免疫組織化學(xué)技術(shù)綜述

1、精選文檔精選文檔肅PAGE68蝕蝕蒈薁螅蚃膃芅肁羈羆蒄薄袈芃螀蒂螄蚈肅薇螈莃羈蒞肂肅羇肂蚈腿罿螅蚅薃薆袀薈艿膀膆袃芅膅蕿蒈荿莁薇蒅螃螄螞蒈葿螞螄螃蒅薇莁莈蒈蕿?zāi)g羈袃膆膀艿薈袀薆薃薅聿膃蒃蚈蒞羇肅肅蚈羂莃螈節(jié)莈蚇螄羋螁芃袈薄蒄羆節(jié)膁葿膃羈螅裊蒈羄螀薂肅肈羆芆螆莂艿莁羃肈羃蚇羋膄袈肀羄膇膄肈薆薂螁膃襖芇蒅膅莂芄蚄袂肈莇袀蚆蝕羆芄蟻羈蕆袈肇芃蒃袃蒀薄薇聿蒈薁膅蒂蒂蒄蚇莀薄肅蚃芅芁莄蚇芇羅莁蒞襖螆莄螆薈肂袃蕿蒃蝿芅袆蝿蒃膁芁肂薈葿羆芄襖螃蠆艿芇荿肆節(jié)肁芅蒁衿肆艿膆蒃蒂薄袈蒈聿腿芆蚄袂肆薀肇袇聿芆蟻芃莄肈薆蚆罿莆袂莀蒅螀羈蒅葿蒅螞螁螃羋薇蒈荿薅袃膂芅羀膆芇艿蚅袀薃薃莈螆羆腿螅肂羄肆膀蒞聿聿裊芃膁莄袁羋螇

2、芃裊薄薁膀艿肁薆膃羅螅羂蒈羈蝕蒞肄肅羆聿肀膅艿肄羄袀芇膆羋袇膂袃羄羀膄薇薆蒞螁螞襖肀蝕羈莃肇蚅蚅肈膀袁荿蟻薄芄蒄羈芀袈螀芃芆袃膂袈莀聿羆蒁蚄蚆羈螈莀莀莇肅蒆芅肄蠆蒀裊螈薅襖膈螃袃蕿螂腿膇薆螇薂螃蠆肄薀蒅肄蟻薅蚃蝿芅蚇羈螆芀莄薃衿蒆肈芆蕆衿膃蒃罿蒃蒈肂蟻螞蚇蒃螅羈蚅莀莃芁蝕莄裊腿螂袂袁膄葿芄襖膆膃膀薃螃膈膄羋莇薄螂羈莃芁肄莈袃羅芅螃膆羀羋蒈肄莆薃膁聿蝿膈薈肁蒃肅袂蚈薇肈薈節(jié)袃莃莀芇薀罿蚈薃芄羅肂袆荿罿螈螄蚅蕆薀蝿膈肅袇羅袂聿節(jié)薃袇肅蚃芇罿莈蒆膂蚆羃螃蒈莀袀膈螁蒅袃袃蒅螁膈薅莀膄肇羃羀膂羃莇節(jié)芆羇肅膀莈芁聿膅羅袇肅膇蝿螃蕆羈螄肁膃蚃膀蒞腿薈薃羈節(jié)襖薁袈蚇膇薆袁莂肅蚈膆荿肀蒞螁蒂肂聿蒄袇蠆肄蟻薂芃膆

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4、薀蒆蕿肆襖蒂蒄蒈蒀薆螀蒆膂羀莈蒁莀蚆羂薃蚄螞羇芀莀螆膃羄羃莄薆聿芀螅膀蒞薅袂荿薄膀蟻蚅蒂肇芀羈薇肀蟻袆蠆蠆螈袁莆羈螁袃肀袇葿蒀肅袁膅肄蒀葿袇聿膇螁芅莆袁螇蠆羃袆羅蒞袁節(jié)芀肇螆蚅裊蒞螈荿袂蝿蒞蒄螅芀聿薆肀羃羄膃螅芀芀羇螞蚅薃羂蚆莀蒁莈膄膂蒆螁袀蒀螞蒄螆襖艿葿螀薀羄裊肄莂衿薂蝕蝕膅芆薇肄蒈莁薀螀膂蚇裊蒂肇袆螄薅蚇螄蟻羀羀衿蚄蚅袈羈罿螞袃蚈薅螅裊莂蒁膀蒂莇蒅裊肆螃蝿袁芅膅蠆裊薂膃薅艿裊膈蕿羅螃芀襖羈螈羇葿肅螀蟻膂膅莇蒂荿袀羈袈蚄袇羆蒅荿羀蒆艿芆蒞蝿芄蒄肀蒃蝕螈肇莈肅蒄膀蚄螇肆薄芁螂莄芀裊膈蚈芆袁襖芄莀膇薈羆蚄葿蚃膃膆膃蚅蒈膂肈膈肅芅莄肆螆薀羈膁羃芅薅芃羋莂薀羀羃蒞袆蚄薆肄腿蠆肈蒅肇肅莂蒂羂蒈螄薅羋蒆

5、蝕芃薁蒁蚄蚅蒀薃節(jié)螞蒅芀薄螆蕆羄薁莄肄聿蒄肀蚈蒞莇袂羇肂蚈腿膃螆薅薄薆袁薈艿蒄膇袃羂荿薀葿荿莁莄蒅蚄羈荿葿荿螞蒁羇袇袁膈薃芅膈袁蕿蠆蒁袆薃蒞肅節(jié)袈肇肀蚅蒃蒞莆荿莀蝿袃蒄莃蒅薇螀袂芇螆蕆薇薄肂膁蒄罿蒞芆蒈莀聿莈螂膃羄螁莈蒀芀蝿芄襖薃螄羋薀蒂袆薂薆蟻薂蒂蝕蚃芆荿肄芀芁莂螀羄蚇蚇螆衿肀節(jié)袀膅肈腿膄蒈衿膂蚅莆羈蕆螞蚅蚈莇螅蚇莂聿肀芄莇芇螅袈螃薁袂袃蒀膇裊肀膄衿艿蒃腿膇羅肇薄蒂羈肂羇芁肅薂蟻羄膅腿蒂膁袁螃袈蒆袇螈蒅膁羀肄艿螄蒞莇芄肂肀羈蝕莆肇蒅肅蒁膀螁肁膃薅莈肆蚅芀芇膈羀芆膂裊薅肆蒈芄羋蚄螁荿蒅膆蒅蚅螀膂莀膈蒞芆羀肆莂襖芃膁芅精選文檔免疫組織化學(xué)（免疫組化）技術(shù)利用抗原抗體的特異性結(jié)合反響來(lái)檢測(cè)和定位組

6、織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)的一門(mén)技術(shù)，它是免疫學(xué)和傳統(tǒng)的組織化學(xué)相結(jié)合而形成的，這類(lèi)技術(shù)稱(chēng)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistryIHC）或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）。其特色是將形態(tài)學(xué)改變與功能，代謝變化結(jié)合起來(lái)，直接在組織切片，細(xì)胞涂片或培育細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)或多肽物質(zhì)的存在，并可精確到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平，結(jié)合電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚焦顯微術(shù)等技術(shù)，可對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。第一節(jié)免疫組化的發(fā)展史及應(yīng)用自1941年Coons及其同事開(kāi)創(chuàng)免疫組織化學(xué)技術(shù)以來(lái)，拌隨免疫學(xué)和組織化學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，免疫組織化學(xué)已發(fā)生了日異月新的變化。以下表免

