基因診斷和基因治療3

基因診斷和基因治療南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室沈勤概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列?；虻母淖?，會導(dǎo)致各種表型的改變，進而引起疾病的發(fā)生。將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng)稱為基因病?；虿》譃槿箢悾阂?、單基因?。河蓡蝹€基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因病：由多個基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、糖尿病、先天畸形等、三、獲得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在機體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第一節(jié)基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學(xué)診斷免疫學(xué)診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。（細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識別差異等）基因診斷對患者基因直接分析基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷?；蛟\斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點：基因診斷的特點：1、病因診斷：直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅對表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術(shù)。3、穩(wěn)定性高4、診斷范圍廣，適應(yīng)性強目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長期保存。可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的診斷技術(shù)相比）基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學(xué)理論技術(shù)的發(fā)展而建立和發(fā)展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開發(fā)PCR、分子雜交等一系列技術(shù)發(fā)展二、基因診斷的對象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等。尤其是當(dāng)無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發(fā)病的原因為特定基因的突變。腫瘤的發(fā)生：發(fā)病機理尚不請。

初步認為是個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病二、基因診斷的對象（1）用核心順序的串聯(lián)重復(fù)序列組成探針進行雜交研究，可同時檢出具有高度多態(tài)性位點。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個體識別、親子鑒定、法醫(yī)物證4、其他二、基因診斷的對象遺傳穩(wěn)定，個體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定。基因診診斷的的基本本策略略：1、檢檢測已已知的的能產(chǎn)產(chǎn)生某某種特特定功功能蛋蛋白的的基因因這些基基因根根據(jù)其其特定定功能能已被被克隆隆，并并被定定位在在染色色體上上，基基因序序列亦亦被測測定，，致病病時的的基因因改變變亦較較清楚楚。如：已已被克克隆的的病毒毒、細細菌、、霉菌菌和寄寄生蟲蟲的基基因、、與致病病有關(guān)關(guān)的癌癌基因因、抗抗癌基基因、、地中海海貧血血、苯苯丙酮酮尿癥癥等遺遺傳病病基因因。