳感器等。其中前分子印跡分子識(shí)別元件屬于生物衍生物。器件分類法是根據(jù)所用換能器不同對(duì)生物傳感器進(jìn)行分類，主要包括電化學(xué)生物傳感器、生物電極、光生物傳感器、熱生物傳感器、半導(dǎo)體生物傳感器、電導(dǎo)/阻抗生物傳感器、聲波生物傳感器、微懸臂生物傳感器。2、 酶生物傳感器1962年Clark和Lyon兩人提出酶電極的觀念，從而把酶催化反應(yīng)的高度專一性和電極響應(yīng)的高度靈敏性結(jié)合起來(lái)15。酶作為分子識(shí)別器件的電化學(xué)生物傳感器成為酶?jìng)鞲衅鳌Ｃ競(jìng)鞲衅魇怯幸粋€(gè)固定化的酶敏感膜和與之密切結(jié)合的

6、電極組成的換能系統(tǒng)，它把固化酶和電極結(jié)合在一起，因而具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：()它既有不溶性酶體系的的優(yōu)點(diǎn)，又具有電化學(xué)系統(tǒng)的高靈敏性；()由于酶的專屬反應(yīng)性，使其具有很高的選擇性，能夠直接在復(fù)雜試樣中進(jìn)行測(cè)定。因此，酶?jìng)鞲衅髟谏飩鞲蓄I(lǐng)域中占有非常重要的地位。2.1 酶生物傳感器的分類在工作電極的頂端緊貼一層酶膜就構(gòu)成了一支酶?jìng)鞲衅?。工作電極包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等。當(dāng)酶?jìng)鞲衅鹘氡粶y(cè)溶液后，溶液中的待測(cè)物質(zhì)通過(guò)擴(kuò)散浸入酶膜，發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生或消耗一種電活性物質(zhì)，這種物質(zhì)與待測(cè)物質(zhì)之間有嚴(yán)格的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。電活性物質(zhì)的產(chǎn)生或消耗量可以通過(guò)點(diǎn)位或電流模式進(jìn)行檢測(cè)。因此，酶?jìng)鞲衅骺煞?/p>

7、為電勢(shì)型和電流型兩類。電勢(shì)型酶?jìng)鞲衅魇菍⒚复俜磻?yīng)所引起的物質(zhì)量的變化轉(zhuǎn)化成電勢(shì)信號(hào)輸出，電勢(shì)信號(hào)大小與底物濃度的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。所用的基礎(chǔ)電極主要有pH電極、氨氣敏電極、CO2電極、離子選擇性電極或場(chǎng)效應(yīng)管等，基礎(chǔ)電極能影響酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)時(shí)間、檢測(cè)下線等性能。同時(shí)固定酶的膜層厚度、致密性、孔徑大小、電荷、親水性、甚至形貌等對(duì)酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)、穩(wěn)定性、壽命也密切相關(guān)。電勢(shì)型酶?jìng)鞲衅鞯氖褂梅秶粌H取決于底物的溶解度，更重要的取決于基礎(chǔ)電極的檢測(cè)限，一般為10-5-10-2molL-116。電流型酶?jìng)鞲衅魇侵该复俜磻?yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)在電極上發(fā)生氧化或還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流信號(hào)，在一定條件下，與被測(cè)物濃度呈線性

8、關(guān)系。其基礎(chǔ)電極主要采用氧電極、過(guò)氧化氫電極、金屬電極、炭、碳材料電極等。它的發(fā)展主要包括三個(gè)階段。第一代酶?jìng)鞲衅鞑捎锰烊唤轶w氧的催化機(jī)理設(shè)計(jì)制作；第二代酶?jìng)鞲衅魇菍⒅T如二茂鐵、鐵氰化鉀等物質(zhì)作為媒介體摻入酶層中，以減少溶解氧的干擾；第三代酶?jìng)鞲衅魇侵冈跓o(wú)介體存在下，利用生物活性酶與電極間的直接電子傳遞制作的生物傳感器17。1).第一代經(jīng)典電化學(xué)生物傳感器 1962年，在紐約科學(xué)院學(xué)術(shù)會(huì)議上，Leland C.Clark Jnr 教授首次描述了酶?jìng)鞲衅鳎?967年Updike和Hicks制成了第一個(gè)葡萄糖酶電極生物傳感器，它標(biāo)志著第一代生物傳感器的誕生，從理論和實(shí)踐上為生物傳感器的發(fā)展奠定了基