7、疫組化的發(fā)展過(guò)程年代研究者事件1941Coons適用免疫螢光技術(shù)1948Fagraeus進(jìn)一步發(fā)展免疫螢光技術(shù)1970Sternberger抗體酶標(biāo)技術(shù)1974Taylor證明組織中漿細(xì)胞免疫組化1975Kohler單克隆抗體技術(shù)（被成為免疫學(xué)上的一場(chǎng)革命，Milstein也令人類(lèi)第一次獲取了能依據(jù)人的意志在體外產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞）。1981HsuABC法1990到現(xiàn)在SP法、原位雜交免疫組化技術(shù)因?yàn)槊庖呓M化擁有特異性強(qiáng)、矯捷度高等明顯特色，且能將形態(tài)與功能研究有機(jī)的結(jié)合在一起，所以，這門(mén)技術(shù)從一出生起就顯示出了強(qiáng)盛的生命力和廣闊的應(yīng)用遠(yuǎn)景，當(dāng)今它已被廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的好多領(lǐng)域，

8、推動(dòng)了學(xué)科的發(fā)展，獲得了令人矚目的成就。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用跟著大批商品化的單克隆和多可隆抗體出現(xiàn)，配套試劑盒的使用及方法的不停完美，使免疫組化染色已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和病理外檢中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一。免疫組化可用于各種蛋白質(zhì)或肽類(lèi)物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)，細(xì)胞屬性的判斷，淋巴細(xì)胞的免疫表型分析，細(xì)胞增殖和凋亡的研究，激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)檢測(cè)，以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等。在病理學(xué)研究中，免疫組化技術(shù)的作用和意義更重要。以腫瘤研究為例，在免疫組化技術(shù)出現(xiàn)以前，對(duì)腫瘤的診斷和分類(lèi)還限制于細(xì)胞水平，而引入免疫組化技術(shù)后，則使研究的深度提升到了生物化學(xué)水平、分子水平。最近幾年來(lái)，拌隨基

9、因探針研究而流行的核酸分子原位雜交技術(shù)也正在蓬勃發(fā)展，更使免疫組化如虎生翼，二者相輔相成，將研究推動(dòng)到了基因水平。愈來(lái)愈多的癌基因與抗癌基因1的發(fā)現(xiàn)不但有助于對(duì)腫瘤發(fā)活力制的商討，并且使腫瘤的預(yù)防，初期診斷，甚至治療都向前邁進(jìn)了一大步，為人類(lèi)征服癌癥代來(lái)了希望的曙光。在外國(guó)，病理診斷免疫組化開(kāi)始于70年代，80年代發(fā)展至巔峰，90年代已列入病理技術(shù)室常例工作。在國(guó)內(nèi)，免疫組化到90年代才開(kāi)始在病理診斷中逐漸普及。第二節(jié)免疫組化的基本源理基本源理：眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合擁有高度的特異性。免疫組織化學(xué)正是利用這一特征，即先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提拿出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，經(jīng)過(guò)免疫

10、后獲取特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。反之亦然。因?yàn)榭贵w與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無(wú)色的，所以，還一定借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反響部位顯示出來(lái)，以期達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性、定位甚至定量的研究。如前所述，免疫組化主要涉及免疫學(xué)和組織化學(xué)的有關(guān)理論和技術(shù)，此中要點(diǎn)在于制備高效的抗體，后者又主要取決于抗原的質(zhì)量。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。在抗系統(tǒng)備上，經(jīng)歷了從抗血清，純化IgG到單克隆抗體，甚至發(fā)展到應(yīng)用基因重組技術(shù)獲取分子量較小的特異性片段。就

11、單克隆抗體而言，它是在1975年由Kohler和Milstein成立了雜交瘤技術(shù)后才開(kāi)始問(wèn)世的，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于研究中，它擁有更好的特異性，大大地提升了免疫組化的技術(shù)水平。顯示技術(shù)的發(fā)展也相當(dāng)迅猛，初期不過(guò)簡(jiǎn)單的將標(biāo)志物結(jié)合在抗體上，今后則發(fā)展到將標(biāo)志物結(jié)合在抗抗體上或與抗體擁有特異親和性的分子上，用于標(biāo)志的物質(zhì)有好多種，如熒光染料、放射性同位素、酶、膠體金等。借助于熒光顯微鏡、光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡，即可觀察到這些標(biāo)志物發(fā)出熒光、酶促反響產(chǎn)生的有色積淀或高電子密度顆粒，從而觀察到抗原抗體復(fù)合物所再的部位。因而可知，免疫組化技術(shù)以其特異性和矯捷度高等特色，又因其操作比較簡(jiǎn)單而得以廣泛應(yīng)用。第三

12、節(jié)有關(guān)的免疫學(xué)理論抗原（antigen）：抗原應(yīng)具備的條件：異物性理化性質(zhì)特異性抗原的種類(lèi)：免疫原性與免疫反響性完好抗原2不完好抗原抗原與機(jī)體的親緣關(guān)系異種抗原同種異型抗原自己抗原抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)抗原多糖抗原核酸抗原低分子量物質(zhì)抗原合成多肽抗原抗原的理化性狀顆粒性抗原可溶性抗原抗原的制備：資料的準(zhǔn)備和預(yù)辦理組織的粉碎抗原的提取抗原純化抗原純度的檢測(cè)半抗原的免疫原制備法抗體（antibody）是機(jī)體受抗原刺激后，由B淋巴細(xì)胞，特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反響的球蛋白，稱(chēng)免疫球蛋白immunolobulin,Ig）,共有五類(lèi)：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要分布在血清

13、或外分泌物中?？贵w的分子結(jié)構(gòu)抗體的理化性質(zhì)抗體與抗原的特異性結(jié)合抗體的種類(lèi)抗體的抗原性：同種型抗體同種異型抗體獨(dú)到型抗體抗體的制備方法：多克隆抗體（血清抗體）指機(jī)體接受抗原的主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后，從血清中分別提純的抗體。單克隆抗體是1975年由Kohler和Milstein發(fā)明的一種新技術(shù)。3原理是將體外培育的骨髓瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞交融，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這類(lèi)交融的雜交細(xì)胞系既有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)窮生長(zhǎng)的能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。這類(lèi)免疫細(xì)胞經(jīng)過(guò)純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大批專(zhuān)一的高純度的抗體，既單克隆抗體。這一技術(shù)被稱(chēng)為免疫學(xué)上的一場(chǎng)革命，也令人類(lèi)第一次獲取了能依據(jù)人的意志在體外產(chǎn)生抗體的雜

