PCR常見問題分析及對策

PCR常見問題分析及對策（無擴增產(chǎn)物、非特異性擴增、拖尾、假陽性）問題1:無擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無原因：模板：含有抑制物，含低Buffer，寸樣品合適引物設(shè)計當(dāng)或者發(fā)生解反應(yīng)條件：退火溫太高，延伸時間太短對策:純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用換Buffer或調(diào)整濃重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物低退火溫、延長延伸時間問題2：非特異性擴增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計的大小一致或者非持異性擴瑁帶原因：引物特異性差模板或引物濃過高酶過多Mg2+濃偏高退火溫偏低循環(huán)次數(shù)過多對策：重新設(shè)計引物或者使用巢式PCR適當(dāng)?shù)湍０寤蛞餄膺m當(dāng)減少酶低鎂離子濃適當(dāng)提高退火溫或使用二階段溫法減少循環(huán)次數(shù)問題3:拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。原因：模板純Buffer合適退火溫偏低酶過多dNTP、Mg2+偏高6,循環(huán)次數(shù)過多對策：純化模板換Buffer適當(dāng)提高退火溫適用隨適當(dāng)?shù)蚫NTP和鎂離子的濃減少循環(huán)次數(shù)問題4：假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)P的擴增產(chǎn)物原因：靶片或擴增產(chǎn)物的交*污染對策：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶片吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。各種試劑最好先進分裝，然后低溫貯存PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型規(guī)則甚致消失。假陰，性，出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)與特異性，③酶的質(zhì)及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白節(jié)沒有消化除凈，特別是染色體中的坦蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入所。⑤模板核酸變性徹底。在酶和引物節(jié)好時，出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處，模板核酸提取過程出毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處液，其程序亦應(yīng)固定宜隨意改。酶失潔：需換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的潔,性喪失或夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)、引物的濃、兩條引物的濃是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶想、容彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)有問題，兩條引物一條濃高，一條濃低，造成低效的對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃僅要看OD值，要注重引物原液做瓊脂凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物節(jié)的應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條節(jié)，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物高，一條低，在稀釋引物時要平衡其濃。③引物應(yīng)高濃小分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)解失效。④引物設(shè)計合，如引物長夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃：Mg2+離子濃對PCR擴增效影響很大，濃過高可低PCR擴增的特異，性濃過低則影響PCR擴增產(chǎn)甚至使PCR擴增失敗而由擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測同P的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模條件，否則容失敗。物原因：變，性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;遇火溫過低，可致非特異，性擴增而低特異性擴增效遇火溫過高影響引物與模板的結(jié)合而低PCR擴增效。有時還有必要用標準的溫計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變，性、遇火和延伸溫，這也是PCR失敗的原因之一。靶片變異：如靶片發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異，性結(jié)合，或因靶片某段缺失使引物與模板失去互補序，其PCR擴增是會成功的。假陽，性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與P的靶片條帶一致，有時其條帶整齊，高。引物設(shè)計合適：選擇的擴增序與非P的擴增序有同源，性，因而在進PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非P的，性的片。靶片太短或引物太短，容出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶片或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶片吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶片短，但有一定的同源，性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異,性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶片完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃過高、遇火溫過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的節(jié)和，往往一些來源的酶出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶冏出現(xiàn)，酶過多有時也會出現(xiàn)非特異，性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶或調(diào)換另一來源的酶。③低引物，適當(dāng)增加模板，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高遇火溫或采用二溫點法（93°C變性，65°C左右遇火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖節(jié)或涂抹節(jié)PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹節(jié)或片狀節(jié)或地毯樣帶。其原因往往由于酶過多或酶的節(jié)差，dNTP濃過高，Mg2+濃過高，遇火溫過低，循環(huán)次數(shù)過多引耙。其對策有：①減少酶，或調(diào)換另-來源的隨。②減少dNTP的濃。③適當(dāng)?shù)蚆g2+濃。④增加模板，減少循環(huán)次數(shù)。克PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是么？最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1:8或8：1也。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul2X連接液，50ng質(zhì)DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克要求，為提高連接效，需4oC過夜。PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條節(jié)，需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積大引物的二聚體。少的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比的帶有引物二聚體的克，而非P的插入片段。為此需在克前做凝膠純化。如果沒有回收到目的片段，還需要作么對照實驗？A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。如有菌，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)，計算菌生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效。如，將1ug/ul質(zhì)1:100稀釋，1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌。轉(zhuǎn)化為：產(chǎn)生菌的總數(shù)/鋪板DNA的總。鋪板DNA的總是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ngDNA，用SOC稀釋到1000u后含10ngDNA，用1/10鋪板，共用1ngDNA。轉(zhuǎn)化為：1000克X10（3次方）ng/鋪板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞如沒有菌或必有菌，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化太低。C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生＞20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染核酸酶。T4DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)標準好無核酸酶污染，應(yīng)用其它來源的T4DNA連接酶曹換。D）用pGEM-T或pGEM-TEasy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻感受態(tài)細胞（10（8次方）cfu/ug），按照指定的實驗步驟，可得100個菌，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生＞20-40藍斑，沒有菌或必有菌，連接有問題。對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出么問題？A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克，為提高效，需4oC過夜。B）插入片段帶有污染，使3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如低對照的菌數(shù)，插入片段需純化，或重新制音。如產(chǎn)生大的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy載體3'-T缺失。C）插入片段適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過照射，時有發(fā)生。UV過照射會產(chǎn)生嘧咤二聚體，于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-TEasy載體克所需。加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-TpGEM-TEasy載體技術(shù)資（TM042）。E）高重復(fù)序可能會穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞PCR疑難解答當(dāng)PCR結(jié)果甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)：將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70C“熱啟動開始循環(huán)時，記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中能均勻傳熱。要隨意減少dNTP的用，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。對于有問題的PCR反應(yīng)，如模板的少，模板純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進預(yù)變性，后加模板進正常PCR擴增。沒有擴增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯增加MgCl2濃；無MgCl2的緩沖液以0.5mmol/L為梯增加MgCl2濃。泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃補加MgCl2，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。檢查退火溫和變性條件，如果有需要的話，可低退火溫。檢查模板和引物的用。增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用。泳道中出現(xiàn)模糊條帶：減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用。提高退火溫，但要超過68笆。重新設(shè)計引物或設(shè)計長的引物。其他值得注意的條件：建議使用0.2-ml薄璧管。厚璧管在92°C時能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5?1ml）的酶在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/LMgCl2:350mmol/LdNTP或2.25mmol/LMgCl2：500mmol/LdNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃是必需的?；蛱笵NA模板的質(zhì)顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂凝膠電泳來檢測DNA的長。DNA片段長可以超過50kb傳統(tǒng)的基因坦DNA能擴增片段至10kb。要擴增長的片段應(yīng)使用超純或高分子的DNA。請查閱高分子DNA提取操作過程相關(guān)文獻。低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進長片段PCR擴增時，引物長一段為24~34個核苷酸，溶點在60?68C間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫來增加反應(yīng)的特異，性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異，性短片段優(yōu)先擴增的影響。變性：第一步變性在94C下進2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94C下進20--30秒），除非模板中富含GC，則95C下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷，對于所需擴增的基因坦DNA片段終長超過12kb時，應(yīng)該盡可能的低變性溫。延伸：68--72C下進延伸操作。循環(huán)延伸：盡采用循環(huán)延伸的條件，PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3-末端節(jié)有一個突出的A，因此建議采用T/A克。要進平端可，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進。測序時因酶的混合物帶有3—5外酶潔性，用Sanger方法進測序能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。引物設(shè)計：-般長20-30bp；至少50%的GC含；避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)；引物對的Tm值應(yīng)該接近。也可下列圖示提示找到解決問題的突破口PCR實驗操作程序在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列攜住程序加樣：反應(yīng)物加樣順序體積（ql）終濃度去離子水129.4ICxBufferB251x4xdNTP混合物35各2CCqmol/LMgCl%31.5mmol/L有義引物52.6C.25qmol/L反義引物62.6C.25qmol/L模板72C.lqgTaqDNA聚合酶80.4lunit用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加5Cql礦物油。