rna干擾講課講稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。rna干擾RNA干擾（RNAi）實(shí)驗(yàn)原理與方法近年來(lái)的研究表明，將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。一、RNAi的分子機(jī)制K7TzF&通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititationandeffectorsteps)。在起始階段，加入的小分子R

2、NA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶，是RNaseIII家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3端都有2個(gè)堿基突出。i?M在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的

3、過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。Fzq41jiS另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.JgRYljQi2Tdo9二、如何進(jìn)行RNAi試驗(yàn)ispgKX6I+K(一)siRNA的設(shè)計(jì)wEW4gzs1.在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：x*XH&VHYPERLINK/b

4、usiness/products/order2.htmt_blank/business/products/order2.htmnR;D#p%HYPERLINK/techlib/misc/siRNA_finder.htmlt_blank/techlib/misc/siRNA_finder.htmlMz:qmFAHYPERLINK/Stu/shilin/rnai.htmlt_blank/Stu/shilin/rnai.html$4SzUZ0HYPERLINK/rnadesign/default.aspx?SID=45358710t_blank/rnadesign/default.aspx?SID=

5、45358710lK7m=j24cekUID10093精華HYPERLINK/searcher.php?authorid=10093&digest=1t_blank6發(fā)帖1954金幣229克威望26點(diǎn)貢獻(xiàn)值5點(diǎn)交易幣5枚在線時(shí)間221(時(shí))注冊(cè)時(shí)間2008-08-04最后登錄2010-11-082.RNAi目標(biāo)序列的選取原則：pu!dqF(1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。UBjq%zTuschl等建議在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)

6、不要針對(duì)5和3端的非編碼區(qū)（untranslatedregions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。n26Y7N(2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。&LtWT$例如使用BLAST（HYPERLINK/BLAST/t_blank/BLAST/）MF60-VE(3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。t&5%?QyM3.陰性

7、對(duì)照&UJf4b|A一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。o47rt4.目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：cw&Hgjj2HYPERLINK/catalog/category.aspx?key=49t_blank/catalog/category.aspx?key=49_UE)*lm+HYPERLINK/techlib/tb/tb_502.htmlt_blank/techlib/tb/tb_5

8、02.html2,vBCAIHYPERLINK/mmcmanus/www/siRNADB.htmlt_blank/mmcmanus/www/siRNADB.htmlqoMAMfHYPERLINK/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Publishedt_blank/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published/sR%q|L(二)siRNA的制備SqZr目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNaseIII類降解(e.g.Dicer,E.coli,RNase

9、III)體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。*T$ibNVIKcT6體外制備QoI)r1.化學(xué)合成Ct(9許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成34對(duì)siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。?:NODg最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究d1!i(MaV!不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素k%Ir

10、1V2.體外轉(zhuǎn)錄q0%以DNAOligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。_$.9eBz將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸

11、鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。O_2;iD2.電穿孔法IY(hO電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。=fLL|本帖最近評(píng)分記錄:UID10093精

12、華HYPERLINK/searcher.php?authorid=10093&digest=1t_blank6發(fā)帖1954金幣229克威望26點(diǎn)貢獻(xiàn)值5點(diǎn)交易幣5枚在線時(shí)間221(時(shí))注冊(cè)時(shí)間2008-08-04最后登錄2010-11-083.DEAE-葡聚糖和polybreneF_xMU帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。P#tvm,4.機(jī)械法vA?_-.J轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（b

13、iolisticparticle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。moO_-i5.陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑1r4,XSk在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一

14、個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。現(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)吞體和溶酶體。0=0|x為了達(dá)到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要注意以下幾點(diǎn)：iHzZw.s1.純化siRNAc4|so=在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過(guò)15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學(xué)合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。3%IWGmye42.避免RNA酶污染_TH&Hl微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA實(shí)驗(yàn)失敗。由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)

15、，所有徒手接觸過(guò)的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟不受RNA酶污染非常重要。2LhEO(_3.健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性&CWY,r通常，健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨時(shí)間明顯下降。O,9X8$5H-a4.避免使用抗生素NgxO&ZpAmbion公司推薦從細(xì)胞種植到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)期間避免使用抗生素?？股貢?huì)在穿透的細(xì)胞中積累毒素。有些細(xì)胞和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)需要無(wú)血清的條件。這種情況下，可同時(shí)用正常培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以得到最佳轉(zhuǎn)染效果。

16、u=7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)JCBnFrP熒光標(biāo)記的siRNA能用來(lái)分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標(biāo)記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（配合標(biāo)記抗體）來(lái)追蹤轉(zhuǎn)染過(guò)程中導(dǎo)入了siRNA的細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達(dá)的下調(diào)結(jié)合起來(lái)。vV2oo三、RNAi的應(yīng)用前景KN|2/|1.研究基因功能的新工具fG7Jw:G已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測(cè)試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)

17、的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。Fl!AQ+t2.研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑:K5V/-|V1聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系,證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶.RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)(p/p染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)，因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。(u$!fE-et3.開展基因治療的新策略bK6,saNRNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止自私基因序列過(guò)量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。:C#-O腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)