2、檢檢測與與某種種遺傳傳標(biāo)志志連鎖鎖的致致病基基因遺傳連連鎖－－同同一染染色體體相鄰鄰的二二個或或二個個以上上的基基因或或限制制性酶酶切位位點，，由于于位置置十分分靠近近，在在遺傳傳時分分離幾幾率很很低，，常一一起遺遺傳稱稱連鎖。染色體體遺傳傳連鎖鎖圖－－用用限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶酶切切位點點作遺遺傳標(biāo)志，，定位位與之之相連連鎖的的正常?；蛞蚺c致致病基基因，，建立立相應(yīng)應(yīng)的遺遺傳連連鎖圖圖譜。。定位性性克隆?。鶕?jù)遺遺傳連連鎖圖圖進行行定位位性克克隆。。比較較正常常和異常?；蛞虻牟畈顒e，，可找找出導(dǎo)導(dǎo)致遺遺傳病病的分分子缺缺陷。。定位性性克隆隆策略是是當(dāng)前前基因因診斷斷的重重要基基礎(chǔ)。。3、檢檢測表表型克克隆基基因針對多多基因因?。ǎㄈ纾海褐囟榷确逝峙?、哮哮喘、、高血血壓、、癲癇癇、精精神病病、多多種自自身免免疫性性疾病?。?。。表型克隆技技術(shù)－－是將有有關(guān)表型與與基因結(jié)構(gòu)構(gòu)結(jié)合，直直接分離該表型型的相關(guān)基基因，并對對疾病相關(guān)關(guān)的一組基因進行克隆，然后后用作多種種探針，來來診斷多基基因遺傳病病。該策略既不不需預(yù)先知知道基因的的生化功能能或圖譜定定位，也不不受基因數(shù)目及及其相互作作用方式的的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和和異?；蛞蚪M尋找兩者之之間的差異異序列2、基因組組錯配篩選選技術(shù)：尋找兩者的的全同序列列，分離、、鑒定與疾疾病相關(guān)的的基因，確確定導(dǎo)致疾疾病的分子子缺陷基因診斷的的基本步驟驟：1、獲得待待檢樣品：：提取核酸酸（PCR提高靈靈敏度)2、制備和和標(biāo)記核酸酸探針3、基因檢檢測分析三、基因診診斷的常用用技術(shù)核酸分子雜雜交聚合酶鏈反反應(yīng)（PCR）限制性片段段長度多態(tài)態(tài)性（RELP）擴增片段長長度多態(tài)性性（AFLP）等位基因特特異的寡核核苷酸（ASO）單鏈構(gòu)象多多態(tài)性（SSCP））基因芯片1、核酸分分子雜交原理：利用核酸的的變性、復(fù)復(fù)性及堿基基互補的性性質(zhì)，用已已知基因的的核酸序列列作探針，與變性后后的單鏈基基因組DNA/RNA雜交，，檢測核酸酸樣品中是是否存在與與探針互補補的同源核核酸序列，，進行DNA或RNA定性定定量分析。?；驒z驗的的兩個必要要條件：1、必需的的特異探針針（標(biāo)記記的的）2、、必必需需的的基基因因組組DNA核酸酸分分子子雜雜交交－－－－核核酸酸印印跡跡雜雜交交DNA印印跡跡雜雜交交（（Southernblot））RNA印印跡跡雜雜交交（（Nouthernblot））斑點點印印跡跡雜雜交交（（Dot-blot））原位位雜雜交交(situhybridization)核酸酸印印跡跡雜雜交交基基本本過過程程：：提取取DNA或或RNA→→酶酶切切→→凝凝膠膠電電泳泳→→膠膠變變性處處理理（（DNA））→→轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印印核核酸酸片片段段到到NC膜膜上上。。（RNA可可直直接接用用變性性膠膠電電泳泳，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜膜））1、、制制備備樣樣品品：：核酸酸印印跡跡雜雜交交基基本本過過程程：：（2））制制備備探探針針：：探針針：：一一段段能能和和待待檢檢測測核核酸酸分分子子按按堿堿基基互互補補配配對對原則則而而結(jié)結(jié)合合的的核核酸酸分分子子片片段段。。探針針需需要要標(biāo)標(biāo)記記可可直直接接檢檢測測的的元元素素或或分分子子。。