14、交瘤細(xì)胞。（祥見(jiàn)圖解）4單克隆抗體與多克隆的特征比較見(jiàn)下表:單克隆抗體與多克隆的特征比較特征單克隆抗體多克隆抗體構(gòu)成單一類(lèi)的抗體多種類(lèi)抗體的混雜物特異性高，針對(duì)單一抗原決定簇低，針對(duì)多個(gè)抗原決定簇親合力不定，較低均勻親和力較高交織反響低高第四節(jié)免疫組化的基本技術(shù)依據(jù)標(biāo)志物（或示蹤物）不一樣可分為以下技術(shù)：免疫熒光組化技術(shù)免疫酶組化技術(shù)親合免疫組化技術(shù)免疫膠體金組化技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)還有兩重和多重標(biāo)志技術(shù)等。不一樣的免疫組化技術(shù)，各擁有獨(dú)到的試劑和方法，但其基本技術(shù)方法是相似的，都包含抗體的制備，組織資料的辦理，免疫染色，比較試驗(yàn)，顯微鏡觀察等步驟。(一)免疫熒光組化技術(shù)基本源理依據(jù)抗原抗體反響

15、原理，先將已知的抗體標(biāo)志上熒光素，制成熒光抗體，再用這類(lèi)熒光抗體作為探針與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗原結(jié)合，在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)志的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本（熒光素受熒光顯微鏡激發(fā)光的照耀而發(fā)出必定波長(zhǎng)的熒光），從而可確立組織中某種抗原的定位，從而還可進(jìn)行定量分析。分類(lèi)直接法間接法補(bǔ)體法兩重免疫熒光標(biāo)志法直接法用熒光標(biāo)志的特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（第一抗體）直接與標(biāo)本反響（染色），以檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原。如圖5特色：操作簡(jiǎn)單，特異性高，但敏感性低，且因?yàn)橐环N熒光標(biāo)志抗體只好檢測(cè)一種特異性抗原，所以應(yīng)用范圍較這窄。染色步驟:白臘切片常例脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或

16、培育細(xì)胞等資料經(jīng)合適固定。必需時(shí)用酶合適消化。用PH7.4PBS洗15分鐘。滴加經(jīng)合適稀釋的熒光抗體，室溫或37孵育箱內(nèi)孵育3060分鐘。用PBS洗3次，5分鐘/次。用50%甘油（用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制）封片熒光顯微鏡下觀察。間接法此法是直接法的重要改良，先用特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱(chēng)第一抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反響，隨后用緩沖液洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱(chēng)第二抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原抗體熒光抗體的復(fù)合物。如圖6因?yàn)榻Y(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體明顯多于直接法，從而提升了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合35個(gè)分子的抗體，當(dāng)此抗體

17、作為抗原時(shí)又可結(jié)合35個(gè)分子的熒光抗體，所以和直接法對(duì)比熒光明度可增強(qiáng)3或4倍。特色：特異性強(qiáng)，矯捷度高，應(yīng)用更廣，只要要制備熒光標(biāo)志的羊抗鼠或羊抗兔即可應(yīng)用于多種抗體（第一抗體）的標(biāo)志顯示。染色步驟：白臘切片常例脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或培育細(xì)胞等資料經(jīng)合適固定必需時(shí)用酶合適消化。用PH7.4PBS洗15分鐘。滴加經(jīng)合適稀釋的未標(biāo)志一抗，在室溫或37孵育箱內(nèi)孵育3060分鐘。用PBS洗3次，5分鐘/次。滴加熒光標(biāo)志二抗，在室溫或37孵育箱內(nèi)孵育3060分鐘。用PBS洗3次，5分鐘/次。用50%甘油（用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制）封片熒光顯微鏡下觀察。補(bǔ)體法大多數(shù)抗原抗體復(fù)合物都能結(jié)合補(bǔ)

18、體。所以，在染色時(shí)先將新鮮補(bǔ)體與第一抗體混雜，同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37孵育后，如發(fā)生特異抗原抗體反響，補(bǔ)體就結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反響，形成抗原抗體補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物。如圖特色：只要一種熒光抗體，可適用于各種不一樣種屬本源的第一抗體的檢測(cè)。7染色步驟：白臘切片常例脫蠟至水。冰凍切片、涂片、印片或培育細(xì)胞等資料經(jīng)合適固定必需時(shí)用酶合適消化。用PH7.4PBS洗15分鐘。將抗血清60滅活20min，并作合適稀釋。將新鮮豚鼠血清（此中含有補(bǔ)體）稀釋10倍取等量抗血清和豚鼠血清混雜，滴加在切片上，將切片置37孵育箱內(nèi)孵育3060分鐘用PBS洗3次，5分鐘/次。滴

19、加經(jīng)合適稀釋的熒光標(biāo)志抗補(bǔ)體抗體，在室溫或37孵育箱內(nèi)孵育30分鐘。用PBS洗3次，5分鐘/次。用50%甘油（用PH9.0碳酸鹽緩沖液配制）封片熒光顯微鏡下觀察。）兩重免疫熒光標(biāo)志法在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí)要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?，一般均采納直接法。將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以合適比率混雜，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)志，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用四甲基異硫氰酸羅達(dá)明熒光素標(biāo)志，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種熒光抗原的定位。3比較實(shí)驗(yàn)與熒光抗體染色結(jié)果判斷（1）比較實(shí)驗(yàn)為了保證免疫熒光組織化學(xué)染色的正確性，除掉某些非特異性染色，一定在首

20、次試驗(yàn)（新抗體首次使用）時(shí)進(jìn)行以下比較實(shí)驗(yàn)。8免疫熒光染色的比較實(shí)比較設(shè)置直接法間接法抗補(bǔ)體法標(biāo)本自覺(jué)熒光比較陽(yáng)性比較熒光抗體比較克制試驗(yàn)補(bǔ)體比較自覺(jué)熒光組織不經(jīng)過(guò)熒光染色，在紫外光或短光波的照耀下，所呈的熒光稱(chēng)自覺(jué)熒光。一般自覺(jué)熒光較弱，多呈藍(lán)綠色或藍(lán)白色，簡(jiǎn)單與特異性熒光相差異。例：膠原纖維藍(lán)綠色彈力纖維藍(lán)綠色軟骨組織黃綠色心肌黃綠色紅細(xì)胞黃色標(biāo)本自覺(jué)熒光比較：標(biāo)本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光。（無(wú)與特異性熒光相似的熒光）陽(yáng)性比較：將以知陽(yáng)性標(biāo)本用免疫熒光組化技術(shù)染色（直接法、間接法、補(bǔ)體法）結(jié)果應(yīng)呈陽(yáng)性熒光。熒光抗體比較：除不加一抗外，其余染色步驟相同

21、，染色結(jié)果呈陰性熒光。（即標(biāo)本只加熒光抗體染色）克制試驗(yàn)：在加熒光標(biāo)志抗體前或同時(shí)，加入未標(biāo)志的相同抗體，染色結(jié)果呈陰性或熒光減弱。補(bǔ)體比較：取新鮮豚鼠血器清1：10稀釋?zhuān)茸饔脴?biāo)本，洗后再用補(bǔ)體熒光抗體染色，結(jié)果呈陰性。（2）特異性染色應(yīng)具備的條件染色只限于特異性抗原。不該被熒光素結(jié)合的非免疫血清染色。用未標(biāo)志的特異性免疫血清早先辦理標(biāo)本，則特異性染色被克制；而用不免疫的血清早先辦理，則不可以克制特異性染色。假如將熒光素標(biāo)志抗體第一用相應(yīng)的抗原充分汲取，則特異性染色被克制；而假如使用沒(méi)關(guān)的抗原進(jìn)行汲取則不可以克制特異性染色。4熒光抗體的制備熒光抗體的制備方法比較復(fù)雜，此刻已有各種熒光抗體銷(xiāo)售

