轉(zhuǎn)基因食品介紹課件

1、轉(zhuǎn)基因食品介紹、檢測及其安全性問題 轉(zhuǎn)基因食品（genetically modified foods, GMF)是由細(xì)胞DNA中經(jīng)非生殖方法插入了特定外源基因或基因片段，并獲得某種良好性狀的動(dòng)物、植物或微生物制成的食品。例如抗蟲害、抗病毒、抗雜草的轉(zhuǎn)基因玉米、黃豆、油菜、土豆、西葫蘆等。 9.1 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的種植情況轉(zhuǎn)基因作物自1996年進(jìn)行商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積持續(xù)增長。截至2004年，在八年間增加了將近40倍左右。已批準(zhǔn)商品化轉(zhuǎn)基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜、甜菜、亞麻、煙草、西瓜等。據(jù)估計(jì)，用這些轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)加工的食品全世界有近萬種。

2、目前，轉(zhuǎn)基因作物主要集中種植在工業(yè)化國家。1999-2003年，美國、阿根廷、加拿大和中國這四個(gè)國家種植了全球99的轉(zhuǎn)基因作物。全球種植的轉(zhuǎn)基因作物主要是大豆、玉米、棉花和油菜。目前，國際上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室研究和田間實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因作物種類較多，但批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物種類卻只有幾十種。目前我國正式批準(zhǔn)投入商業(yè)種植的轉(zhuǎn)基因作物只有兩種：一是具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗蟲棉，另一個(gè)是延遲成熟的番茄，其中抗蟲棉的種植面積2003年已累計(jì)達(dá)到4000萬畝，而番茄則還處于小范圍種植階段，僅10000畝。進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因食品局限在大豆、玉米、油菜等領(lǐng)域。我國進(jìn)口的大豆中，70%是轉(zhuǎn)基因大豆，在我國市場上70%的含有大豆成

3、分的食物中都有轉(zhuǎn)基因成分，像大豆油、色拉油、磷脂、醬油、膨化食品等等。美國市場上的轉(zhuǎn)基因食品：在美國，轉(zhuǎn)基因食品已進(jìn)入尋常百姓的餐桌,轉(zhuǎn)基因大豆也已用于制作數(shù)百種食品，其中包括食物油、糖果和人造黃油。超過70%的食品含有轉(zhuǎn)基因成分，像飲料、糖果、糕點(diǎn)、冰激凌等，有3/4的奶酪是轉(zhuǎn)基因奶酪。近年來，美國的轉(zhuǎn)基因作物品種越來越多，如轉(zhuǎn)基因玉米約占美國玉米種植面積的一半。9.2 轉(zhuǎn)基因食品的種類 9.2.1 植物性轉(zhuǎn)基因食品 目前全球種植的轉(zhuǎn)基因作物可分為以下三類 ：1、抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物：2000 年全球種植抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的面積達(dá)到3，270萬公頃，占總轉(zhuǎn)基因植種植面積的72%，其中主要為抗除

4、草劑大豆。舉例：Roundup Ready soybean (RR大豆)，耐美國孟山都公司Roundup除草劑。2、抗蟲轉(zhuǎn)基因作物：2000年全球種植抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的面積達(dá)到830萬公頃，占總轉(zhuǎn)基因植物種植面積的19%，其中以抗蟲玉米為主。 舉例：BT玉米，抵抗三種毒素：Cry1Ab、 Cry1Ac、Cry9c。3、其他轉(zhuǎn)基因作物：改善產(chǎn)品的品質(zhì)；增強(qiáng)抵抗病毒病、真菌病及細(xì)菌病的能力。9.2.2 動(dòng)物性轉(zhuǎn)基因食品 比如，牛體內(nèi)轉(zhuǎn)入了人的基因，牛長大后產(chǎn)生的牛乳中含有基因藥物，提取后可用于人類病癥的治療。在豬的基因組中轉(zhuǎn)入人的生長素基因，豬的生長速度增加了一倍，豬肉質(zhì)量大大提高，現(xiàn)在這樣的豬肉已

