第五章-微生物藥物產(chǎn)生菌的菌種選育課件

1、育種(strain improvement)是指為改善種質(zhì)對原出發(fā)菌株(作物)進行的遺傳操作。第五章微生物藥物的菌種選育 微生物藥物菌種選育的目的： 提高產(chǎn)量 組份優(yōu)化 新化合物的獲取育種(strain improvement)是指為改善種質(zhì)對基因突變是一切突變的內(nèi)因。任何代謝產(chǎn)物的生成均由遺傳因素所決定，產(chǎn)生菌遺傳物質(zhì)的任何變化，都有可能改變其產(chǎn)物的產(chǎn)量和性質(zhì)。微生物的生理條件、培養(yǎng)條件、發(fā)酵條件等在育種發(fā)面也有著重要作用?；蛲蛔兪且磺型蛔兊膬?nèi)因。1945時間194319431943195519711977目前發(fā)酵單位(U/ml)10025050085080002萬5萬510萬青霉素誘變史

2、1945時間194319431943195519711977微生物的潛力是無窮的。微生物的潛力是無窮的。我們今天所吃的大米，是人類長期以來用人工選擇、雜交、輻射誘變、化學誘變等方法改變了水稻“原生態(tài)”后生產(chǎn)出來的，是“人定勝天”的結(jié)果。我們完全可以利用現(xiàn)有的資源，創(chuàng)造出奇跡。我們今天所吃的大米，是人類長期以來用人工選擇、雜交、輻射誘變自發(fā)突變(spontaneous mutation)：自然條件下, 菌株也會發(fā)生遺傳或生理上的變化而造成產(chǎn)量的改變。突變有著正向和反向的差別。在無性繁殖的細菌中,突變率是用每一個細胞世代中每個細菌發(fā)生突變的概率，即用一定數(shù)目的細菌在一次分裂過程中發(fā)生突變的次數(shù)表示

3、, 約10-8。不同生物和同一生物個體的不同基因的自發(fā)突變率不同。自發(fā)突變因素:宇宙射線環(huán)境中的低濃度物質(zhì)溫度的改變自發(fā)突變(spontaneous mutation)：自然條腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亞氨基形式出現(xiàn)，而鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)的第六位可以酮式或烯醇式出現(xiàn)。平衡一般傾向與氨基和酮基配對，即DNA雙鏈一般以AT ,GC為主。自發(fā)突變的機理之互變異構(gòu)效應假說腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)的第六位可以氨基或亞氨基形式出現(xiàn)，如果A以亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA合成到達這一位置的瞬間，通過DNA多聚酶的作用，新合成的DNA鏈上的相對位置就是C，而不是T 。如T以稀有的烯醇式

4、形式出現(xiàn)，則錯配G，而不是A 。如果A以亞氨基形式出現(xiàn)，在DNA合成到達這一位置的瞬間，通過誘變育種(induced mutation):利用物理或化學誘變劑(mutagen)處理均勻分散的微生物細胞群，促進其突變率大幅度提高，然后設法采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選少數(shù)符合目的的突變株(mutant)，以供生產(chǎn)科研之用。 步驟：出發(fā)菌株誘變初篩復篩放大獲得優(yōu)良變異株。 誘變育種兩個主要的環(huán)節(jié)：誘變(induction)、篩選(screening) 經(jīng)典(常規(guī))育種：誘變育種誘變育種(induced mutation):利用物理或化學 出發(fā)菌株的選擇：處理細胞一般為單孢子懸液 誘變劑量

5、的選擇 誘變劑的種類：物理誘變劑，化學誘變劑，擬輻射物質(zhì) 誘變劑的選擇：簡便有效 出發(fā)菌株的選擇：處理細胞一般為單孢子懸液 誘變劑量的選擇 1927年,美國遺傳學家繆勒(H.J.Muller,18901967)首次發(fā)現(xiàn)用X射線照射果蠅精子后，果蠅后代發(fā)生突變的個體數(shù)大大增加。同年,又有科學家用X射線和g射線照射玉米和大麥的種子，也得到了類似的結(jié)果。 第二次世界大戰(zhàn)期間，科學家發(fā)現(xiàn)了第一個化學誘變劑芥子氣，開辟了化學誘變的新途徑。從此，利用各種物理的和化學的手段進行人工誘變的工作在世界范圍內(nèi)廣泛開展起來。誘變處理的興起 1927年,美國遺傳學家繆勒(H.J.Mull 高產(chǎn)突變株的篩選： 化合物抗