如：：同同位位素素、、熒熒光光、、生生物物素素等等核酸酸印印跡跡雜雜交交基基本本過過程程：：核酸酸印印跡跡雜雜交交可可檢檢測測pg水水平平的的靶靶分分子子（4））檢檢測測：：方方法法依依標(biāo)標(biāo)記記的的探探針針而而不不同同*放放射射性性同同位位素素*生生物物素素*地地高高辛辛*熒熒光光素素（3））雜雜交交：：預(yù)預(yù)雜雜交交－－－－封封閉閉非非特特異異性性結(jié)結(jié)合合位位點點雜交交－－－－探探針針與與核核酸酸分分子子結(jié)結(jié)合合核酸酸印印跡跡雜雜交交基基本本過過程程：：2、、聚聚合合酶酶鏈鏈反反應(yīng)應(yīng)（（PCR)原理：以待擴增DNA為模模板，在互補模模板兩端序序列的寡核苷酸引引物介導(dǎo)下，通通過耐高溫DNA聚合酶酶催化下，按按半保留復(fù)復(fù)制機制延延模板鏈延延伸，快速速、特異地地擴增特定定的DNA。一種體外模模擬自然DNA復(fù)制制過程的核核酸擴增技技術(shù)。（無細胞分分子克隆技技術(shù)）。耐高溫DNA聚合酶酶－－－Taq酶寡核苷酸引引物：設(shè)計引物和和確定退火火溫度是PCR成功的關(guān)鍵鍵。PCR的基基本過程：：（循環(huán)程程序）變性（95℃）→退退火（55℃－65℃℃）→延伸（（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高高溫菌，最最適反應(yīng)溫溫度為72℃，且經(jīng)經(jīng)90℃以上上加溫后仍仍可在溫度度恢復(fù)后復(fù)復(fù)性。（呈2n擴增速度））PCR基本本過程和原原理特點：特異異性強靈敏度高樣品可以是是：毛發(fā)、血痕痕單細胞、病原體、腫瘤殘留物物、犯罪現(xiàn)場遺遺留物基因診斷中中常用的PCR技術(shù)術(shù)：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為為模板，擴擴增特定核核苷酸序列列。用于檢檢測特定基因片段段的存在，，分析鑒定定基因突變變。以總RNA或mRNA為模板板，逆轉(zhuǎn)錄錄為cDNA后擴增增。用于檢測特定定基因表達達水平的主主要方法之之一。（3）、PCR-SSCP：：檢測基因未未知突變的的常用技術(shù)術(shù)。簡單、、快捷、靈靈敏。（4）、多多重PCR：指在一次PCR反應(yīng)應(yīng)中加入多多對引物，，同時擴增增DNA序列上不同同序列片段段的一種PCR技術(shù)術(shù)。用于一一些“超大大”基因中大片片段缺失分分析。（5）、原原位PCR：直接用組織織切片和細細胞進行PCR或RT-PCR，在組組織、細胞原位檢檢測單拷貝貝或低拷貝貝的特點基基因序列。。（6）、實實時定量PCR：：借助特異性性結(jié)合DNA的熒光光染料，實實時動態(tài)檢檢測PCR擴增的DNA量的變變化。其他重要的的PCR衍衍生技術(shù)反向PCR（IPCR）標(biāo)記引物PCR（labelledprimersPCR））錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）（見書“分子子生物學(xué)技術(shù)術(shù)”章節(jié)）3、限制性片片段長度多態(tài)態(tài)性（RFLP）檢出方法：Southern印印跡概念：用同一限制性性內(nèi)切酶完全全切割同一物物種的不同個個體的基因組組DNA，出出現(xiàn)分子質(zhì)量量不同的同源源片段，這種種由限制性內(nèi)內(nèi)切酶酶切位位點變化導(dǎo)致致的DNA片片段差異，稱稱限制性片段段長度多態(tài)性性（RFLP）。人類基因組中中由中性突變導(dǎo)致個體間核核苷酸的差異稱－－－DNA多態(tài)性性RFLP類型型：2、由于鏈內(nèi)內(nèi)發(fā)生較大片片段的缺失、、重復(fù)、插入入和重排導(dǎo)導(dǎo)致DNA順順序的變化，，因而酶切片片段改變－－－－序列多態(tài)性。1、單個堿基基的突變引起起酶切位點的的變化－－－點多態(tài)性致病基因附近近或內(nèi)部一般般存在RFLP,可用于于連鎖分析的基因診診斷。（四）擴增片片段長度多態(tài)態(tài)性（AFLP）應(yīng)用于基因突突變性質(zhì)不明明的連鎖分析析。AFLP－－－串聯(lián)重復(fù)的的短片段的長長度多態(tài)性通通過PCR擴擴增,經(jīng)限制制性內(nèi)切酶酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴擴增片段多態(tài)態(tài)性。