9、礎(chǔ)。隨后研究者先后嘗試了聚乙烯碳酸酯膜和多孔膜包埋法14、重氮化法18、牛血清蛋白-多聚甲醛膜法、牛血清蛋白-戊二醛交聯(lián)法19等技術(shù)方法，取得了良好的效果，酶活力回收和穩(wěn)定性都達(dá)到實(shí)用化要求。其中用牛血清蛋白-戊二醛交聯(lián)法固定GOD性能較好，酶電極可穩(wěn)定4個(gè)月。第一代生物傳感器采用共價(jià)交聯(lián)法可以有效地減少或消除敏感材料從載體上脫落，提高傳感器的穩(wěn)定性；天然介體氧直接參與酶促反應(yīng)，通過(guò)電子在反應(yīng)中心與電極表面之間的傳遞，實(shí)現(xiàn)生化反應(yīng)信號(hào)向電信號(hào)的轉(zhuǎn)換，由于直接的電子傳遞過(guò)程較慢，傳感器對(duì)底物敏感性不夠理想，而且傳感器容易受到環(huán)境氧濃度的影響。此外，在電極反應(yīng)的過(guò)程中，需要較高的極化電位，大約在0

10、.6-0.8V20-22，在如此高的電位下進(jìn)行氧化測(cè)定，試樣中共存的其它電活性物質(zhì)，如抗壞血酸（維生素C）和尿酸等，也可以在此電位下氧化而產(chǎn)生氧化電流，給測(cè)定帶來(lái)干擾，因此該方法的靈敏度和選擇性相對(duì)較差。2).第二代介體酶電極生物傳感器 第二代生物傳感器采用化學(xué)介體或特定生物分子取代O2/H2O在酶促反應(yīng)中和電極之間進(jìn)行電子傳遞。作為良好的介體，需要具備以下條件14：極易參與有生物活性材料和電極存在的氧化還原反應(yīng)，在均相和非均相體系中都能迅速進(jìn)行電子傳遞；還原態(tài)不被氧氣氧化；氧化態(tài)的再生所需要的電壓低，并且不受pH影響；對(duì)生物無(wú)毒性，不被生物催化劑作為底物；易于生物催化劑共固定化；在工作或保存

11、期間有足夠長(zhǎng)的穩(wěn)定時(shí)間。經(jīng)過(guò)摻雜介體物質(zhì)的第二代生物傳感器，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：只需較低的極化電位，就能使介體氧化，因而減少了其它具有較低氧化還原電勢(shì)物質(zhì)干擾電極過(guò)程的機(jī)會(huì)；二茂鐵離子不與氧起反應(yīng)，使傳感器對(duì)氧不敏感，能夠在缺氧或者氧濃度易變化的條件下使用；二茂鐵離子與還原的葡萄糖氧化酶之間的電子傳遞快，因而電極響應(yīng)迅速；二茂鐵衍生物為水不溶性，可直接限制在電極表面，無(wú)需投放到樣品溶液中。第二代生物傳感器采用一些非生理的氧化還原媒介體如二茂鐵及其衍生物等代替氧，加強(qiáng)了酶與電極間的直接電子傳輸，起到了酶與電極間的電子開閉器作用，加速了電極反應(yīng)，降低了環(huán)境干擾，但目前第二代電流型傳感器還存在著介體流失

12、、電極污染及一些電活性物質(zhì)的干擾等問題。3).第三代直接電化學(xué)生物傳感器 直接電化學(xué)生物傳感器主要用于解決酶等生物識(shí)別元件與電極之間的低效率通訊的問題。造成這種現(xiàn)象的原因包括：大多數(shù)蛋白質(zhì)的電活性中心包埋在蛋白質(zhì)分子深處，距離電極較遠(yuǎn)；蛋白質(zhì)吸附在電極表面后，分子部分變性；不適合的空間取向等等。與前兩代生物傳感器相比，直接電化學(xué)生物傳感器既不需要氧分子，也不需要化學(xué)介體分子作為電子傳遞體，通常還不需要固定化載體，而是將酶分子直接吸附固定到電極表面，使酶的氧化還原活性中心與電極直接“交流”，能夠更快地進(jìn)行電子傳遞，從而使酶電極生物傳感器的響應(yīng)速度更快、靈敏度更高，真正成為“無(wú)試劑分析”。目前研究