6、菌活性的瓊脂塊法 形態(tài)突變株的篩選： 去除色素，孢子等 自身耐藥突變株的篩選： 產(chǎn)量越高，對自身的抗性就越強 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選：去除反饋抑制 結(jié)構(gòu)類似物或前體類似物的篩選：選擇對其抗性水平高的變株，可解除反饋抑制而提高產(chǎn)量。突變株的篩選方案的設計 高產(chǎn)突變株的篩選： 化合物抗菌活性五、根據(jù)產(chǎn)物特點而設計實驗b-內(nèi)酰胺類抗生素可與某些金屬離子螯合而降低其抗菌作用。篩選對高濃度金屬離子有抗性的突變株，意味著提高濃度的b-內(nèi)酰胺類抗生素解除了金屬離子的毒性，即得到了高產(chǎn)菌株。五、根據(jù)產(chǎn)物特點而設計實驗b-內(nèi)酰胺類抗生素可與某些金屬離子淺藍菌素(cerulenin) 通過抑制聚酮體的前體 (也是

7、脂肪酸前體)小分子酸類的合成而抑制聚酮體類抗生素的產(chǎn)生，因此篩選在適當濃度的淺藍菌素瓊脂平板上的生長菌落即可能獲得高產(chǎn)菌株。將道諾霉素產(chǎn)生菌在一定濃度的淺藍菌素瓊脂平板上生長后，長出的菌落大多數(shù)因抗生素的生物合成被抑制而表現(xiàn)為無色，呈現(xiàn)紅色的即為產(chǎn)生抗生素的菌落，這樣獲得高產(chǎn)菌株的機率就得到提高。 淺藍菌素(cerulenin) 通過抑制聚酮體的前體 (也是 2004年1月13日，沃爾夫農(nóng)業(yè)獎由中國的袁隆平與美國康奈爾大學的塔克斯萊(Steven Tanksley)分享，以表彰他們“對雜交水稻所做出的開創(chuàng)性研究和發(fā)現(xiàn)雜交優(yōu)勢的基因原理”。袁隆平從實踐及推理中突破了水稻為自花傳粉植物而無雜種優(yōu)勢

8、的經(jīng)典觀念的束縛, 成為繼陳省身(沃爾夫數(shù)學獎)及吳健雄(沃爾夫物理學獎) 之后第三個中國人。 丘成桐, 2010 沃爾夫數(shù)學獎 2004年1月13日，沃爾夫農(nóng)業(yè)獎由中國的袁袁隆平屢獲國際大獎在于水稻是一種極為重要的農(nóng)作物，是由于其重大的經(jīng)濟價值，并不意味著中國在生物技術(shù)的開發(fā)和理論研究方面已走到了世界的前列。恰恰相反，在這些方面我們還與發(fā)達國家存在相當大的差距。袁隆平因為發(fā)現(xiàn)水稻雜種有優(yōu)勢，進而培育、推廣雜交水稻，但是雜交水稻為什么會有優(yōu)勢？水稻雜交優(yōu)勢的遺傳基礎是什么？這些更根本性的理論研究成果卻是坦克斯利做出的。這種理論研究具有更為重大的學術(shù)價值，將會對未來的應用開發(fā)產(chǎn)生深遠的影響。 袁

9、隆平屢獲國際大獎在于水稻是一種極為重要的農(nóng)作物，是由于其重菲律賓的國際水稻研究所已開發(fā)出的“金大米”，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓水稻制造胡蘿卜素(維生素A的前體), 有助于消滅在亞洲地區(qū)廣泛存在的維生素A缺乏癥。國外正在試驗用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻中鐵元素的含量，以減少亞洲婦女常見的貧血癥；將玉米基因轉(zhuǎn)入水稻中，大幅度提高水稻的產(chǎn)量和改良稻米的品質(zhì)等。 2005.3, 英國劍橋先正達種子公司(Syngenta Seeds)報道了第二代轉(zhuǎn)基因“金大米” 胡蘿卜素(防止失明)含量增加了20倍?！狈坡少e的國際水稻研究所已開發(fā)出的“金大米”，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓2009年，中國頒發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一個轉(zhuǎn)植酸酶基因玉