每加一管換一次Tip振蕩每只管，然后短暫離心。將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：預(yù)變性94°C4分鐘1次變性94°C1分鐘退火37-65C1分鐘延伸72C1分鐘循環(huán)30次終延伸72C7分鐘1次保存4C將PCR產(chǎn)物進瓊脂凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80V,15-20分鐘。紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。四、討論假陰性，出現(xiàn)擴增條帶PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)與特異性，③酶的質(zhì)，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進分析研究。模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時丟失過多，或吸入所。③模板核酸變性徹底。在酶和引物節(jié)好時，出現(xiàn)擴增帶，有可能是模板核酸提取過程出毛病，可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板節(jié)。酶失潔：需換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的潔性喪失或夠而導(dǎo)致假陰性。引物：引物質(zhì)、引物的濃、兩條引物的濃是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶想、容彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)有問題，兩條引物一條濃高，一條濃低，造成低效的對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃僅要看OD值，要注重引物原液做瓊脂凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物節(jié)的應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條節(jié)，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物高，一條低，在稀釋引物時要平衡其濃。③引物應(yīng)高濃小分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱草，導(dǎo)致引物變質(zhì)解失效。④引物設(shè)計合，如引物長夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃：Mg2+離子濃對PCR擴增效影響很大，濃過高可低PCR擴增的特異性，濃過低則影響PCR擴增產(chǎn)甚至使PCR擴增失敗而由擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測同P的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模條件，否則容失敗。物原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫過低，可致非特異性擴增而低特異性擴增效，退火溫過高影響引物與模板的結(jié)合而低PCR擴增效。有時還有必要用標準的溫計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變，性、退火和延伸溫，這也是PCR失敗的原因之一。靶片變異：如靶片發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶片某段缺失使引物與模板失去互補序，其PCR擴增是會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCR擴增條帶與P的靶片條帶一致，有時其條帶整齊，高。引物設(shè)計合適：選擇的擴增序與非目的擴增序有同源性，因而在進PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的，性的片。靶片太短或引物太短，容出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶片或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽，性。這種假陽，性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶片吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次，性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶片短，但有一定的同源，性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴增帶PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶片完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃過高、退火溫過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的節(jié)和，往往一些來源的酶出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則出現(xiàn)，酶過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶或調(diào)換另一來源的酶。③低引物，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93°C變性，65°C左右退火與延伸）。出現(xiàn)片狀拖節(jié)或涂抹節(jié)PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹節(jié)或片狀節(jié)或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引耙。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的隨。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。PCR常見問題的精辟總結(jié)--耶魯大學(xué)TroubleshootingforPCRandmultiplexPCRTroubleshootingdiscussionisbasedonthePCRprotocolasdescribedinthetablebelow.Allreactionsarerunfor30cycles.COMPONENT1VOLUME1FINALCONCENTRATION11.autoclavedultra-filteredwater(pH7.0)20.7uL1-2.10xPCRBuffer*2.5uL|1x3.dNTPsmix(25mMeachnucleotide)0.2uL200uM(eachnucleotide)4.primermix(25pmoles/^Leachprimer)0.4jjL0.4uM(eachprimer)5.TaqDNApolymerase(nativeenzyme)0.2jjL1Unit/25uL6.genomicDNAtemplate(100ng/jjL)1.0uL100ng/25uL*The10xPCRbuffercontains:500mMKCl;100mMTris-HCl(pH8.3);15mMMggithefinalconcentrationsoftheseingredientsinthePCRmixare:50mMKCl;10mMTris-HCl;1.5mMMgCl2).SOLUTIONSQUESTIONS1.Iget(many)longerunspecificDecreaseannealingtimeproducts.WhatcanIdo?IncreaseannealingtemperatureDecreaseextensiontimeDecreaseextensiontemperatureto62-68°CIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mM.SOLUTIONSIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.TakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove

2.Iget(many)shorterunspecificIncreaseannealingtemperatureproducts.WhatcanIdo?IncreaseannealingtimeIncreaseextensiontimeIncreaseextensiontemperatureto74-78°CDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2concentrationat1.5-2mMIncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstantTakelessprimerTakelessDNAtemplateTakelessTaqpolymeraseIfnoneoftheaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLASTalignthesequencewiththedatabases)andchangetheprimer(s)Combinesome/alloftheabove3.Reactionwasworkingbefore,butMakesureallPCRingredientsaretakeninthereaction(buffer,nowIcan'tgetanyproduct.template,Taq,etc)ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing,especiallyinmultiplexPCR)Ifyoujustboughtnewprimers,checkfortheirreliability(badprimersynthesis?)IncreaseprimeramountIncreasetemplateamountDecreaseannealingtemperatureby610°Candcheckifyougetanyproduct.Ifyoudon't,checkallyourPCRingredients.Ifyoudogetproducts(includingunspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.Combinesome/alloftheabove4.MyPCRproductisweak.IsthereGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestawaytoincreasetheyield?possible.IncreasetheamountofPCRprimerIncreasetheamountofDNAtemplateIncreasetheamountofTaqpolymeraseChangebuffer(KCl)concentration(higherifproductislowerthan1000bporlowerifproductishigherthan1000bp)Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8^g/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerol.Checkprimersequencesformismatchesand/orincreasetheprimerlengthby5nucleotidesCombinesome/alloftheaboveMytwoprimershaveveryAneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowdifferentmeltingtemperaturesTm.Ifyouneedtokeepthesizeoftheproductconstant,addafew(Tm)butIcannotchangetheirbasesatthe3'end.Ifsizeisnotaconcern,addafewbasesatlocus.WhatcanIdotoimprovePCReitherthe3'orthe5'endofthatprimer.amplification?IhaveanumberofprimerpairVerylikely,yes.Iwouldliketousetogether.CanTryamplifyalllociseapratelyusingthesamePCRprogram.IfoneIrunamultiplexPCRwiththem?.oftheprimerpairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingHow?conditionsconstantandchangeotherparametersasmentionedabove(#1and#2).Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthesamecyclingconditionsorbydecreasingonlytheannealingtemperatureby4°C.Ifsomeofthelociareweakornotamplified,readbelow!!HowmanylocicanIamplifyirDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14multiplexPCRatthesametime?loci.Literaturedescribesupto25lociorso.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingthemountofprimerforthereactionareveryweakor"weak"lociatthesametimewithdecreasingtheamountofprimerinvisible.Howcanamplifythem?foralllocithatcanbeamplified.Thebalancebetweentheseamountsismoreimportantthantheabsolutevaluesused!!.Checkprimersequencesforprimer-primerinteractions9.ShortPCRproductsinmyIncreaseKCl(buffer)concentrationto1.2x-2x,butkeepMgCl2multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield?DecreasedenaturingtimeDecreaseannealingtimeandtemperatureDecreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"loci.Addadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8^g/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove10.LongerPCRproductsinmyDecreaseKCl(buffer)concentrationto0.7-0.8x,butkeepMgCl2

multiplexreactionareweak.Howconcentrationat1.5-2mMcanIimprovetheiryield?IncreaseMgCl2concentrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentrationconstant.IncreasedenaturingtimeIncreaseannealingtimeDecreaseannealingtemperatureIncreaseextensiontimeandtemperatureIncreaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasingtheamountforthe"strong"lociAddadjuvants.Best,useBSA(0.1to0.8^g/^Lfinalconcentration).Youcanalsotry5%(v/v,finalconcentration)DMSOorglycerolCombinesome/alloftheabove11.AllproductsinmymultiplexDecreaseannealingtimeinsmallsteps(2°C)reactionareweak.HowcanIDecreaseextensiontemperatureto62-68°Cimprovetheyield?IncreaseextensiontimeIncreasetempla