13、較多的是辣根過(guò)氧化物酶與電極的直接電子轉(zhuǎn)移行為23, 24。另外可采用通常的媒介體物質(zhì)修飾酶分子上的氨基酸殘基，使酶本身具有傳遞電子的能力，將這種媒介體修飾的酶固定于電極上，直接進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移。Battaglini25等人研究用鋨的配合物與葡萄糖氧化酶共價(jià)結(jié)合后固定于電極上，對(duì)葡萄糖的響應(yīng)結(jié)果表明，鋨配合物修飾的酶是穩(wěn)定的，固定于電極上不會(huì)造成媒介體的流失，與二茂鐵修飾的酶相比有較快的電極反應(yīng)。通過(guò)酶的直接電子傳遞，我們可以獲得關(guān)于化學(xué)反應(yīng)本身的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)信息，了解生物大分子的結(jié)構(gòu)和各種物理化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系，從而在以后實(shí)踐中得以廣泛應(yīng)用。三代生物傳感器的區(qū)別見圖2.126 圖2.1 三代生物傳

14、感器的區(qū)別2.2 酶的固定化方法生物傳感器中的生物活性物質(zhì)酶是傳感器的核心部分，但它們一般都易溶于水，且本身也不穩(wěn)定，需要固定在各種載體上，才可延長(zhǎng)酶的活性。固定化技術(shù)在很大程度上決定著傳感器的性能(如:選擇性、靈敏度、穩(wěn)定性、檢測(cè)范圍與使用壽命等)。酶的固定化方法有很多種，例如吸附法、包埋法、載體結(jié)合法、交聯(lián)法。任何一種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，通常把幾種方法綜合起來(lái)固定酶的效果比較好。2.3 酶的固定化材料常用固定化材料有無(wú)機(jī)、有機(jī)聚合物、凝膠以及生物材料等。吸附法多以無(wú)機(jī)材料為載體，主要包括粘土、多孔玻璃、氧化鋁及活性炭等。包埋法多以天然或合成的聚合物凝膠為載體，如:藻酸鹽、樹脂、聚乙烯醇、聚丙烯

15、酞胺等。3、 無(wú)機(jī)/有機(jī)納米復(fù)合材料無(wú)機(jī)物由于其具有高強(qiáng)度、高剛性、高硬度而作為結(jié)構(gòu)材料受到人們的青睞。同時(shí)，由于它們光譜譜線較窄，又成為應(yīng)用廣泛的光、電、磁等功能材料。無(wú)機(jī)物具有性能長(zhǎng)期穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，它同時(shí)也存在著加工成型較難的問題。目前主要有高溫?zé)Y(jié)、冶煉、晶體培養(yǎng)等加工方法。生物物質(zhì)作為一種有生物活性的材料，隨著生命科學(xué)的發(fā)展，得到了科學(xué)家們的重視。但它們對(duì)環(huán)境極度敏感。雜化材料是兩種不同類型的材料的復(fù)合。過(guò)去人們利用大尺寸的雜化曾得到某些性能較為優(yōu)良的材料。但是僅僅停留在大尺度上的雜化是無(wú)法滿足當(dāng)前信息時(shí)代對(duì)材料的高技術(shù)要求的，就此科學(xué)家提出了小尺度的雜化，即在納米尺度

16、及分子水平上的雜化，以期得到多功能、高密度集成的復(fù)合材料。50年代初自Roy和Komarneni27提出“納米復(fù)合材料”（Nanocomposites)的概念以來(lái)，納米復(fù)合材料的研究取得了迅速發(fā)展。在美國(guó)、日本、德國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，無(wú)機(jī)/有機(jī)納米復(fù)合材料已經(jīng)是新材料和功能材料領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)之一28-30?；谏鲜隹紤]，我們首先從我們有基礎(chǔ)的生物無(wú)機(jī)納米層狀材料入手，開展研究工作。雖然大尺度雜化和小尺度雜化的材料在組成和原子或分子的排布上是一樣的，但是作為組成物質(zhì)聚集態(tài)的微粒在小尺度雜化時(shí)為納米粒子。由于納米微粒具有一些特殊的性質(zhì)，因而材料表現(xiàn)出許多人們所需求的優(yōu)良的性能。具有高密度、多功能、高集