10、米品種，以及兩個轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻品種（世界上首次）的生產(chǎn)應用安全證書。引發(fā)公眾轉(zhuǎn)基因食品安全性大爭論。中國工程院院士范云六：轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米可以提高飼料的利用效率，減少飼料中磷酸氫鈣的添加量，降低飼養(yǎng)成本；減少動物糞、尿中植酸磷的排泄，減輕環(huán)境污染，有利于環(huán)境保護。此外，利用農(nóng)業(yè)種植方式生產(chǎn)植酸酶，還具有節(jié)能、環(huán)保、低成本的優(yōu)勢。 中國工程院院士張啟發(fā)：轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻不僅能有效控制螟蟲等鱗翅目害蟲危害，保障水稻增產(chǎn)，還能減少80%的化學農(nóng)藥用量。2009年，中國頒發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的一個轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米雜交和轉(zhuǎn)基因雜交是同種或近似種之間的交配，兩親不同但不至于差得太遠。這里關于種的定義是經(jīng)典的

11、生殖隔離，但是不必拘泥這個，騾子就是異種雜交的例子。雜交的特征是遺傳物質(zhì)都是在親本中已經(jīng)存在的，不同的組合造成不同的性狀。轉(zhuǎn)基因在本質(zhì)上不同 。以BT（Bacillus thuringiensis產(chǎn)生的可抵抗水稻抵抗螟蟲等蟲害的一種毒性蛋白，對人體無害）為例，沒有任何親本中有這個遺傳物質(zhì)，而是人為加入的。這個不是靠時間長短能由自然界替代的過程。有異種之間遺傳物質(zhì)傳遞的現(xiàn)象，但是很少，也不可預期。自然條件下，作物一般不能獲得轉(zhuǎn)基因的特性。雜交和轉(zhuǎn)基因科學地看待問題：基于科學知識，而非基于邏輯推論和有選擇性的所謂常識科學地看待問題：基于科學知識，而非基于邏輯推論和有選擇性的所經(jīng)典育種的黃金時代已經(jīng)

12、過去，現(xiàn)在以及未來屬于遺傳工程。 經(jīng)典育種的黃金時代已經(jīng)過去，現(xiàn)在以及未來屬于遺傳工程。 現(xiàn)代生物技術(shù)在微生物藥物育種中的應用理性菌種選育(Rational strain improvement)是指在對微生物藥物的分子水平的裝配、催化、調(diào)節(jié)等機理透徹了解的基礎上,有針對性地進行育種研究?，F(xiàn)代生物技術(shù)在微生物藥物育種中的應用是指在對微生物藥物的分代謝工程是指運用重組DNA技術(shù)通過對微生物細胞內(nèi)的酶、轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)等功能進行操作以提高細胞活性的現(xiàn)代生物技術(shù)。主要用于有價值的化合物的研究和開發(fā)，在能源、原材料 、治療用品的研究和開發(fā)等方面也起著重要的作用。運用于藥物的研發(fā)是一個新興的領域。代謝工程(m

13、etabolic engineering) 代謝工程超越了基因擴增和基因表達調(diào)控, 強調(diào)在整體水平對生物合成旁路的觀察、代謝旁路的重建、熱動力學的穩(wěn)定性、代謝物轉(zhuǎn)化的速率及其控制。這就將單個的酶反應轉(zhuǎn)向了整體的代謝旁路和生物轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡。代謝工程是指運用重組DNA技術(shù)通過對微生物細胞內(nèi)的酶、轉(zhuǎn)運和 合成異源代謝產(chǎn)物 擴大底物利用范圍 生產(chǎn)非天然的新物質(zhì), 如新型藥物 降解環(huán)境有害物質(zhì) 提高微生物對環(huán)境的適應能力 阻斷或降低副產(chǎn)物的合成 提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)率。應用領域 合成異源代謝產(chǎn)物應用領域金大米 從香葉基焦磷酸到b胡蘿卜素的生物合成需要八氫番茄紅素合成酶基因、植物八氫番茄紅素脫飽和酶基因、胡蘿卜素脫