AFLP原理理：首先利用可產(chǎn)產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切切酶酶切研究究對象的基因因組序列，產(chǎn)產(chǎn)生不同長度度的酶切片段段。然后，將將這些酶切片片段與含有與與其有共同粘粘性末段的人工接頭連接接，形成模板。為達到選擇性擴增的目的，，再在模板末末端添加具有有選擇性核苷酸酸（1～3個個）的不同引引物，然后PCR擴增，結(jié)果果只有那些兩兩端序列與選選擇性核苷酸酸配對的酶切切片段被擴增增。最后將被被擴增的片段段在高分辨率率的測序凝膠膠上電泳，這這樣其多態(tài)性性即根據(jù)擴增增片段的長度度與數(shù)量的不不同而被分開開。PCR擴增產(chǎn)產(chǎn)物即等位片片段之間差別只有幾個個bp。5、等位基因因特異的寡核核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種種探針：①已知突變變位點的核苷苷酸序列（M）②正常基因因堿基序列（（N）2、雜交實驗驗結(jié)果：M+N-受受檢者者是突變基因因的純合子M-N+受受檢者者是不存在突突變基因M-N-受受檢者者的缺陷基因因可能是一種種新的突變類類型M+N+受受檢者是是突變基因的的雜合子原理：已知基因突變變部位和性質(zhì)質(zhì)，合成基因因特異的核苷苷酸探針（20bp），，標(biāo)記后與受受檢者DNA雜交診斷。。（可與PCR聯(lián)用：：PCR-ASO）6、單鏈構(gòu)象象多態(tài)性（SSCP）日本Orita等研究發(fā)發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈呈復(fù)雜的空間折疊疊構(gòu)象，，當(dāng)有一一個堿基基發(fā)生改改變時，，會或多或少少地影響響其空間間構(gòu)象，，使構(gòu)象象發(fā)生改改變，空間構(gòu)象象有差異異的單鏈鏈DNA分子在在聚丙烯烯酰胺凝膠中受受排阻大大小不同同.因此此，通過過非變性聚聚丙烯酰胺凝凝膠電泳泳(PAGE)，可以非常常敏銳銳地將構(gòu)構(gòu)象上有差差異的分分子分離離開.PCR-SSCPPCR-SSCP基本本過程①PCR擴增靶靶DNA②將特異異的PCR擴增增產(chǎn)物變變性后快快速復(fù)性性;③將單鏈鏈DNA進行行非變性性聚丙烯烯酰胺凝凝膠電泳泳;④通過放放射性自自顯影、、銀染或或溴化乙乙錠顯色色分析析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)現(xiàn)單鏈DNA帶帶遷移率率與正常常對照的的相比發(fā)發(fā)生改變變，就可可以判定定該鏈構(gòu)構(gòu)象發(fā)生生改變，，進而推推斷該DNA片片段中有有堿基突突變.7、基因因芯片將指大量量寡核苷苷酸分子子固定于于支持物物上，然然后與標(biāo)標(biāo)記的樣樣品進行行雜交，，通過檢檢測根據(jù)據(jù)雜交分分子和未未雜交分分子信號號的強弱弱進而判判斷樣品品中靶分分子的數(shù)數(shù)量。基本原理理：（生物集集成模片片、DNA陣列列、或寡寡核苷酸酸微芯片片）基因芯片片技術(shù)：：目的：檢檢測外源源性基因因的侵入入目標(biāo)：1、微生生物2、病毒毒如如：HIV（致艾艾滋病AIDS）3、寄生生蟲、4、不易易體外培培養(yǎng)的病病原體（（毒性大大腸桿菌菌、麻風(fēng)風(fēng)分枝桿菌）5、實驗驗室培養(yǎng)養(yǎng)的病原原體（克克立氏體體）四、基因因診斷的的臨床床應(yīng)用:1、在感感染性疾疾病檢測測中應(yīng)用用艾滋病與與HIV病毒艾滋病由由HIV通過接接觸、血血液、血血制品及及母嬰傳傳播感染染所致。。HIV特異地地侵犯輔輔助性T細胞（（CD4），引引起人體體細胞免免疫嚴(yán)重重缺陷，，導(dǎo)致頑頑固的機機會性感感染，惡惡性腫瘤瘤和神經(jīng)經(jīng)系統(tǒng)損損傷。HIV感感染后后，95%感染染者5個個月可檢檢出抗體體（也有有3-4年仍不不能檢出出抗體））。有必必要進行行PCR技術(shù)檢檢測。