17、成度、高密存儲(chǔ)能力、協(xié)調(diào)和協(xié)同效應(yīng)，吸引著眾多科研工作者們?nèi)ラ_發(fā)研制新型納米組裝體，以期得到優(yōu)良性能的材料。3.1 水滑石層狀雙金屬氫氧化物（Layered Double Hydroxides簡(jiǎn)稱LDHs），又稱為水滑石類化合物（Hydrotalcites簡(jiǎn)稱HT）。它是一種由帶正電荷的金屬氫氧化物層板和層間填充帶負(fù)電荷的陰離子構(gòu)成的層狀化合物。層狀雙金屬氫氧化物具有顯著的堿性特征，是一種新型的固體堿催化材料；同時(shí)它還具有氧化還原性和層間陰離子可交換性。LDHs在堿催化、加氫、聚合、縮合、氧化及醇類轉(zhuǎn)化等反應(yīng)中表現(xiàn)出催化活性高和選擇性好的特點(diǎn)，并且在離子交換、吸附等方面也有廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，

18、隨著學(xué)科領(lǐng)域的相互滲透、相互交叉，LDHs又被用到功能高分子材料、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域中，使其應(yīng)用范圍得到了進(jìn)一步拓寬。層狀雙金屬氫氧化物的基本性質(zhì)層狀雙金屬氫氧化物（LDHs）是一類由帶正電荷的金屬氫氧化物層板和層間填充帶負(fù)電荷的陰離子構(gòu)成的層狀化合物。層間陰離子為碳酸根的鎂鋁層狀雙氫氧化物（Mg-Al-CO32-LDHs）又稱為水滑石。天然水滑石大約于1842年前后在瑞典被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)式為Mg6Al2(OH)16CO34H2O31。水滑石具有與水鎂石Mg(OH)2相似的結(jié)構(gòu)。水鎂石Mg(OH)2，是具有六配位的陽(yáng)離子Mg2+，以6個(gè)羥基形式存在的氧構(gòu)成的八面體為結(jié)構(gòu)單元，八面體結(jié)構(gòu)單元以共用棱

19、邊的形式形成層狀，層與層之間在氫鍵和靜電作用下堆積成水鎂石32。水滑石可看作水鎂石中的Mg2+部分地被Al3+同晶取代而形成的衍生物。由于三價(jià)金屬陽(yáng)離子同晶取代了二價(jià)金屬陽(yáng)離子，使得本來(lái)呈電中性的水鎂石帶部分正電荷，因此層間必須填充陰離子（自然界中多為CO32-）從而使電荷得以平衡，同時(shí)伴隨著水分子填充到層間，形成水滑石。LDHs的化學(xué)組成通式為：M2+1-xM3+x(OH)2b+An-b/nmH2O，其中M代表金屬元素，A表示層間陰離子，b=x或2x-1，z=2或133。通常M2+=Mg2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+、Li+等二價(jià)或一價(jià)金屬陽(yáng)離子；M3+=Al3+、Cr3+、F

20、e3+等三價(jià)金屬陽(yáng)離子；M2+/M3+=210；An-為在堿性溶液中能夠穩(wěn)定存在的陰離子，如：NO3-、CO32-、OH-、Cl-、SO42-、PO43-、C6H4(COO-)2等無(wú)機(jī)或有機(jī)陰離子。水滑石的典型結(jié)構(gòu)如圖3.1所示34。圖3.1 水滑石的典型結(jié)構(gòu)示意圖LDHs最基本的性能是堿性。不同LDHs的堿性強(qiáng)弱與組成中二價(jià)金屬氫氧化物的堿性強(qiáng)弱基本一致，但由于它一般具有很小的比表面積(約520 m2/g)，表觀堿性較小。LDHs焙燒后形成的復(fù)合氧化物往往表現(xiàn)出較強(qiáng)的堿性。由于LDHs組成中含有三價(jià)金屬元素，因此一般也帶有酸性特征。其酸性強(qiáng)弱除了與組成中三價(jià)金屬氫氧化物的酸性強(qiáng)弱有關(guān)，也和層