14、飽和酶基因和八氫番茄紅素環(huán)化酶基因。Ye(2000) 使用來自歐文氏菌的八氫番茄紅素脫飽和酶基因（該基因能夠同時承擔植物八氫番茄紅素脫飽和酶基因和胡蘿卜素脫飽和酶基因的功能）替代了相應的兩個基因，使得酶促反應步驟由4個減少為3個。 金大米 Ye(2000) 使用來自歐文氏菌的八氫番茄紅素脫飽Bohmert等在擬南芥中同時表達了來自細菌的分別編碼3-酮硫裂解酶(3-ketothiolase) 、乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetacetyl-CoA reductase) 和PHA合成酶(PHA synthase)的三個基因，構(gòu)建了PHB的生物合成途徑，使得轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠大量產(chǎn)生本來沒有的PHB，葉

15、片中的含量達到鮮重的4%(約為干重的40%)。Slater等在擬南芥和油菜種子中表達上述三個基因的同時增加了一個來源于大腸桿菌的蘇氨酸脫氨酶(threonine deaminase)基因，在植物中構(gòu)建了新的生物合成代謝途徑，使得擬南芥和油菜能夠產(chǎn)生3-羥基丁酸酯與 3-羥基戊酸酯的共聚物 (poly 3-hydroxybutyrate-CO-3-hydroxyvalerate)。 生物塑料 Bohmert等在擬南芥中同時表達了來自細菌的分別編碼3-酮代謝工程正被運用于涉及抗生素生物合成的代謝旁路的操縱。產(chǎn)生菌的生物化學和生理學的知識也提供了直接改變代謝的合理基礎。有可能通過測量前體和中間產(chǎn)物的

16、代謝流以及鑒別限速步驟以用作遺傳操作的靶點。通過分析可將代謝流指向所需的代謝產(chǎn)物并消除不必要產(chǎn)物的生物合成。以模式菌株S. lividans建立了一個代謝流分析模型，目標是闡明次級代謝產(chǎn)物碳源分布的關系，對初級碳代謝進行操作以提高其抗生素的產(chǎn)生。代謝工程正被運用于涉及抗生素生物合成的代謝旁路的操縱。產(chǎn)生菌A. 提高微生物藥物的單位產(chǎn)量增加限速酶所編碼的基因的拷貝數(shù)：增加限速酶的拷貝數(shù)可能增加抗生素的產(chǎn)量。A. 提高微生物藥物的單位產(chǎn)量S. clavuligerus中自半胱氨酸，纈氨酸和賴氨酸產(chǎn)生頭孢菌素C S. clavuligerus中自半胱氨酸，纈氨酸和賴氨酸產(chǎn)自身抗性的增加意味著更多抗生

17、素的生成，如將氨基糖甙類抗生素的抗性基因 氨基糖苷-6-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化至卡那霉素和新霉素產(chǎn)生菌，轉(zhuǎn)化子對多種氨基糖甙類抗生素的抗性增加，而且卡那霉素和新霉素的產(chǎn)量提高了2-6倍。 引入抗性基因自身抗性的增加意味著更多抗生素的生成，如將氨基糖甙類抗生素的表達放線紫紅素的途徑專一性調(diào)節(jié)基因act-orf4, 基因的拷貝數(shù)增加了2倍，而抗生素的產(chǎn)量增加了30-40倍。調(diào)節(jié)基因的操縱 增加正調(diào)節(jié)基因的拷貝數(shù)阻斷負調(diào)節(jié)基因?qū)⒌乐Z霉素生物合成的調(diào)節(jié)基因dnrR1 和dnrR2以高拷貝的形式轉(zhuǎn)化至產(chǎn)生菌中，道諾霉素的中間體紫紅霉酮的合成量提高了十倍。表達放線紫紅素的途徑專一性調(diào)節(jié)基因act-orf4

18、, 基因的S. avermitilis可產(chǎn)生抗寄生蟲藥物多組份的阿維菌素(avermectin)，其中B1是主要的活性成分。Ikeda等使用誘變技術(shù)獲得了僅產(chǎn)B組份(B1a, B2a, B1b, B2b)的變株K2024, 和僅產(chǎn)A組份(A1a, A2a, A1b, A2b)的變株K2021。將這兩親本進行原生質(zhì)體融合后，獲得了只產(chǎn)B1a和 B2a 組份的融合株 K2038。B. 阻斷代謝旁路，增加有效成分的產(chǎn)量或改善組份的構(gòu)成進一步，他們利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)選擇性地敲除 S. avermitilis 中毒性化合物寡霉素的生物合成基因，所得菌株只產(chǎn)生阿維菌素。 S. avermitilis可產(chǎn)生