22、，所以，在這我們不講。但大家要知道熒光色素的一些種類(lèi)，以便對(duì)免疫熒9光染色結(jié)果的觀察和判斷。目前主要常用的熒光色素有：1）異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）表現(xiàn)黃綠色熒光2）四已基羅達(dá)明（terraethylrodemineB200，RB200）表現(xiàn)光明橙紅色熒光3）四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）表現(xiàn)橙紅色4）4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸氏（SITS）呈藍(lán)色熒光熒光抗體的保存以04或-20地低保存6熒光顯微鏡：它是由超高壓光源，濾板系統(tǒng)（包含激發(fā)光和壓制濾板）和光學(xué)系統(tǒng)等

23、主要部件構(gòu)成。是利用必定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，經(jīng)過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。使用注意事項(xiàng)：1）嚴(yán)格依據(jù)熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓貢燈515分鐘，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)固后，眼睛完好合適暗室，再開(kāi)始觀察標(biāo)本。3）防范紫外線對(duì)眼睛的傷害。在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)帶上防范眼睛。4）檢查時(shí)間每次以12小時(shí)為宜，超出90分鐘，超高壓貢燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸降落，熒光減弱，標(biāo)本受紫外線照耀35分鐘后，熒光也明顯減弱或褪色，所以最多不超出23小時(shí)。5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)約時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)用電扇散熱

24、降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間，燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)防范數(shù)次點(diǎn)燃光源。6）標(biāo)本染色后馬上觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。最好是在略加觀察后即顯微拍照。將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防范封裱劑蒸發(fā)。7）載玻片厚度應(yīng)為0。81。2毫米之間，蓋玻片厚度在0。17毫米左右，標(biāo)本不可以太厚，因太厚會(huì)使激發(fā)光大多數(shù)耗費(fèi)在標(biāo)本的下部，而物鏡觀察到的上部不可以充分激發(fā)，其余細(xì)胞重疊會(huì)影響結(jié)果判斷。8）熒光明度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：（質(zhì)量控制和結(jié)果解說(shuō)）“”無(wú)或可見(jiàn)輕微自覺(jué)熒光“”僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)熒光“”可見(jiàn)光明的熒光“”可見(jiàn)刺眼的熒光10(二)免疫酶組織化學(xué)

25、技術(shù)（免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)）免疫酶組織（細(xì)胞）化學(xué)是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)。1基本源理：先以酶標(biāo)志的抗體與組織或細(xì)胞作用，而后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或擁有必定電子密度的顆粒，經(jīng)過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。常用標(biāo)志酶的種類(lèi)：辣根過(guò)氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP、ALP、AP）酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）目前，用的最多的酶是HRP，AKP用于標(biāo)志酶的要求：酶催化的底物一定是特異

26、的，且簡(jiǎn)單被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察。所形成的終產(chǎn)物積淀一定穩(wěn)固，即終產(chǎn)物不可以從酶活性部位向四周組織彌散，影響組織學(xué)定位。獲取的酶分子，最好有商品銷(xiāo)售。中性PH值時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)固，酶標(biāo)志抗體后，活性不該改變，且酶的活性越高越好。酶標(biāo)過(guò)程中，酶與抗體連接，不影響二者的活性。被檢測(cè)組織中，不該存在與標(biāo)志酶相同的內(nèi)源性酶此中1.,2.兩點(diǎn)最重要。因?yàn)椴⒉皇呛?jiǎn)單顯示的酶均有形成不行溶性的復(fù)合物。一般以為，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）較佳，是最常用的一種酶。酶標(biāo)抗體的制備及純化：略酶的底物及積淀顏色：見(jiàn)下表酶底物積淀顏色HRPDAB（3，3-二氨基聯(lián)苯胺）+H2O2棕色AEC（3氨基-9乙基卡巴

27、唑）+H2O2紅色AKPNBT(四氮唑藍(lán))+5嗅-4氯3吲哚-藍(lán)色磷酸鹽11免疫酶技術(shù)與免疫熒光技術(shù)不一樣在于：可用一般顯微鏡取代熒光顯微鏡，易于推行切片不易褪色，可長(zhǎng)遠(yuǎn)保存陽(yáng)性細(xì)胞定位精確，較易與非特異性反響鑒別，所以判斷簡(jiǎn)單，主觀性少組織結(jié)構(gòu)清楚，可與HE切片比較觀察可作免疫電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察2分類(lèi)：直接法間接法補(bǔ)體法免疫酶橋法免疫酶雙橋法過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶法（PAP）雙PAP法等1）直接法原理：用酶直接標(biāo)志在特異性一抗上，與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，讓酶催化底物反響產(chǎn)生有色產(chǎn)物，積淀在抗原抗體反響部位，即可在鏡下對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行檢測(cè)。長(zhǎng)處：簡(jiǎn)單，迅速，特異。弊端：敏感性差，標(biāo)志一種抗體只好檢

28、測(cè)一種抗原，所以應(yīng)用受限制。染色步驟：切片按免疫組化常例辦理0.3%H2O2甲醇。室溫1030分鐘必需時(shí)，如白臘切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分鐘，PBS洗120正常血清，室溫孵育15分鐘滴加合適稀釋的酶標(biāo)一抗，室溫或37，孵育3060分鐘12PBS洗3次，每次5分鐘加酶的底物溶液，510分鐘，顯微鏡下觀察，至特異性染色清楚，背景無(wú)染色時(shí)，停止顯色。蘇木素襯染，脫水，透明，封片。）間接法原理：在間接法中先用未標(biāo)志的特異性一抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)志的抗球蛋白抗體（二抗）結(jié)合，而后再加酶的底物顯示抗原抗體抗抗體復(fù)合物存在的部位，以抗衡原進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)弊端：提升了敏感性，并且用一種

29、酶標(biāo)志一種抗體即可檢測(cè)多種抗原，所以較直接法使用廣，但其較費(fèi)時(shí)，非特異性染色許多。染色方法：切片按免疫組化常例辦理0.3%H2O2甲醇。室溫，1030分鐘必需時(shí)，如白臘切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分鐘，PBS洗120正常血清，室溫孵育15分鐘滴加合適稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37，孵育3060分鐘PBS洗3次，每次5分鐘滴加合適稀釋的酶標(biāo)二抗于標(biāo)本上，室溫或37，孵育3060分鐘PBS洗3次，每次5分鐘加酶的底物溶液，510分鐘，顯微鏡下觀察，至特異性染色清楚，背景無(wú)染色時(shí)，停止顯色。蘇木素襯染，脫水，透明，封片。13以上兩種方法都是經(jīng)過(guò)化學(xué)方法將酶直接標(biāo)志在抗體上，所以通稱(chēng)

30、為酶標(biāo)抗體法。）酶橋法在酶標(biāo)志抗體過(guò)程中，酶與抗體的化學(xué)反響交聯(lián)過(guò)程可影響酶的活性和抗體的效價(jià)，同時(shí)產(chǎn)生非特異酶標(biāo)志抗體，可增添非特異性背景染色，為了防范上述弊端，接踵發(fā)展了酶橋法和PAP法。它們是以酶為抗原免疫動(dòng)物，產(chǎn)生抗酶抗體，經(jīng)過(guò)酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)志，屬于非酶標(biāo)志的抗體酶法。原理：先用酶作為抗原免疫動(dòng)物，制備效價(jià)高，特異性強(qiáng)的抗酶抗體，而后以二抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的一抗與酶抗體連接起來(lái)，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)酶的底物顯示出抗原的分布。如圖第一抗體（假設(shè)來(lái)自種屬A）孵育60分鐘，37。第一抗體的稀釋度可高些，使抗體的兩個(gè)Fab段均與組織抗原結(jié)合，較堅(jiān)固，振洗時(shí)不易拋棄