21、間陰離子的種類有很大關(guān)系。LDHs另一個(gè)重要的性能是其層間陰離子的可交換性。因此它可以作為陰離子交換材料來(lái)使用，另外，通過(guò)將各種陰離子如無(wú)機(jī)和有機(jī)陰離子、同多和雜多陰離子以及配合物陰離子引入LDHs層間，可以得到各種具有不同功能的新材料。LDHs的熱穩(wěn)定性因組成而異，但基本相近。以水滑石為例，其熱分解過(guò)程包括脫結(jié)晶水、層板羥基縮水并脫除CO2和新相生成等步驟。水滑石在400oC550oC焙燒，可形成比較穩(wěn)定的雙金屬氧化物，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)DO。LDO在一定的濕度和陰離子條件下，可以恢復(fù)形成LDHs，即所謂的“記憶功能”。LDHs和LDO本身具有堿催化和氧化還原催化功能，同時(shí)由于其層間陰離子的可交換性，

22、使得它們可以作為催化劑載體、離子交換材料、吸附材料等使用。3.2血紅蛋白的結(jié)構(gòu)血紅蛋白的結(jié)構(gòu)如圖3.2，四個(gè)亞基構(gòu)成一個(gè)接近于球體的分子，直徑5.5nm，分子量64500Da，脫氧血紅蛋白等電點(diǎn)為6.68，氧合血紅蛋白6.8735，比容0.749ml/g，特性粘度3.6ml/g，作為寡聚蛋白，血紅蛋白具有一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。人血紅蛋白的鏈和鏈分別由141和146個(gè)氨基酸組成，氨基酸序列已經(jīng)完全測(cè)明36。鏈和鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)上有60個(gè)氨基酸殘基相同，占多肽鏈氨基酸殘基總數(shù)的42%37。牛血紅蛋白與人血紅蛋白有很高的同源性。圖3.2 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)3.2.1 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)人血紅蛋白序列38：鏈VLS

23、PADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR鏈VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH牛血紅蛋白序列38：鏈VLSA

24、ADKGNVKAAWGKVGGHAAEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGAKVAAALTKAVEHLDDLPGALSELSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHSLLVTLASHLPSDFTPAVHASLDKFLANVSTVLTSKYR鏈MLTAEEKAAVTAFWGKVHVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTADAVMNNPKVKAHGKKVLDSFSDGMKHLDDLKGTFAALSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVVVLARNFGKEFTPVLQADFQKVVAGVANALAHRYH牛血紅蛋白有46個(gè)賴氨酸殘基和2個(gè)

25、半胱氨酸殘基（每個(gè)鏈1個(gè)），人血紅蛋白有44個(gè)賴氨酸殘基和6個(gè)半胱氨酸殘基（每個(gè)鏈1個(gè)，每個(gè)鏈2個(gè)），這些氨基酸殘基的側(cè)鏈的氨基和巰基以及鏈和鏈N末端氨基都是血紅蛋白反應(yīng)的活性基團(tuán)。血紅蛋白的鏈和鏈中分別含有7個(gè)和8個(gè)-螺旋結(jié)構(gòu)，約占?xì)埢倲?shù)的三分之二，其余為非螺旋結(jié)構(gòu)。這些螺旋的長(zhǎng)度為7到12個(gè)氨基酸殘基，每圈有3.6個(gè)殘基，螺旋靠軸向的氫鍵穩(wěn)定。在鏈和鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)中，脯氨酸經(jīng)常出現(xiàn)在多肽鏈的轉(zhuǎn)角處或螺旋之間。其他的轉(zhuǎn)角靠多種立體化學(xué)機(jī)理穩(wěn)定，這些作用包括相近鏈段間的相互作用，鄰近-螺旋間的相互作用等。在血紅蛋白分子中，極性氨基酸的殘基的側(cè)鏈一般位于分子表面，但是，偶爾也有Ser和Thr殘基