19、抗寄生蟲藥物多組份的阿維菌Formation of CHC-CoA in S. collinusGenetic organization of the genes for the biosynthesis of CHC unitC. 合理地設計產(chǎn)生有價值的天然產(chǎn)物的衍生物的生物合成旁路 Formation of CHC-CoA in S. colCHC unit is used for the biosynthesis of DoramectinCHC unit is used for the biosy不足之處不能提供或很少提供某些產(chǎn)物合成所需的前體物質(zhì) 沒有翻譯后修飾D. 構(gòu)建能產(chǎn)生中間體

20、或前體的基因工程菌大腸桿菌(E. coli)是最常使用的表達系統(tǒng):生長迅速(菌體倍增約為20分鐘)，發(fā)酵設備簡單，提取純化容易，工藝成熟。不足之處D. 構(gòu)建能產(chǎn)生中間體或前體的基因工程菌大腸桿菌(E6-dEB為 Sac. erythraea 產(chǎn)生的紅霉素的前體，原株中產(chǎn)量低 Sac. erythraea 和 E. coli相比較，發(fā)酵過程難以擴大化，菌體倍增時間長(4小時), 發(fā)酵和生產(chǎn)工藝需嚴格控制。大腸桿菌系統(tǒng)中表達DEBS產(chǎn)生6-dEB6-dEB為 Sac. erythraea 產(chǎn)生的紅霉素的前 如何表達正確折疊和翻譯后修飾的PKS。催化表達產(chǎn)生6-dEB的巨大的DEBS蛋白為兩個相同的

21、28個活性位點a2b2g2的二聚體, 有7個必需磷酸泛酰乙胺化的殘基。E. coli 沒有保證ACP的活性的磷酸泛酰乙胺化酶。 組成部件必需在E. coli 中有供應。6-dEB是由1個丙二酰CoA和7個(2S) -甲基丙二酰CoA (2S-mmCoA)作為骨架所組成的。E. coli 沒有 (2S)- mm CoA 。 為保證產(chǎn)生有效的細胞內(nèi)產(chǎn)生6-dEB的系統(tǒng)，DEBS在胞內(nèi)的活力必須與前體的生物合成相適應, 以對相關的立體化學和動力學參數(shù)進行最優(yōu)化。 如何表達正確折疊和翻譯后修飾的PKS。催化表達產(chǎn)生6-dE產(chǎn)6-dEB的工程菌E. coli BAP1的構(gòu)建基 因來 源備注Three D

22、EBS genesSac. erythraea插入Sfp (phosphopantetheinyl transferase)B. subtilis插入Propionyl-CoA carboxylaseS. coelicolor插入prpRBCD genes (丙酸代謝)內(nèi)源刪除prpE, birA genes (丙酸- mmCoA)內(nèi)源超表達產(chǎn)6-dEB的工程菌E. coli BAP1的構(gòu)建基 編碼6dEB合成酶的質(zhì)粒圖編碼6dEB合成酶的質(zhì)粒圖6-dEB的產(chǎn)量已達到紅霉素工業(yè)菌株的生產(chǎn)水平6-dEB的產(chǎn)量已達到紅霉素工業(yè)菌株的生產(chǎn)水平本實驗的成功是生物學諸多技術(shù)的綜合，它包含了對6-dEB分

23、子水平的催化，對E. coli 基因組和生理功能的了解等，強調(diào)了學科交叉的重要性。本實驗的成功是生物學諸多技術(shù)的綜合，它包含了對6-dEB分子抗生素的產(chǎn)生菌大多是好氧的，因此為保證其生長和有效地產(chǎn)生抗生素，必須保證氧氣的充足供應。在大規(guī)模的發(fā)酵種，常需要不斷地添加氧氣以滿足細胞生長和代謝。然而在培養(yǎng)基中，氧氣的溶解度低。工業(yè)上常通過改良生物反應器(如改變攪拌漿的形狀，增加檔板和攪拌功率）或增加通氣量，但這些設備的要求高，能耗大。E. 引入異源基因，改善培養(yǎng)和生產(chǎn)工藝血紅蛋白基因在放線菌中的應用 抗生素的產(chǎn)生菌大多是好氧的，因此為保證其生長和有效地產(chǎn)生抗生將從透明顫菌中考慮的血紅蛋白基因(vhb