艾滋病與與HIV病毒檢測技術(shù)術(shù)：巢式-PCR、、Southern、、DNA序列分分析引物的設(shè)設(shè)計：應(yīng)在保保守區(qū)（（基因：：pol,env,gag,tat)病毒特點點：HIV病病毒由兩兩條單鏈鏈RNA組成，，9.7k/RNA，主要基因因結(jié)構(gòu)和和組成形形成與其其他逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒毒相同，，但較之復(fù)雜，，故稱復(fù)復(fù)雜反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒毒HIV屬屬反轉(zhuǎn)錄錄病毒－－－－即即單鏈RNA反反轉(zhuǎn)錄成成雙鏈DNA，，進入宿主主細胞染染色體。。非典型性性肺炎（（SARS）由一種新新型冠狀狀病毒（（SARS-CoV））引起，，多種途徑傳播播，傳染染性強、、高致死死率的急急性疾病病。診斷依靠靠：流流行病學(xué)學(xué)、臨床床表現(xiàn)、、放射診診斷、血清學(xué)（（熒光免免疫、ELISA）PCR作作為一種種靈敏的的早期病病原學(xué)診診斷必不不可少（關(guān)鍵是是引物的的合成））2、在遺遺傳病檢檢測中的的應(yīng)用產(chǎn)前診斷斷檢測妊娠娠8－12周的的絨毛DNA或或羊水細細胞PCR診診斷一系系列遺傳傳疾病鐮刀狀細細胞貧血血的診斷斷方法：－－RFLP診斷MstⅡ酶切識識別序列列：CCTNAGG切割正常常β鏈序列：：CCTGAGG不切割突突變序列列：CCTGTGG－ASO探探針診斷斷3、在腫腫瘤檢測測中的應(yīng)應(yīng)用原癌基因因生物正常常細胞基基因中編編碼關(guān)鍵鍵性調(diào)控控蛋白的的癌基因抑癌基因因一類抑制制細胞增增殖的基基因，其其失活可可引起細細胞轉(zhuǎn)化。。兩類基因因協(xié)同調(diào)調(diào)控，使使細胞生生長處于于平衡狀狀態(tài)。癌基因激激活變化化及檢測測：1、基因因擴增：：即染色色體某區(qū)區(qū)段基因因拷貝數(shù)數(shù)增加，，或癌基基因的擴增增。檢測方法法：Southern雜雜交定定量量PCR2、基基因的的過量量表達達：包包括基基因擴擴增基基礎(chǔ)上上的過過量表表達及及非DNA水平平的過過量表表達。。檢測方方法：：Northern雜雜交RT-PCR3、點突變：：檢測方方法為各種基基于PCR的的方法。抑癌基因的檢檢測：SouthernPCR大片段的缺失失、和點突變變*兩個等位抑抑癌基因突變變才能引起腫腫瘤，需檢出兩個等位抑抑癌基因。方法：RFLP結(jié)合PCR，進行缺缺失檢測點突變主要采采用PCR腫瘤標(biāo)志物：：指特征性存在在于惡性腫瘤瘤或由惡性腫腫瘤細胞異常產(chǎn)生的的物質(zhì)或宿主主對腫瘤反應(yīng)應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。（1）酶類腫腫瘤標(biāo)志物（2）激素類類標(biāo)志物（3）胚胎抗抗原（4）特殊蛋蛋白標(biāo)志物（5）糖蛋白白類抗原（6）血中癌癌基因蛋白（7）唾液酸酸和唾液酸酰?；D(zhuǎn)移酶（8）多胺免疫組化篩選選提高檢出率率法醫(yī)學(xué)鑒定針對人類DNA遺傳差差異進行的個個體識別和親親子鑒定。常用技術(shù):DNA指紋分分析（VNTR）短串聯(lián)重復(fù)序序列（STR）遺傳特征征分析PCR-擴增增片段長度多多態(tài)性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術(shù)術(shù)根據(jù)可變串聯(lián)重復(fù)復(fù)序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)性性高度的個體特特異性DNA指紋（（圖譜）分析析：⑴、選擇核心心序列作探針針，選在核心心序列上無切切割位點的限制性性內(nèi)切酶，酶酶解樣品，Southernblot得到到DNA指紋圖圖譜。針對可變串聯(lián)聯(lián)重復(fù)序列（（VNTR））（VNTR是是判斷個體的的遺傳標(biāo)志））⑵、針對VNTR側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計探針針，用PCR對該區(qū)擴增，，電泳得到個個體之間長度度不同的條帶圖譜。（VNTR片段段較長PCR不易擴增））。第二節(jié)基基因治療（genetherapuy)概念：將外源正常基基因?qū)氚屑毤毎?，以糾正正或補償因缺缺陷和異常基基因引起的疾疾病，達到治治療目的。