26、位于分子內(nèi)部的情況。在這種情況下，Ser和Thr殘基的羥基，往往與同一個(gè)-螺旋的羧基，形成氫鍵。大部分非極性氨基酸殘基的側(cè)鏈，位于分子內(nèi)部或亞單位之間的裂隙表面。非極性側(cè)鏈伸到水環(huán)境中去的情況是極其罕見的。但是，偶爾也有這樣的情況發(fā)生，例如：-鏈的F（93）Cys或E27(68)Leu，其側(cè)鏈伸出了分子表面。Gly和Ala可以分布在分子的任何地方（分子表面、分子內(nèi)部疏水核以及亞單位之間的裂隙表面）。與肌紅蛋白一樣，血紅素埋藏在血紅蛋白的每條肽鏈的疏水空穴中。其Fe2+除與血紅素本身的四個(gè)吡咯環(huán)的N原子配位而外，還與F8（92）His吡唑基以配位基相連。Fe2+的第六個(gè)空位置，可以與O2可逆的結(jié)

27、合37。另外，血紅素的存在也是球蛋白鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定的一個(gè)重要因素，它的存在能增加球蛋白的溶解性，血紅素嵌在球蛋白鏈的“口袋”內(nèi)，具有由丙酸構(gòu)成的極性端和乙烯基與甲基構(gòu)成的非極性端。構(gòu)成血紅素口袋的氨基酸側(cè)鏈具有較強(qiáng)的非極性，允許血紅素乙烯基一端首先進(jìn)入，然后通過(guò)卟啉環(huán)和口袋中的氨基酸間的多種相互作用，血紅素定位在口袋中。脫氧血紅蛋白中，血紅素的亞鐵離子配位數(shù)為5，其中4個(gè)用于和卟啉環(huán)連接，第五個(gè)與近端的組氨酸F8的咪唑基共價(jià)連接。根據(jù)X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析揭示，血紅蛋白分子是一個(gè)四聚體，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)。其四個(gè)亞基（2個(gè)鏈，2個(gè)鏈）占據(jù)相當(dāng)于四面體的四個(gè)角，整個(gè)分子形成C2點(diǎn)群對(duì)稱。血紅素輔基位于分子

28、表面的孔穴內(nèi)，每個(gè)亞基一個(gè)。四個(gè)氧的結(jié)合部位彼此保持一定的距離，兩個(gè)最近的鐵原子之間距離為2.5nm。四個(gè)亞基凹凸互補(bǔ)，形成一個(gè)長(zhǎng)寬高分別為6.4nm*5.5nm*5nm的四面體。每個(gè)或鏈與兩個(gè)或鏈接觸，而兩個(gè)或鏈之間的接觸很少。脫氧血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)主要靠8個(gè)鹽橋維持，是其對(duì)氧分子的親合力低于單獨(dú)的亞基和氧合血紅蛋白。在四個(gè)亞基之間有一個(gè)中央孔穴，2，3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）位于其中，進(jìn)一步穩(wěn)定了脫氧血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)，降低了其對(duì)氧的親合力，此時(shí)血紅蛋白處于構(gòu)象的T(tense)態(tài)。3.2.2 血紅蛋白的生理功能在動(dòng)物體內(nèi)，血紅蛋白的主要功能是運(yùn)送氧，部分二氧化碳和氫離子。血紅蛋白

29、對(duì)O2傳輸是必須的39。成年人血紅蛋白有兩和兩多肽鏈組成，每條鏈結(jié)合一個(gè)血紅素，每個(gè)血紅素能夠結(jié)合一分子的氧，每克血紅蛋白可以結(jié)合1.36毫升氧40。脫氧血紅蛋白球蛋白亞基由于靜電力維持緊張的構(gòu)象，對(duì)O2有相對(duì)低的親和力，當(dāng)O2結(jié)合到血紅素基團(tuán)上，機(jī)械化學(xué)應(yīng)力減弱了靜電力，導(dǎo)致了松弛的構(gòu)象，暴露了殘留位點(diǎn)，增加了O2的親合力500倍。Hill系數(shù)反映了血紅蛋白多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的協(xié)同效應(yīng)，氧合血紅蛋白釋放氧則是一個(gè)負(fù)協(xié)同作用過(guò)程：第一個(gè)氧釋放比較容易，后面的氧釋放越來(lái)越難。因而血紅蛋白的氧平衡曲線為S型曲線(如圖3.3)，而不是無(wú)協(xié)同作用的肌紅蛋白表現(xiàn)出來(lái)的雙曲線41。組織代謝產(chǎn)生的二氧化碳經(jīng)血液運(yùn)