5、在澳大利亞被請(qǐng)上了餐桌。9.2.3 轉(zhuǎn)基因微生物食品 微生物是轉(zhuǎn)基因最常用的轉(zhuǎn)化材料，所以，轉(zhuǎn)基因微生物比較容易培育，應(yīng)用也最廣泛。例如，生產(chǎn)奶酪的凝乳酶，以往只能從殺死的小牛的胃中才能取出，現(xiàn)在利用轉(zhuǎn)基因微生物已能夠使凝乳酶在體外大量產(chǎn)生，避免了小牛的無辜死亡，也降低了生產(chǎn)成本。9.2.4 轉(zhuǎn)基因特殊食品 科學(xué)家利用生物遺傳工程，將普通的蔬菜、水果、糧食等農(nóng)作物，變成能預(yù)防疾病的神奇的“疫苗食品”?？茖W(xué)家培育出了一種能預(yù)防霍亂的苜蓿植物。用這種苜蓿來喂小白鼠，能使小白鼠的抗病能力大大增強(qiáng)。而且這種霍亂抗原，能經(jīng)受胃酸的腐蝕而不被破壞，并能激發(fā)人體對(duì)霍亂的免疫能力。于是，越來越多的抗病基因正在

6、被轉(zhuǎn)入植物，使人們?cè)谄穱L鮮果美味的同時(shí)，達(dá)到防病的目的。 轉(zhuǎn)基因棉花 中國的轉(zhuǎn)基因羊 日本研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆 各種各樣的轉(zhuǎn)基因水果 浙江省種植的轉(zhuǎn)基因油菜 9.3 轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題美國宣稱轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品一樣，是安全的，對(duì)人體無害，迄今沒有報(bào)告表明轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品給人體健康造成了危害。歐盟等國家認(rèn)為轉(zhuǎn)基因食品應(yīng)用于生產(chǎn)和消費(fèi)的時(shí)間尚短，食品的安全性和可靠性都有待于進(jìn)一步的研究和證明，轉(zhuǎn)基因食品可能會(huì)導(dǎo)致一些遺傳學(xué)或營養(yǎng)成分的非預(yù)期改變，可能會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生危害。9.3.1 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)人體健康可能產(chǎn)生的影響該類食品攜帶的抗生素基因有可能使動(dòng)物與人的腸道病原微生物產(chǎn)生耐藥性，這是人們最關(guān)心的

7、問題?？瓜x農(nóng)作物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑和殘留的抗蟲內(nèi)毒素，可能對(duì)人體健康有害。有人認(rèn)為，抗蟲農(nóng)作物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑和抗蟲內(nèi)毒素，既然能使咬食其葉片的昆蟲的消化系統(tǒng)功能收到損害，那么誰又能擔(dān)保其葉片、果實(shí)、種子不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生類似的傷害呢？隨著基因改造的抗除草劑農(nóng)作物的推廣，可能導(dǎo)致除草劑的用量增加，從而導(dǎo)致除草劑在食品種殘留量加大。轉(zhuǎn)基因作物中病毒基因有可能與浸染該植物的其他病毒進(jìn)行重組，產(chǎn)生新病毒或超級(jí)病毒。轉(zhuǎn)基因生物作為食品進(jìn)入人體，可能使人出現(xiàn)某些毒理作用和過敏反應(yīng)，國外已有兒童飲用轉(zhuǎn)基因大豆豆?jié){產(chǎn)生過敏反應(yīng)的報(bào)道。9.3.2 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對(duì)環(huán)境生態(tài)可能產(chǎn)生的影響轉(zhuǎn)基因作物本身可能轉(zhuǎn)變成雜草。

8、如果轉(zhuǎn)入的抗性基因逃逸到其他作物上，也會(huì)使這些作物的野生近緣種并成雜草；如果轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)作物一旦通過花粉導(dǎo)入方式將高產(chǎn)基因傳給周圍雜草，會(huì)引發(fā)超級(jí)雜草出現(xiàn)，對(duì)天然森林造成基因污染和對(duì)這些地區(qū)的其他作物帶來不可預(yù)見的后果。如果轉(zhuǎn)基因不育品種的不育基因在種植地大肆傳播，會(huì)導(dǎo)致當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)崩潰?？瓜x、抗病和抗除草劑類轉(zhuǎn)基因植物，除對(duì)害蟲產(chǎn)生毒害而使其死亡外，對(duì)環(huán)境中的許多有益生物也產(chǎn)生直接或間接的影響，甚至使其死亡。如果用于食品的植物通過基因改良成為要用植物，那么通過異花授粉會(huì)使食用的植物產(chǎn)生藥性，從而污染人類的食品供應(yīng)。基于轉(zhuǎn)基因食品潛在安全的不確定性，世界各國政府都加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行管理。主要原則是