導(dǎo)入的基因可可以與缺陷基基因?qū)?yīng)、在在體內(nèi)表達具具有特異功能能的同源基因因、也可以是是與缺陷基因因無關(guān)的治療療基因。概念的擴展：：凡是采用分子子生物學(xué)方法法原理，將某某種遺傳物質(zhì)質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞內(nèi)內(nèi)，使其在體體內(nèi)發(fā)揮作用用，達到治療療目的的方法，都可可稱為基因治治療?；蛑委煵呗月?總原則：－－直接補替替缺陷基因－－抑制非正正?；虍a(chǎn)物物表達－－間接調(diào)節(jié)節(jié)機體本身免免疫系統(tǒng)的抗抗病能力。－－利用外源源基因?qū)Σ∽冏兗毎斐商靥禺愋詺?、基因矯正正－－將致病病基因的堿基基進行糾正，，而正常部分分予以保留。。2、基因置換換－－用正常常基因通過體體內(nèi)基因同源源重組，原位位置換病變細細胞內(nèi)的致病基基因，使細胞胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正正常3、基因增補補－－將目的的基因?qū)氩〔∽兗毎蚱淦渌毎徊蝗コ惓；?，而是通通過目的基因因的非定點整整合，使其表表達產(chǎn)物補償缺陷陷基因的功能能或使原有功功能得以加強強。4、基因失活活－－利用反反義技術(shù)特異異封閉基因表表達，抑制有有害基因的表達。5、免疫調(diào)節(jié)節(jié)－－將抗體體、抗原或細細胞因子的基基因?qū)氩∪巳梭w內(nèi)，改變變病病人人免免疫疫狀狀態(tài)態(tài)，，達達到到預(yù)預(yù)防防和和治治療療的的目目的的。。基因因治治療療的的策策略略：：6、、調(diào)調(diào)節(jié)節(jié)性性基基因因治治療療：：導(dǎo)導(dǎo)入入編編碼碼調(diào)調(diào)控控蛋蛋白白的的基基因因，，治治療療基因因表表答答異異常常的的疾疾病病7、、化化療療保保護護性性基基因因治治療療：：導(dǎo)導(dǎo)入入單單相相或或多多相相細細胞胞毒毒性性藥藥物的的抗抗性性基基因因，，使使正正常常細細胞胞耐耐受受化化療療藥藥物物的的能能力力大大大提提高高。。8、、特特異異性性細細胞胞殺殺傷傷性性基基因因治治療療：：利利用用DNA重重組組技技術(shù)術(shù)構(gòu)構(gòu)建建特異異性性殺殺傷傷靶靶細細胞胞為為目目標(biāo)標(biāo)的的““奇奇異異彈彈頭頭””，，““彈彈頭頭””部部分分是是分子重重組的的各種種生物物細胞胞毒素素，它它們以以酶催催化方方式發(fā)發(fā)揮抑制蛋蛋白合合成作作用，，造成成細胞胞殺傷傷。9、生生殖細細胞基基因治治療：：生殖殖細胞胞或胚胚胎干干細胞胞補償償性治治療基因治治療基基本程程序;方法：：1、體體外法法（exvivo):2、體體內(nèi)法法(invivo):將受體體細胞胞在體體外培培養(yǎng)，，轉(zhuǎn)入入外源源基因因，經(jīng)經(jīng)適當(dāng)當(dāng)選擇擇系統(tǒng)統(tǒng)，將將重組組的受受體細細胞胞回輸輸患者者體內(nèi)內(nèi)，以以改善善癥狀狀。（（普遍遍采用用）直接將將外源源基因因?qū)肴塍w內(nèi)內(nèi)有關(guān)關(guān)的組組織器器官,使其其進入入相應(yīng)應(yīng)的細細胞并并轉(zhuǎn)錄錄、表表達而而發(fā)揮揮治療療作用用?；境坛绦颍海哼x擇目目的基基因選擇基基因載載體選擇靶靶細胞胞基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移外源基基因表表達及及檢測測回輸體體內(nèi)治療基基因的的來源源：1、野野生型型基因因：單基基因缺缺陷遺遺傳病病基因因反義義核酸酸封閉閉活化化的原原癌基基因轉(zhuǎn)入入相關(guān)關(guān)的抑抑癌基基因，，抑制制腫瘤瘤2、重重組DNA和分分子克克隆技技術(shù)，，人工工合成成特異異基因。。1、選選擇治治療的的目的的基因因用于基基因治治療的的基因因應(yīng)滿滿足以以下條條件：：（1））體內(nèi)內(nèi)僅少少量表表達就就可顯顯著改改善癥癥狀。。