31、。切片與第二抗體（橋抗，抗種屬AIgG抗體）孵育1小時(shí)37。應(yīng)用過(guò)分的橋抗體能保證一個(gè)Fab段與第一抗體結(jié)合，另一個(gè)Fab段游離。切片與抗酶抗體（來(lái)自種屬A）孵育1小時(shí)37。因抗酶抗體和第一抗體均系種屬AIgG，擁有相同的抗原性，所以橋抗體游離的Fab能與抗酶抗體結(jié)合，起到橋的作用，將抗酶抗體結(jié)在與組織抗原結(jié)合的第一抗體上。切片與酶（HRP）孵育30分鐘，酶與抗酶抗體結(jié)合。顯色14優(yōu)弊端：在此過(guò)程中，任何抗體均未被酶標(biāo)志，酶是經(jīng)過(guò)免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合，防范了共價(jià)連接抗衡體和酶活性的傷害，提升方法敏感性，又能節(jié)約第一抗體的用量。但其最大的弊端是抗酶抗體一定高度純化。因?yàn)榭姑缚贵w中非特異性抗體

32、不可以與酶結(jié)合，但能與抗酶抗體競(jìng)爭(zhēng)橋抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而減少了抗酶抗體的結(jié)合，而大幅度降低呈色能力。其余，抗酶抗體的酶結(jié)合是低親和力的，沖洗時(shí)易拋棄而降低其敏感性。染色步驟：切片按免疫組化常例辦理0.3%H2O2甲醇。室溫，1030分鐘必需時(shí)，如白臘切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分鐘，PBS洗120正常血清，室溫孵育15分鐘滴加合適稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37，孵育3060分鐘PBS洗3次，每次5分鐘加合適稀釋的二抗，37或室溫，孵育30分鐘PBS洗3次，每次510分鐘加抗酶抗體，室溫或37，30分鐘PBS洗3次，每次510分鐘加酶溶液，37，孵育30分鐘酶的底物顯色襯染，脫

33、水，透明，封片。4）PAP法原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連接在組織抗原結(jié)合的第一抗體上，所不一樣的是先將抗酶抗體與酶結(jié)合制成酶抗酶復(fù)合物（PAP），PAP復(fù)合物中的抗酶抗體和第一抗體為同種屬動(dòng)物的IgG，所以橋抗體可以作為“橋”將PAP復(fù)合物連接在第一抗體上。如圖15PAP復(fù)合物：是離系統(tǒng)備的HRP抗HRP復(fù)合物，它的制備方法許多，在這不介紹。PAP復(fù)合物為五邊形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這類(lèi)結(jié)構(gòu)極為穩(wěn)定，沖洗時(shí)酶分子不會(huì)零落，從而大大提升了PAP法的矯捷度，約比免疫熒光法敏感1001000倍。比酶橋法矯捷20倍。優(yōu)弊端：矯捷度高，PAP背景染色低，但制備較復(fù)雜。染色步驟：切片按免疫組化常例辦理0.

34、3%H2O2甲醇。室溫，1030分鐘必需時(shí)，如白臘切片用0.1%胰蛋白酶消化，371030分鐘，PBS洗120正常血清，室溫孵育15分鐘滴加合適稀釋的特異性一抗于標(biāo)本上，室溫或37，孵育3060分鐘PBS洗3次，每次5分鐘加合適稀釋的二抗，37或室溫，孵育30分鐘PBS洗3次，每次510分鐘加PAP復(fù)合物，室溫或37，孵育30分鐘PBS洗3次，每次510分鐘酶的底物顯色襯染，脫水，透明，封片。5）雙PAP法：原理：在PAP法的基礎(chǔ)上重復(fù)滴加1次二抗和PAP復(fù)合物，結(jié)果使抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合比PAP法更多的酶分子，從而更進(jìn)一步增強(qiáng)了敏感性。雙PAP法連接機(jī)理尚不清楚，可能是第一次PAP中還留有未

35、完好結(jié)合的位點(diǎn)。優(yōu)弊端：雙PAP法比PAP法更敏感，但步驟許多，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，故不常用。（三）免疫膠體金技術(shù)1971年，F(xiàn)aulk和Taylor第一報(bào)導(dǎo)應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)研究細(xì)胞表面抗原的分布，今后開(kāi)創(chuàng)了免疫組織化學(xué)研究的新領(lǐng)域，即免疫金技術(shù)（immunogoldtechnique）。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特別的金屬顆粒作為標(biāo)志物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)固地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性沒(méi)有明顯的影響。所以，用膠體金標(biāo)志一抗、二抗或其余能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定性、定位、甚至定量研究。因?yàn)槟z體16金有不一樣大小的顆粒

36、，且膠體金的電子密度高，所免得疫膠體金技術(shù)特別合適于免疫電鏡的單標(biāo)志或多標(biāo)志定位研究。因?yàn)槟z體金自己呈淡至深紅色，所以也合適進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀增強(qiáng)的免疫金銀法規(guī)更便于光鏡觀察。1）膠體金的看法：膠體金是指由直徑為1100nm范圍內(nèi)的金顆粒所構(gòu)成的分別系，即金以或大或小的細(xì)小粒子分別在另一種物質(zhì)中所形成的系統(tǒng)。平常所說(shuō)的膠體金是指以細(xì)小的粒子分別在水中所形成的金溶膠。2）膠體金的理化性質(zhì)顏色：與粒子的大小有關(guān)，如15nm的膠體金為紅色，而95nm的膠體金則為藍(lán)色。一般用于免疫組化的膠體金顆粒直徑范圍在560nm，均呈紅色，但顆粒越小，紅色越深。穩(wěn)固性：膠體金可以在相當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)保持其溶膠不變。

37、膠體金的穩(wěn)固性受多種要素的影響，此中最主要的是電解質(zhì)，其次還與濃度、溫度等有關(guān)。電解質(zhì)：少許的電解質(zhì)對(duì)膠體金的穩(wěn)固性有促使作用，但過(guò)量的電解質(zhì)常以致穩(wěn)固性破壞而使膠體金凝聚。膠體金濃度：濃度越高，金顆粒之間的距離越近，簡(jiǎn)單以致金顆粒的凝聚。溫度：一般狀況下，溫度對(duì)膠體金的穩(wěn)固性影響不大，但長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)使膠體金的穩(wěn)固性稍有降落。大分子物質(zhì)：大分子物質(zhì)對(duì)膠體金的穩(wěn)固性影響比較復(fù)雜，在必定條件下，加入大分子物質(zhì)可以使膠體金的穩(wěn)固性大大增強(qiáng)，抗衡某些影響膠體金穩(wěn)固要素的作用，如高濃度的電解質(zhì)等。帶電性：膠體金屬憎水性膠體，金顆粒四周包圍了大批吸附離子所形成的靜電層，帶負(fù)電，可在電場(chǎng)中泳動(dòng)。3）膠體金的