9、：一、執(zhí)行嚴(yán)格的安全評(píng)價(jià)制度；二、標(biāo)識(shí)制度，即在轉(zhuǎn)基因食品包裝上加貼標(biāo)識(shí)。目前我國轉(zhuǎn)基因食品法規(guī)主要為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法，2002年3月20日起實(shí)施，規(guī)定對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施標(biāo)識(shí)制度。第一批標(biāo)識(shí)管理的轉(zhuǎn)基因生物目錄是：大豆種子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕、玉米種子、玉米、玉米油、玉米粉、油菜種子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕、棉花種子、番茄種子、鮮番茄、番茄醬。 9.4 DNA提取轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的第一步是提取樣品中的DNA。植物細(xì)胞中DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)中的DNA主要存在于線粒體和葉綠體中。細(xì)胞內(nèi)各種DNA總稱為總DNA。進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測需要提取的是總DNA。提取DNA的質(zhì)量關(guān)鍵在

10、于DNA分子的平均長度、化學(xué)純度和DNA結(jié)構(gòu)的完整性。DNA提取的基本原理是：從樣品中釋放DNA和純化DNA。為了得到高質(zhì)量的DNA，必須去除： 蛋白質(zhì)如用蛋白酶或有機(jī)試劑去除； 多糖（如果膠、纖維素、半纖維素、淀粉和增稠劑等），以酶（果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等）方法或有機(jī)溶劑（CTAB/氯仿等）去除； 脂類，以酶法或溶劑（如正己烷）去除； RNA，用RNA酶去除； 鹽類（提取/裂解緩沖液或沉淀液的殘留物）。DNA的純化采用不同方式，主要有沉淀法和固體介質(zhì)吸附法。沉淀法是用試劑乙醇和異丙醇等沉淀濃縮DNA，在DNA沉淀過程中可使用DNA共沉淀劑如糖原、PEG或tRNA以提高DNA的

11、得率。固體介質(zhì)吸附法是指采用陰離子交換樹脂、硅石或玻璃珠、硅藻土、膜等吸附DNA。提取DNA時(shí)，可同時(shí)采取幾種純化方法。關(guān)于植物總DNA的提取方法有很多，如苯酚氯仿法、CTAB法、SDS法、二氧化硅法和胍鹽等方法。9.4.1 苯酚氯仿法本方法是常用的DNA提取方法。苯酚能破壞細(xì)胞和核酸酶。氯仿使蛋白質(zhì)變性并有助于液相和水相的分離。苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）的效果更好，異戊醇能消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。苯酚：氯仿將蛋白質(zhì)、多糖和核酸酶等從含有DNA的水相中去除，再用氯仿抽提去除苯酚，最后用乙醇沉淀濃縮DNA，去除鹽類和殘余氯仿。本方法的關(guān)鍵步驟是裂解，在細(xì)胞裂解時(shí)，最好是在SDS和高E

12、DTA濃度的溶液中熱裂解。9.4.2 SDS法本方法側(cè)重于細(xì)胞的裂解和DNA的釋放。高濃度的SDS在較高溫度（55-65）條件下裂解細(xì)胞，使染色體解析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸。然后采用高鹽濃度（如5mol/LKAc）及降低溫度（置于冰上保溫），使蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)沉淀，離心去除沉淀，上清液中的DNA反復(fù)用酚/氯仿抽提，最后用乙醇沉淀水相中的DNA。對(duì)于富含蛋白質(zhì)的材料常加蛋白酶K來除去蛋白質(zhì)，對(duì)于富含多酚類物質(zhì)的樣品，如馬鈴薯、西紅柿等，一般加入6的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），PVP可與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，經(jīng)離心可被除去。該法操作簡單，條件溫和，但所提取的DNA溶液中糖類雜質(zhì)較多。多糖含量

13、高的樣品不宜采用此方法。9.4.3 CTAB法本方法是轉(zhuǎn)基因成分檢測常用的方法。CTAB是一種去污劑，能溶解細(xì)胞膜并能與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，但當(dāng)NaCl濃度降低到0.3mol/L時(shí)，會(huì)從溶液中析出。通過離心可將復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。然后將復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀。CTAB與核酸的復(fù)合物發(fā)生沉淀時(shí)，多糖、色素、多酚類物質(zhì)不發(fā)生沉淀，所得到的DNA為乳白色或灰白色。此法最大的優(yōu)點(diǎn)是通過高鹽溶液的選擇性沉淀能很好的去除糖類和酚類等雜質(zhì)，所以提取含糖類和酚類含量較高的樣品可優(yōu)先采用此方法。9.4.4 二氧化硅法本方