24、) 轉(zhuǎn)至天藍色鏈霉菌發(fā)現(xiàn)，菌體可在限氧的條件下生長，而且其中放線紫紅素的產(chǎn)量增加了十倍。vhb在Sac. erythraea中表達，可將紅霉素的產(chǎn)量提高60%。 將vhb基因轉(zhuǎn)至頭孢菌素產(chǎn)生菌中，不僅提高了工程菌對氧氣的利用量，而且大幅度提高了抗生素的產(chǎn)量。 在好氧菌透明顫菌中發(fā)現(xiàn)血紅蛋白為氧氣攜帶者，能促進氧氣擴散到細胞末端的氧化酶上，這使得細胞在缺氧狀態(tài)下也可能良好生長。將從透明顫菌中考慮的血紅蛋白基因(vhb) 轉(zhuǎn)至天藍色鏈霉菌以DNA改組為代表的體外定向進化(directed evolution)定向進化不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機制, 通過模擬自然進化機制, 以改進的誘變技術(shù)結(jié)合

25、確定進化方向的選擇方法，在體外改造酶基因，定向選擇有價值的非天然酶。短期內(nèi)可以在試管中完成自然界需要幾百萬年的進化過程，是發(fā)現(xiàn)新型酶和新的生理生化反應的重要途徑。目的：增加酶的底物專一性、立體選擇性、比活、穩(wěn)定性、溶劑耐受性、增加pH范圍，以及這些特性的組合。以DNA改組為代表的體外定向進化(directed evolThe fundamental rule of directed evolution is you get what you screen forFrancis Arnold定向進化的根本規(guī)則是獲得你希望通過篩選得到的突變體The fundamental rule of dire

26、ct在待進化酶基因的PCR擴增反應中, 利用Taq DNA多聚酶不具有35校對功能的性質(zhì), 配合適當條件, 以很低的比率向目的基因中隨機引入突變, 構(gòu)建突變庫, 憑借定向的選擇方法, 選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶, 從而排除其他突變體。 定向進化的一般原理在待進化酶基因的PCR擴增反應中, 利用Taq DNA多聚酶在定向進化中, 盡管突變具有隨機性， 但通過選擇特定方向的突變限定了進化趨勢，加之控制實驗條件，限定突變種類， 降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進化速度。 定向進化 = 隨機突變 + 選擇 與自然進化不同, 定向進化是人為引發(fā)的，整個進化過程完

27、全是在人為控制下進行的。在定向進化中, 盡管突變具有隨機性， 但通過選擇特定方向的突DNA改組(DNA Shuffling)原理DNA改組(DNA Shuffling)原理項目進化速度進化對象進化周期影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化整個基因組多年完整基因組高DNAShuffling快速進化特定基因/操縱子/病毒幾天部分基因組低DNA Shuffling 與常規(guī)定向進化的比較項目進化速度進化對象進化影響對象突變效率常規(guī)定向進化緩慢進化 錯誤傾向性PCR (Error-prone PCR) 外顯子改組 (Exon shuffling) 點飽和突變 ( Saturation mutagenesi

28、s) 體外隨機引發(fā)重組( Random priming in vitro recombination) 交錯延伸( Staggered extension process) 區(qū)域化自我復制 ( Compartmentalized self replication) 體外隨機定位誘變 (Random site-directed mutagenesis)部分類似的和發(fā)展的方法 錯誤傾向性PCR (Error-prone PCR)部分類酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機相活性/穩(wěn)定性易錯PCR-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN穩(wěn)定性盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機相活性易

29、錯PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達DNA改組酶的體外定向進化應用實例 酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機相活性/穩(wěn)定性易錯PC改組的酶庫較天然酶的一個優(yōu)勢在于前者可能含有后者經(jīng)天然選擇壓力所不能表現(xiàn)出來的一些特性(或特性的綜合)。如對有著很高商業(yè)價值的 Savinase 酶進行改組時，挑取了654個克隆研究如pH、熱穩(wěn)定性、溶劑穩(wěn)定性等特征。發(fā)現(xiàn)12%的克隆在所有檢測的特征中均有提高。值得一提的是，有的克隆表現(xiàn)出了原株沒有的特點。同時發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定性最佳的的嵌合株與其他的相比，在序列上并不比與起始的熱穩(wěn)定株更近。這提示根據(jù)酶的序列來選擇起始改組的材料時必須慎重。改組的酶庫較天