30、輸排除，血漿運(yùn)輸約占77%，其中70%以HCO3-的形式，7%是溶解的CO2氣體，只有23%的二氧化碳進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)，以HbCO2的形式運(yùn)輸。與氧結(jié)合的方式不同，CO2分子直接與血紅蛋白分子中的氨基結(jié)合。圖3.3 血紅蛋白的氧飽和曲線CO是一種無(wú)色、無(wú)嗅、無(wú)味、對(duì)呼吸道無(wú)刺激的氣體。凡含碳物質(zhì)在燃燒不完全時(shí)都會(huì)產(chǎn)生CO，常見的接觸機(jī)會(huì)有職業(yè)性接觸(如:工業(yè)生產(chǎn)煤氣、煉鋼、煉焦、燒窯、礦井作業(yè)、礦山爆破以及化工等部門)和日常生活接觸(如:將未熄滅的煤爐放在密閉室內(nèi)、煙囪堵塞、煤氣紅外線取暖器、煤氣灶故障及家用天然氣灶漏氣等)。CO經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺泡浸入血液后，與血紅蛋白結(jié)合成碳氧血紅蛋白。由于CO與

31、血紅蛋白的親和力比氧大200倍，而碳氧血紅蛋白的解離度比氧合血紅蛋白慢，兩者相差3600倍，當(dāng)人吸入CO后，血漿中CO便迅速把氧合血紅蛋白的氧排擠出去，造成低氧血癥，引起組織缺氧。當(dāng)血液碳氧血紅蛋白達(dá)10%20%會(huì)有頭暈、四肢無(wú)力感覺;當(dāng)血液碳氧血紅蛋白達(dá)40%以上會(huì)引起死亡。因此，對(duì)CO進(jìn)行適時(shí)的監(jiān)測(cè)是非常重要的?，F(xiàn)今，對(duì)CO檢測(cè)的適用化的方法有比色法、紅外吸收探測(cè)法、電化學(xué)氣體傳感器檢測(cè)法等。（二） 課題目標(biāo)、研究?jī)?nèi)容以及難點(diǎn)、創(chuàng)新點(diǎn)分析1 選題的立論、目的和意義研究一種基于LDHs的膽堿電流型酶生物傳感器。帶負(fù)電荷的生物酶通過(guò)靜電作用有效地固定在帶正電荷的LDHs層板間。LDHs將成為電

32、化學(xué)應(yīng)用中具有發(fā)展前景的一種新型材料。2 研究?jī)?nèi)容：采用共沉淀的方法合成具有納米結(jié)構(gòu)的類水滑石，并將類水滑石應(yīng)用在生物傳感器的構(gòu)建中。以安培法來(lái)測(cè)定生物酶電極對(duì)目標(biāo)檢測(cè)物CO的分析能力：檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)限量、線性范圍、生物酶的電極穩(wěn)定性和壽命等。用伏安法研究生物活性層/水滑石界面的電子傳遞，通過(guò)檢測(cè)峰電位的變化，測(cè)定電流的大小研究生物酶電極的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。將生物酶分子在類水滑石制備的過(guò)程中作為電荷平衡物原位嵌入到無(wú)機(jī)層板之間，設(shè)計(jì)可調(diào)節(jié)類水滑石層板之間距離和水滑石粒子大小的方法，以適應(yīng)大分子復(fù)合體的插入需要。用掃描電化學(xué)顯微鏡測(cè)定生物酶電極中生物膜的構(gòu)型、氧化還原催化劑在類水滑石層板中的嵌入形式