14、法是一個(gè)專利方法，操作簡單，適用于大多數(shù)物質(zhì)的DNA提取，側(cè)重于DNA純化。本方法不適合于高脂物質(zhì)DNA的提取。首先以裂解液裂解細(xì)胞，常用SDS和高EDTA溶液熱裂解。在鹽酸胍溶液中用二氧化硅樹脂純化DNA，DNA吸附在樹脂上，再用異丙醇將污染物質(zhì)從樹脂上去除，最后用低鹽緩沖液洗脫溶解DNA。9.4.5 試劑盒法在日常檢驗(yàn)中一般采用DNA提取試劑盒來提取樣品的DNA。DNA提取試劑盒的步驟是：首先裂解細(xì)胞，再抽提去除蛋白質(zhì)等污染物質(zhì)，純化DNA，最后去除鹽分溶解DNA，也是上述集中方法的結(jié)合。提取樣品的DNA時(shí)，每個(gè)樣品必須設(shè)置兩個(gè)提取平行樣和一個(gè)提取空白對(duì)照（水代替樣品）。9.5 轉(zhuǎn)基因食品

15、檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測主要采用普通定性PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因芯片和ELISA方法。其中以普通定性PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR最常用。9.5.1 PCR技術(shù)介紹聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR) 是1985年由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的K.B. Mullis等發(fā)明的一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，又稱為無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)。1993年K.B. Mullis獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。它具有特異、敏感、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。9.5.1.1 PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程。在適宜的條件下，人工合成寡核苷酸引物與模板DNA

16、單鏈互補(bǔ)結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸(dNTP) 為底物，不斷延伸，使被擴(kuò)增的基因片斷以幾何倍數(shù)增長。PCR過程包括變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟：模板DNA的變性：加熱至93-95，模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA離解成為單鏈；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)變性退火延伸三個(gè)過程，目的基因被擴(kuò)增放大幾百萬倍。每個(gè)循環(huán)需2-4min，整個(gè)PCR反應(yīng)需要2-3h。PCR擴(kuò)增遵循酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原理：反

17、應(yīng)初期靶序列DNA片斷呈指數(shù)形式增加；隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累、原料的消耗、酶活性的降低，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，擴(kuò)增的DNA片斷增加緩慢，進(jìn)入所謂的平臺(tái)期。9.5.1.2 PCR反應(yīng)的主要因素模板、引物、酶、dNTP和Mg2+是PCR反應(yīng)的五個(gè)重要因素，決定了PCR反應(yīng)的成敗。模板DNA：模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。抽提的DNA溶液中含有氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑、Taq酶抑制劑和雜蛋白等會(huì)影響PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生假陰性。 引物：PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度，引物的設(shè)計(jì)和合成對(duì)PCR結(jié)果起著決定性作用。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度：15-30bp，不

18、能過長，引物過長導(dǎo)致延伸溫度過高，不適于Taq酶促反應(yīng)。退火溫度：60左右。引物堿基：G+C含量以40-60為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)。避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其他序列無明顯同源性。 引物設(shè)計(jì)多采用計(jì)算機(jī)軟件，例如Permier Primer、Oligo等。在軟件的基礎(chǔ)上輔以人工分析，以達(dá)到最佳效果。 PCR反應(yīng)中引物濃度也

19、影響PCR擴(kuò)增效果。引物濃度低，PCR擴(kuò)增量低，會(huì)出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象；濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 Taq DNA聚合酶： 它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性聚合酶，其活力的高低決定了PCR擴(kuò)增是否成功。此酶的最適溫度很高（79），使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，增加了反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率。酶濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系。在PCR反應(yīng)中，4種dNTP的濃度要相等，反應(yīng)濃度為200umol/L左右，濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量；濃度過高會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)配。 Mg2+濃度 Mg2+是Taq

20、DNA聚合酶活性所必需的，直接影響著酶的活性和可靠性。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)， Mg2+濃度為1.5-2.0mmol/L為宜。 Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。DNA模板、引物和dNTP可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實(shí)際濃度。9.5.1.3 PCR熱循環(huán)條件PCR退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。變性后溫度快速冷卻至50-65，引物和模板結(jié)合。退火溫度與時(shí)間的設(shè)置，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度和靶序列的長度。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增產(chǎn)量。在其他參數(shù)優(yōu)化的條件下，循環(huán)次數(shù)主