38、制備：可用多種方法制備膠體金，此中應(yīng)用最多的是化學(xué)還原法。基本源理：是在氯化金水溶液中加入必定量的還原劑，使金離子還原為金原子。常用的還原劑有檸檬酸鈉，鞣酸和白磷。此中，檸檬酸鈉還原制備的金顆粒直徑較大，為15150nm，白磷還原制備的金顆粒直徑較小，為312nm。4）膠體金探針的制備略5）免疫膠體金染色方法：免疫金法免疫金銀法免疫金法（immunogoldstaining，IGS）免疫金法可分為直接法和間接法兩種。一般多采納間接法。171、直接法將膠體金標(biāo)志的一抗直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，而后在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察。這類(lèi)方法特別簡(jiǎn)單，但因?yàn)橐环N探針只好研究一種抗原，所以比較受限制。用膠體金標(biāo)志的單

39、克隆探針，進(jìn)行兩重或多重染色成效比較好。2、間接法是指先將未標(biāo)志的特異性一抗與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，而后用金標(biāo)的二抗與一抗結(jié)合，在光鏡或電鏡下抗衡原的分布進(jìn)行定位研究。染色步驟：（以人肝組織HbsAg的定位為例）白臘切片、脫蠟至水1%胰蛋白酶消化10分鐘用雙蒸餾水洗5分鐘2用TBSPH8。2洗5分鐘21%卵蛋白（EA）封閉10分鐘稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體，3712h,4冰箱過(guò)夜TBSPH8。2洗10分鐘21%EA封閉10分鐘TBSPH8。2稀釋兔抗鼠金標(biāo)志抗體3745分鐘TBSPH8。2洗10分鐘2雙蒸餾水洗5分鐘210%戊二醛，10分鐘雙蒸餾水洗5分鐘蘇木素襯染核，甘油封片結(jié)果：在鏡下可見(jiàn)部

40、分肝細(xì)胞漿內(nèi)有金顆粒齊聚呈紅色，沿細(xì)胞膜分布，表示有HBsAg定位在細(xì)胞漿內(nèi)。18免疫金銀法（immunogoldsliverstaining，IGSS）基本源理：1983年Holgate等人將IGH與銀顯影方法相結(jié)合立。經(jīng)過(guò)免疫反響積淀在抗原地址的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對(duì)苯二酚還原劑將銀離（Ag）子還原成銀原子（Ag0）。被還原的銀原子于是環(huán)繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成自己也擁有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使銀殼越長(zhǎng)越大，最后抗原地址獲取清楚放大。染色步驟：白臘切片、脫蠟至水lugol液，5min5%硫代硫酸鈉水溶液脫碘5min雙蒸餾水沖洗干凈TBSPH7.4洗

41、5min21%胰蛋白酶消化10min用TBSPH7.4洗5min21%卵蛋白（EA）封閉10min稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體，37孵育12h或4冰箱過(guò)夜TBSPH7.4洗5min21%卵蛋白（EA）封閉10minTBSPH7.4稀釋兔抗鼠金標(biāo)志抗體3745minTBSPH7.4洗5min2雙蒸餾水洗5min2物理顯影雙蒸餾水洗5min2蘇木素襯染核脫水、透明、封片19結(jié)果：光鏡下見(jiàn)肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有膜狀或包涵體形分布的陽(yáng)性黑色狀顆粒，背景干凈。顯影液配方：乳酸銀顯影液的配制10%阿拉伯膠水溶液60ml檸檬酸緩沖液PH3.510ml對(duì)苯二酚1g，加雙蒸水20ml溶解乳酸銀水溶液（100mg加水10

42、ml）以上四液臨用前挨次混雜、暗處顯影硝酸銀顯影液的配制10%阿拉伯膠水溶液60ml檸檬酸緩沖液PH3.510ml對(duì)苯二酚1.7g，加雙蒸水30ml溶解硝酸銀40mg，溶于蒸餾水2ml以上四液臨用前挨次混雜、暗處顯影6）免疫膠體金技術(shù)的特色膠體金制備簡(jiǎn)單制備膠體金所需設(shè)備和試劑均易獲取，制備方法也簡(jiǎn)單、快速標(biāo)志簡(jiǎn)單抗體等生物大分子很簡(jiǎn)單經(jīng)過(guò)界面物理吸附作用，與膠體顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)固的金標(biāo)復(fù)合物。因?yàn)闃?biāo)志過(guò)程中不需要經(jīng)過(guò)任何化學(xué)反響過(guò)程，所以標(biāo)志后生物大分子的生物學(xué)活性仍基本保持不變。敏感性高電鏡下，金顆粒的電子密度高，界限清楚，即即是單個(gè)的金顆粒也簡(jiǎn)單鑒別。所以免疫金電鏡的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出免疫酶

43、組織化學(xué)反響產(chǎn)物DAB，大大提升了免疫組織化學(xué)技術(shù)在電鏡水平的分辨率。光鏡下，金顆粒經(jīng)銀顯影后獲取放大，用于檢測(cè)組織細(xì)胞抗原時(shí)，其敏感性也高于其余方法。特異性強(qiáng)免疫金探針的非特異性吸附作用很小，較少受組織標(biāo)本背景要素的影響，在抗原抗體檢測(cè)中顯示出高度的特異性。定位正確因?yàn)榻痤w粒電子密度高，特色明顯，呈散在顆粒，不存在酶反響擴(kuò)散等缺點(diǎn)，所以免疫金技術(shù)定位正確。適應(yīng)性廣20膠體金既能用于一般光鏡觀察，也能用于透射電鏡，掃描電鏡，熒光顯微鏡觀察。標(biāo)本能長(zhǎng)遠(yuǎn)保存。易于兩重和多重標(biāo)志經(jīng)過(guò)控制條件可制備不一樣直徑的膠體金顆粒，將不一樣直徑的膠體金顆粒分別標(biāo)志不一樣的抗體和抗原，可以在一張切片上同時(shí)區(qū)分兩種

44、或兩種以上抗原或抗體的分布，因此特別適用于電鏡水平的兩重或多重標(biāo)（四）親和免疫組化技術(shù)親和組織化學(xué)（affinityhistochemistry）就是利用一些物質(zhì)之間的高度親特征，將酶等標(biāo)志物連接到抗原抗體復(fù)合物上，以對(duì)體內(nèi)的抗原（抗體）進(jìn)行檢測(cè)。事實(shí)上抗原抗體反響實(shí)質(zhì)上也屬于親和組化這一范圍，不過(guò)近代免疫組化方法的更新更突出了親和這一組化技術(shù)的特色。（因?yàn)榭乖贵w的結(jié)合其實(shí)是因?yàn)槎咧g擁有高度的親和性）擁有高度親和的物質(zhì)除了抗原抗體，還有植物凝聚素糖類(lèi)，生物素抗生物素，葡萄球菌A蛋白IgG，陽(yáng)離子陰離子，激素受體等。下邊以生物素抗生物素為例生物素（維生素H，biotin）是一種分子量244