33、。類水滑石的結(jié)構(gòu)和形貌采用紅外光譜、XRD、交流阻抗和SEM來(lái)表征。研究了酶?jìng)鞲衅髦苽涞淖钸m條件，以及外界因素（溶液pH、外加電位、溫度等）對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響。3 研究方案4本課題難點(diǎn)分析（1）生物分子與層板剝離層狀材料的組裝條件選擇與控制。（2）生物分子與層板剝離層狀材料組裝后的結(jié)構(gòu)描述。（3）生物分子在層狀材料表面鋪展成膜，獲得較好的性能。5創(chuàng)新之處：(1)利用水滑石的層板間陰離子可交換的特性，使之成為生物大分子的固定載體，這提供了一種新型的、操作簡(jiǎn)便的生物傳感器制備方式。(2)將水滑石應(yīng)用在生物傳感器的構(gòu)建中，不斷優(yōu)化功能膜的制備條件和相關(guān)電化學(xué)生物傳感器的性能，探討此類傳感器在環(huán)境

34、監(jiān)測(cè)和醫(yī)學(xué)生化鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用。(3)水滑石的納米構(gòu)型將對(duì)生物傳感器靈敏度的提高、滲透選擇性的調(diào)節(jié)提供有利條件，通過(guò)調(diào)節(jié)層板間距來(lái)控制生物膜的孔徑和粒子的大小，使之具有特殊的滲透選擇性，以滿足生物傳感器的實(shí)際應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1 J.R Stetter, W.R Penrose, S Yao. J. Electrochem. Soc. 150( 2003), S11-S16.2J. Wang. Biosensors and Bioelectronics. 21 (2006) 1887. 3J. Wang. Biosensors and Bioelectronics. 13 (1998) 757.

35、4P. Connolly. Biosensors and Bioelectronics. 10 (1995) 1. 5J.H.T.Luong, P.Bouvrette, K.B.Male. Trends in Biotechnology. 15 (1997) 369. 6S.C.Kelly, P.J.OConnell, C.K.OSullivan, G.G.Guilbault. Analytica Chimica Acta. 412 (2000) 111. 7Z.Muhammad-Tahir, E.C.Alocilja. Biosystems Engineering. 88 (2004) 14

36、5. 8C.Erode, M.Del.Gallo, L.Mosiello, S.Baccella, A.Lepidi. Sensor and Actuator B: Chemical. 91 (2003) 163.9S.Ramananthan, M.Ensor.Dannert, Trends in Biotechnology. 15 (1997) 500. 10S.Kroger, S.Piletsky, A.P.F.Turner. Marine Pollution Bulletin. 45 (2002) 24. 11B.M.Paddle.Biosensors and Bioelectronic

37、s. 11 (1996) 1079. 12J.W.Hines. Acta Astronautica. 38 (1996) 261.13Turner A P F.Biosengsor:past, present and future. www.cranfield. ac. uk/biotech/chinap. htm., 199614張先恩.生物傳感器M，2006. 15L.C.Clark, C.Lyones, Ann.N.Y. Acad. Sci. 1962, 102: 2916鞠煜先，電分析化學(xué)與生物傳感技術(shù)M，200417.唐芳瓊，孟憲偉，陳東等.中國(guó)科學(xué)，2000，30（20）：119.

38、18俞俊堂，唐孝宜.生物工藝學(xué)M，1991. 19Nanjo M, Guilbault G G. Anal Chem. Acta.,1974, 73: 367. 20Clark Jr L C, Methods Enzymol, 1979, 56: 448. 21Lanniello R M, Yacynyeh A M. Anal Chem, 1981, 53: 2090. 22Wang J, Naser N, Anges L, Hui W, Chen L. Anal Chem., 1992, 64: 1285. 23.劉慧宏，陳顯堂，李俊等.分析化學(xué)，2001，29（5）：511. 24.Fer

39、apon Tova E E, Grigoren Ko V G, Egorov A M. Journal of Electroanytical Chemistry, 2001, 509: 19. 25.Battagl Inif, Bartl Ett P N, Wangj H. Anytical Chemistry, 2000, 72: 502. 26Christine Mousty. Sensors and biosensors based on clay-modified electrodesnew trends.Applied Clay Science 27 (2004) 159-17727R.Roy，et.Al，Mater Res Soc Symp Proc，1984，32:347.28P.