21、要取決于模板DNA的初始濃度。一般的循環(huán)次數(shù)在30-40之間，循環(huán)次數(shù)過多會(huì)增加非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物量。9.5.1.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和分析有許多方法，如凝膠電泳、Southern雜交和PCR-ELISA等方法，最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。通常應(yīng)用1-2的瓊脂糖凝膠，經(jīng)溴化乙錠染色，通過凝膠成像系統(tǒng)，初步判斷產(chǎn)物的特異性，PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致。對(duì)PCR產(chǎn)物的鑒定通常采用限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)和核酸序列分析等方法。9.5.1.5 PCR檢測常見問題在進(jìn)行PCR檢測時(shí)，常見的問題是假陽性和假陰性現(xiàn)象。 假陽性 由于PCR的高靈敏性，極微量的目標(biāo)DNA污染都有可能出現(xiàn)

22、擴(kuò)增條帶。因此要防止污染，尤其是DNA抽提中的樣品交叉污染、PCR試劑污染和PCR產(chǎn)物的污染。引物設(shè)計(jì)不合適也會(huì)出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性，需要重新設(shè)計(jì)引物。 假陰性產(chǎn)生假陰性的原因主要有DNA模板、酶、試劑、引物用量低或含有抑制劑和循環(huán)參數(shù)不正確等。在PCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。引起假陰性現(xiàn)象的可能原因：模板中含有雜蛋白質(zhì)，Taq酶抑制劑，酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑或DNA量不足， Taq酶失活、酶活降低或量不足，引物設(shè)計(jì)不合理，變性溫度低，變性時(shí)間短

23、，退火溫度不適合等等。PCR常見的問題還有非特異性擴(kuò)增和涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶（Smear現(xiàn)象）。非特異性擴(kuò)增：引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體，Mg2+濃度過高、退火溫度過低或PCR循環(huán)次數(shù)過多，酶質(zhì)量較差，或酶量過多等。Smear現(xiàn)象：酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低等。9.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且比常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、不使用溴化乙錠、不污染環(huán)境等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)

24、測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的化學(xué)物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。TaqMan熒光探針PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物，同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記了一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)猝滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被猝滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和猝滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。SYBR熒光染料在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染

25、料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，雙鏈越多，嵌入的SYBR染料越多；而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。用SYBR染料比較方便而且成本低，但在模板濃度較低時(shí)，引物二聚體作用影響較大。目前主要采用的還是TaqMan熒光探針。9.5.3 基因芯片 DNA芯片，又稱DNA微集陣列，因?yàn)樵谖⒓嚵械闹苽溥^程中采用了硅芯片，所以稱為DNA芯片或基因芯片。DNA芯片技術(shù)起源于核酸分子雜交，于20世紀(jì)80年代提出，90年代初期迅速發(fā)展。檢測原理 DNA芯片是指應(yīng)用大規(guī)模集成電路的微陣列技術(shù)，在固相支持物如硅、尼龍膜表

26、面，有規(guī)律地合成數(shù)萬個(gè)代表不同基因的寡核苷酸“探針”或液相合成探針后由點(diǎn)陣器有規(guī)律地點(diǎn)樣于固相支持物表面，然后將要研究的目的材料中的DNA、RNA或cDNA用同位素或熒光物質(zhì)標(biāo)記后，與固相支持物表面的探針進(jìn)行雜交，通過放射自顯影或熒光共聚焦顯微鏡掃描，利用計(jì)算機(jī)對(duì)每一個(gè)探針上的雜交信號(hào)作檢測、分析，從而反映所用材料中大量基因的信息。9.5.4 ELISA方法ELISA檢測蛋白質(zhì)具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、定量檢測等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測轉(zhuǎn)基因成分主要是檢測轉(zhuǎn)入的外源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的蛋白，如抗草甘膦Roundup Ready大豆、抗草甘膦油菜中CP4 EPSPS編碼的5-莽草酸-3-磷酸合成酶等。對(duì)于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物原料的檢測，采用ELISA方法不僅能得出定性結(jié)果而且能得出定量結(jié)果。缺點(diǎn)：由于ELISA只能檢測外源目的蛋白和一些選擇標(biāo)記基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，檢測覆蓋率低；由于檢測極限問題，應(yīng)用范圍不如PCR方法廣泛；由于蛋白質(zhì)易變性，ELISA不能檢測高溫加工或深加工產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分。9.5.5 PCR-ELISA方法將PCR高靈敏性和高效性與ELISA的高準(zhǔn)確性相結(jié)合，對(duì)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用ELISA方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。本方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分的檢測，不僅能檢測目的基因，也能檢測篩選基因如C