45、Da小分子維生素?？股锼兀寻姿兀琣vidin）是一種糖蛋白，分子量為68KDa，由四個(gè)亞單位構(gòu)成。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，二者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)，生物素?fù)碛信c酶和抗體結(jié)合的能力，這樣抗生物素分子與多個(gè)生物素結(jié)合，生物素又可大批結(jié)合酶標(biāo)志物，起到多級(jí)放大作用，因此敏感性強(qiáng)。21舉例：ABC法（生物素抗生物素過(guò)氧化物酶復(fù)合技術(shù)，avidin-biotin-complextechnique）基本源理：利用上述生物素與抗生物素的特征，先將生物素與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合，形成生物素化的辣根過(guò)氧化物酶，而后與抗生物素按必定比率混雜，形成ABC復(fù)合物，用生物素化的二抗與一抗結(jié)合再與A

46、BC復(fù)合物結(jié)合，最后用底物顯色。如圖長(zhǎng)處：敏感性高ABC法與PAP法比較要高2040倍，這是因?yàn)樯锼嘏c抗生物素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，抗生物素同生物素結(jié)合有四個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一部分同生物素化的過(guò)氧化物酶結(jié)合，另一部分同生物素標(biāo)志的抗體結(jié)合。在ABC反響中，抗生物素作為橋連接與生物素標(biāo)志的酶和生物素標(biāo)志的抗體之間，而生物素標(biāo)志的過(guò)氧化物酶分子又可作為橋連接于生物素分子之間，于是形成一個(gè)含有三個(gè)以上過(guò)氧化物酶分子（大于PAP復(fù)和物）的網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物，敏感性極大提升。特異性強(qiáng)，背景染色淡方法簡(jiǎn)單，節(jié)約時(shí)間因?yàn)樯锼嘏c抗生物素?fù)碛信c多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于兩重或多重免疫染色。染色步驟：白臘切片脫蠟至水PBS

47、沖洗，5分鐘3次0.3%過(guò)氧化氫（H2O2）甲醇溶液，2030分鐘PBS沖洗，5分鐘3次1%胰蛋白酶消化PBS沖洗，5分鐘3次22正常血清孵育，30分鐘滴加第一抗體（特異性抗體），孵育60分鐘PBS沖洗，5分鐘3次滴加第二抗體，孵育60分鐘PBS沖洗，5分鐘3次滴加第三抗體（ABC復(fù)合物），孵育60分鐘PBS沖洗，5分鐘3次DAB顯色自來(lái)水沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片SP法：目前廣泛使用的親和免疫組化法是SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶連接法）?；驹蠢恚河面溍咕股锼氐鞍兹〈鶤BC復(fù)合物中卵白素（抗生物素）即形成SP法。鏈霉菌抗生物素蛋白是從鏈霉菌培育物中提取的蛋白，它和親和素（抗生物

48、素）相同，也存有四個(gè)生物素結(jié)合點(diǎn)，親和力很高（比卵白素蛋白親和力更高），所以比ABC法更敏感。染色步驟：同ABC法23外國(guó)其余公司也將SP法注冊(cè)為L(zhǎng)SAB法，SABC法。二步法：之所以稱(chēng)做二步法是因?yàn)樗怯每贵w和酶形成的聚合物來(lái)取代傳統(tǒng)“三步法”（ABC法、LSAB法或SP法）中的二抗和酶聚合物。因?yàn)槭÷粤艘环N試劑和相應(yīng)的操作步驟，加上這類(lèi)技術(shù)可以使背景染色特別干凈，傳統(tǒng)方法中的血清封閉也可去除，使得這類(lèi)方法變得更加迅速和易于使用。此技術(shù)的要點(diǎn)是在一條穩(wěn)固的氨基酸骨架大將多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶分子和抗體的Fab段（抗原結(jié)合片段）結(jié)合在一起形成多聚物。這類(lèi)聚合物中的Fab段對(duì)一抗擁有很強(qiáng)的親和性，而

49、多個(gè)HRP分子供給很高的矯捷度。此法之所以背景更加干凈，不不過(guò)是因?yàn)樗^少地使用了基于蛋白質(zhì)的試劑，更重要的是它不含生物素和鏈霉卵白素，并且使用的不過(guò)抗體的抗原結(jié)合片段，這就意味著可以完好防范內(nèi)源性生物素和抗體的Fc段可能造成的背景染色。第五節(jié)免疫組化染色過(guò)程中的基本技術(shù)免疫組化染色的基本源理就是抗原抗體的特異性結(jié)合。固然染色方法有多各種類(lèi)，但染色過(guò)程中都須要采納一些基本的技術(shù)方法，以增強(qiáng)抗原抗體特異性反響，降低或除掉非特異性反響，使染色結(jié)果達(dá)到最正確成效。1、抗原修復(fù)：蛋白酶消化技術(shù)01%胰蛋白酶04%胃蛋白酶微波辦理高壓高溫辦理電飯煲、鋁鍋辦理2、非特異性染色的控制正常血清作用240.3%

50、3%的雙氧水溶液3、比較實(shí)驗(yàn)免疫組化染色的步驟許多，所以影響染色結(jié)果的環(huán)節(jié)也好多。為了對(duì)染色結(jié)果作出正確的判斷，染色中，特別是在定位一種新的抗原或成立一種新的免疫組化方法時(shí)，有必需成立陽(yáng)性比較和陰性比較。用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本與待檢測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，并呈陽(yáng)性反響者為陽(yáng)性對(duì)照。反之，如用確立不含已知抗原的標(biāo)本作為比較，染色結(jié)果為陰性者稱(chēng)陰性比較。除此之外，空白、代替、汲取和克制實(shí)驗(yàn)等也是屬陰性比較。當(dāng)染色結(jié)果所顯示的是陽(yáng)性比較片呈陽(yáng)性，陰性比較呈陰性時(shí)，表示被檢測(cè)切片的標(biāo)志結(jié)果靠譜。免疫組化比較實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判斷標(biāo)本號(hào)檢測(cè)標(biāo)本陽(yáng)性比較陰性比較代替抗體比較結(jié)論1+-受檢標(biāo)本含抗原2-+-受檢

51、標(biāo)本不含抗3-操作錯(cuò)誤4+非特異性反響5+-+非特異性反響6+-陽(yáng)性比較差陽(yáng)性比較用已知抗原為陽(yáng)性的標(biāo)本與待檢測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色，并呈陽(yáng)性反響稱(chēng)陽(yáng)性比較。陰性比較確認(rèn)不含已知抗原的標(biāo)本作比較，染色結(jié)果為陰性者稱(chēng)陰性比較?？瞻妆容^、代替比較、汲取比較和克制實(shí)驗(yàn)也屬陰性比較?？瞻妆容^：用免去第一抗體或用緩沖液代替第一抗體，染色結(jié)果為（）。代替比較：用相同稀釋制備的第一抗體的動(dòng)物免疫前血清來(lái)代替第一抗體，染色結(jié)果為（）。汲取比較：用過(guò)分的已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反響，抗體結(jié)合點(diǎn)所有與抗原結(jié)合，這類(lèi)被抗原汲取的抗體不可以再與組織中的抗原反響，染色結(jié)果為（）。克制實(shí)驗(yàn)：待檢標(biāo)本先與未標(biāo)志的特