（2））該基基因的的過量量表達達不會會對機機體造造成危危害、、（3））在抗抗病毒毒和抗抗病原原體的的基因因治療療中，，所選選擇的靶靶基因因應(yīng)在在病毒毒和病病原體體的生生活史史中起重要要作用用，并并且該該序列列是特特異的的。理想的的載體體具有有以下下特征征：1、容容易生生產(chǎn)商商業(yè)化化生產(chǎn)產(chǎn)，廣廣泛應(yīng)應(yīng)用，，易運運輸，，易保保存2、持持續(xù)表表達一一旦轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入體體內(nèi)，，應(yīng)能能在一一定時時間內(nèi)內(nèi)持續(xù)續(xù)表達達基因因產(chǎn)物，或或能通通過某某種方方法精精細調(diào)調(diào)節(jié)其其表達達。3、弱弱免疫疫源轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入后后不應(yīng)應(yīng)引起起免疫疫反應(yīng)應(yīng)。4、組組織靶靶向性性定定向向輸入入某種種細胞胞。5、包裝容容量載體對對轉(zhuǎn)染基因因的大小應(yīng)應(yīng)沒有限制制。6、復(fù)制、、分裂和整整合能力：：特異性定定位整合，，或以游離離基因形式式存在于細胞胞核內(nèi)。7、能感染染分裂期細細胞和未分分裂期細胞胞2、選擇基基因載體：：基因載體：非病毒載體（裸DNA、、脂質(zhì)體）病毒載體（反轉(zhuǎn)錄病毒毒、腺病毒、、腺相關(guān)病毒毒）分類：優(yōu)點：大量量生產(chǎn)，毒性性小，低免疫疫性缺點：效率低低。優(yōu)點：多數(shù)病病毒可感染特特異細胞，不不易降解，RNA病毒能能整合到宿主主染色體，表表達水平高等。病毒介導(dǎo)的基基因轉(zhuǎn)移1、逆轉(zhuǎn)錄病病毒：正鏈RNA病病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)結(jié)構(gòu):基因組組成：：（1）5’－－帽子；3’’－尾巴；（2）每個個單鏈RNA含6個區(qū)：：5’-LTR（長末端重重復(fù)序列）Ψ+（組裝裝所需需的非非編碼碼序列列）gag（編編碼衣衣殼結(jié)結(jié)構(gòu)蛋蛋白基基因））pol（編編碼反反轉(zhuǎn)錄錄酶基基因））env（編編碼外外殼蛋蛋白基基因））3’-LTR逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒生活活周期期:1、感感染靶靶細胞胞2、利利用自自身編編碼的的逆反反轉(zhuǎn)錄錄酶，，以RNA為模模板合合成DNA。3、將將病毒毒DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運至至宿主主細胞胞核4、病病毒DNA整合合到宿宿主染染色體體5、以以病毒毒DNA為為模板板轉(zhuǎn)錄錄RNA6、在在細胞胞中翻翻譯Gag、Pol和Env蛋白白7、形形成衣衣殼，，RNA單單鏈和和反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶酶一起起包裝裝進衣衣殼。。8、形形成病病毒顆顆粒并并分泌泌到胞胞外。。逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒病毒RNA宿主細細胞RTRT逆轉(zhuǎn)錄錄酶cDNA雙鏈插入基因組組DNA逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒感染染過程程病毒RNA構(gòu)建逆逆轉(zhuǎn)錄錄病毒毒載體體：（1））構(gòu)建建重組野生性性病毒毒：插插入相相關(guān)外外源基基因，，改造造成DNA載體體（包包括插插入選選擇性性標(biāo)記記），，替代代病毒毒的編編碼基基因。。（2））制備備輔助助細胞胞（293T細細胞）），為為載體體DNA提提供其其喪失失的功功能。。（3））載體體DNA導(dǎo)導(dǎo)入輔輔助細細胞，，產(chǎn)生生病毒毒載體體。（4））用病病毒載載體感感染細細胞，，外源源基因因在宿宿主細細胞中中表達達。逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒載載體體的的缺缺陷陷：：1、只能能轉(zhuǎn)染處處于增殖殖狀態(tài)的的細胞2、所攜攜帶的外外源基因因不能太太大。