52、異性抗體反響后再與標(biāo)志的特異抗體進(jìn)行染色，結(jié)果明顯減弱或轉(zhuǎn)陰性。一般代替比較、汲取比較、克制實(shí)驗(yàn)主要用于證明某抗體的特異性。在病理科的平常診斷工作及科研課題時(shí)，只要設(shè)陰性比較和陽(yáng)性對(duì)照，一般不用設(shè)汲取比較和克制比較。4、抗體的分裝、稀釋、滴加及保存5、孵育方法及時(shí)間6、切片的清洗7、顯色8、襯染9、切片的脫水、透明、封片10、染色結(jié)果的判斷25細(xì)胞膜著色：例細(xì)胞核著色：例細(xì)胞漿著色：例細(xì)胞間質(zhì)著色：例第六節(jié)免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)免疫組化的染色方法雖有好多種類(lèi)，但有關(guān)染色的基本技術(shù)倒是相同的。它既有一般病理切片染色的基本要求，也涉及于抗原抗體特異性反響有關(guān)的特別要求。所以，免疫組織化學(xué)染色是一種

53、涉及多學(xué)科的綜合性技術(shù)。（一）取材實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、人體組織細(xì)胞和體外培育細(xì)胞都可作為免疫組化研究的資料。對(duì)于所取資料不但要保持組織細(xì)胞形態(tài)的完好，并且還要使抗原的抗原性不被破壞，一利于抗原抗體的結(jié)合。所以，在取材時(shí)要求做到正確、迅速、完好和擁有代表性，免得因取材不妥造成抗原拋棄或破壞，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類(lèi)好多，以狗、兔、大鼠和小鼠等為常用。取材前先常例麻醉或?qū)?dòng)物迅速處死，迅速取材。注意取材用的剪刀和刀片等要，所取資料不該太大，以厚度不超出3mm為宜。在取小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資料時(shí)，如先經(jīng)左心室主動(dòng)脈灌注固定，使灌注液迅速到達(dá)渾身，則固定更加充分。灌注固準(zhǔn)時(shí)先用小量生理鹽水迅速將血

54、液沖洗干凈，緊接著用4%多聚甲醛灌注，灌注速度先快后慢。人體資料1）在病理診斷和研究中，經(jīng)過(guò)活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及經(jīng)過(guò)各種方法所采集的細(xì)胞（如零落細(xì)胞、血細(xì)胞）等都可用于免疫組織化學(xué)研究。對(duì)于尸體解剖標(biāo)本則要視詳盡狀況而定。假如是死26亡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的標(biāo)本，因?yàn)榻M織發(fā)生自溶，抗原已變性或彌散、消逝，染色結(jié)果不必定能反響其實(shí)質(zhì)狀況。所以，尸體解剖標(biāo)本應(yīng)盡早取材固定，免得對(duì)研究結(jié)果造成影響。2）活檢標(biāo)本的取材活檢標(biāo)本的取材于體表、空腔臟器的內(nèi)壁或一些實(shí)質(zhì)性器官，如：皮膚、口腔、鼻咽、喉、胃、腎和肝等。取材常用活檢鉗鉗取，所取資料較小，并常因擠壓而變形。所以，在取材時(shí)應(yīng)注意：要求活檢鉗的刀口尖銳，以

55、減少對(duì)組織的擠壓；所取的部位要擁有代表性，特別是病變部位較大時(shí)。3）手術(shù)切除標(biāo)本的取材應(yīng)依據(jù)標(biāo)本的大小采納相應(yīng)的取材方法。對(duì)于小標(biāo)本的辦理，可先在固定液內(nèi)固定一會(huì)兒，再修切成適合大小連續(xù)固定。對(duì)于大標(biāo)本的辦理，基于抗原在組織中分布的差異，所以，所取資料要包含以下幾個(gè)部位：主要病灶；病灶與正常組織交界處；病灶四周的正常組織。4）細(xì)胞標(biāo)本的取材印片法馬上載玻片輕貼于裸露的病變區(qū)，使零落細(xì)胞粘附在玻片上，經(jīng)固定后即可用于染色。此法長(zhǎng)處是簡(jiǎn)單省時(shí)，細(xì)胞抗原也保存較好，弊端是細(xì)胞分布不均，甚至細(xì)胞重疊在一起，影響染色結(jié)果。主要適用于活檢和手術(shù)切除標(biāo)本。穿刺涂片法用穿刺針抽取病變區(qū)液體成分，直接或經(jīng)離心后

56、制成細(xì)胞懸液涂于載玻片上，固定、染色。此法主要應(yīng)用于實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞的采集，如淋奉承、肝、腎、肺等。體液細(xì)胞的制備制備細(xì)胞成分許多的體液標(biāo)本時(shí)，如血液、淋巴液、精液等，取少許液體直接涂片即可。對(duì)于細(xì)胞成分較少體液，如腹水、胸水、腦脊液等，方法之一是先用離心積淀法使細(xì)胞濃縮，制成細(xì)胞懸液，而后涂片；方法之二是用細(xì)胞離心涂片器直接涂片。3體外培育細(xì)胞標(biāo)本的制備培育細(xì)胞標(biāo)本的制備應(yīng)依據(jù)所培育的生物學(xué)特征采納不一樣的方法。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞等，可在培育瓶或培育板的底壁擱置載玻片，讓細(xì)胞在其上生長(zhǎng)，到時(shí)將載玻片拿出進(jìn)行固定染色即可。對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則可采納離心積淀

57、涂片的方法。為充分保存組織中的抗原，對(duì)所取標(biāo)本應(yīng)馬上固定包埋。假如臨時(shí)不固定章應(yīng)在低溫下保存?zhèn)溆??？杀４嬖诟杀?、液氮或低溫冰箱中。（二）固定固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完好，并盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。如果固定不及時(shí)或固定不妥，都可使組織結(jié)構(gòu)不清楚或特異性抗原不顯示，使結(jié)果沒(méi)法判斷。因?yàn)椴灰粯涌乖浞€(wěn)固性不一樣，不一樣固定劑的性能也各異，因此，研究者有必需認(rèn)識(shí)所要研究抗原的化學(xué)性質(zhì)，并依據(jù)需要選擇合適的固定劑和固定方法。選擇固定方法的原則是在保持組織形態(tài)完滿(mǎn)和被檢測(cè)抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固準(zhǔn)時(shí)間。固準(zhǔn)時(shí)間一般

58、為12h。（1）常用固定劑271、醛類(lèi)固定劑屬雙功能交聯(lián)固定劑，其作用是使組織之間相互交聯(lián)，將抗原保存在原位。此類(lèi)固定劑的特色是對(duì)組織的穿透性強(qiáng)，縮短性小。常用的有甲醛、多聚甲醛和戊二醛，可單種或多種固定劑結(jié)合使用。甲醛緩沖液：4%多聚甲醛磷酸緩沖液：戊二醛多聚甲醛磷酸緩沖液：Bouin液：PLP液（過(guò)碘酸賴(lài)氨酸多聚甲醛固定液）2、丙酮及醇類(lèi)固定劑丙酮和醇類(lèi)的固定原理主若是使組織中的蛋白質(zhì)和糖積淀。此類(lèi)固定劑的穿透力強(qiáng)，抗衡原保存較好，但對(duì)小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存成效較差。常與其余固定劑，如冰醋酸、乙醚和氯仿等混雜使用。液：Clzrke改良液：Carnoy液：丙酮：3、其余固定劑Zenker液：碳二亞酰胺戊二醛液：四氧化鵝（鵝酸）液：（2）固定注意事