3、感染染依賴靶靶細胞表表面受體體的限制制4、理論論上不擴擴散其它它細胞，，但某些些情況會會造成野生型病病毒爆發(fā)發(fā)。5、有致致細胞癌癌變的可可能。6、逆轉(zhuǎn)錄病病毒不能耐受受純化和濃縮縮過程。腺相關(guān)病毒(AVV)一種小的、非非致病的、單單鏈DNA病病毒。是從屬屬病毒，需要其他基因才才能復(fù)制。結(jié)構(gòu)：rep基基因－－編碼碼病毒的復(fù)制制、整合功能能所需蛋白cap基因－－－編碼病毒毒結(jié)構(gòu)組分ITRs序列列－－反向末末端重復(fù)，定定義基因的開開始和結(jié)束，制約DNA序列大大小，包裹入入衣殼。細胞對AVV病毒的親和和力高，AVV載體適用用范圍廣泛。。骨髓細胞、皮皮膚成纖維細細胞、肝細胞胞、血管內(nèi)皮皮細胞、肌細細胞選擇原則:1、較堅固，，耐受處理，，易于由人體體分離，便于于輸回體內(nèi)。2、具有增殖殖優(yōu)勢，生命命周期長，能能存活幾個月月或幾年，至病人的整個個生命。3、易于受外外源遺傳物質(zhì)質(zhì)的轉(zhuǎn)化。4、在選用病病毒載體時，，目的基因具具表達最好具具有組織特異異性的細胞3、選擇靶細細胞（禁止使用生生殖細胞，只只能用體細胞胞）1、骨髓細胞胞：最被重視視和常用的靶靶細胞。常用細胞：優(yōu)點：⑴易接受各種處處理、⑵已積積累豐富經(jīng)驗驗，⑶多數(shù)遺遺傳疾病涉及骨髓細胞胞、⑷源自骨骨髓的細胞遍遍布全身。缺點：-骨骨髓干細胞含含量少（占骨骨髓細胞0.1%）-治療基因在在核骨髓細胞胞表達時間短短（幾個月））。-只有部分干干細胞有活性性-造血干細胞胞分化可能導(dǎo)導(dǎo)致基因失活活。-有些遺傳疾疾病與骨髓干干細胞無關(guān)。。2、肝細胞：：是許多遺傳傳代謝缺陷的的靶細胞。3、皮膚細胞胞：易于繁殖殖及轉(zhuǎn)化。4、淋巴細胞胞：易采集、、分離，大量量繁殖，連續(xù)續(xù)多次輸入5、癌細胞：：腫瘤治療常常用細胞。方法：1、物理法：：顯微注射法電穿孔法基因槍技術(shù)2、化學(xué)法：：磷酸鈣沉淀法法DEAE-葡葡萄糖法脂質(zhì)體法3、融合法4、病毒感染染法4、基因的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染細胞后的的篩選：方法：1、標(biāo)記基因因篩選法：2、基因缺陷陷型受體細胞胞的選擇性3、基因共轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染技術(shù)4、分子生物物學(xué)方法:原位雜交Southern雜交斑點雜交目的基因或標(biāo)標(biāo)記基因作為為探針。方法：（目目的基因和標(biāo)標(biāo)記基因的表表達）原位雜交、Nouthern雜交、RNA點雜交（檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄））免疫組化染色色（檢測基因因翻譯出的蛋蛋白質(zhì))5、外源基因因表達的檢測測：6、回輸體內(nèi)內(nèi)將治療性基因因修飾的細胞胞通過不同方方式回輸入體內(nèi)，以發(fā)發(fā)揮治療效果果。如：-淋巴巴細胞經(jīng)靜脈脈回輸入血-造血細胞經(jīng)經(jīng)自體骨髓移移植-皮膚成纖纖維細胞經(jīng)膠膠原包裹后埋埋入皮下組織織1、肝專一性性表達：磷磷酸烯醇式式丙酮酸羧基基酶啟動子2、肌肉專一一性表達：肌肌苷激酶的調(diào)調(diào)控片段3、乳腺專一一性表達：β酪蛋白，乳清清酸蛋白4、黑色素專專一性表達:酪氨酸酸和酪氨酸相相關(guān)蛋白（TRP)5、膠質(zhì)瘤專專一性表達：：鞘磷酸堿性性蛋白基因上上游片段6、肺癌專一一性表達：人人表面活性性蛋白A與目的基因一一起重組入反反轉(zhuǎn)錄病毒，，用于基因靶靶向表達。組織專一性表表達的調(diào)節(jié)片片段:基因治療的應(yīng)應(yīng)用及展望應(yīng)用治療：遺傳病（學(xué)友友病、囊性纖纖維病、家族族性高血壓惡性腫瘤心血管疾病感染性疾?。ǎˋIDS、、類風(fēng)濕等））呈待解決的問問題：外源基因表達達效率外源基因表達達調(diào)控遺傳性疾病面面臨的免疫問問題反轉(zhuǎn)錄病毒載載體隨機插入入的外源基因因，若插入不不當(dāng)，可能破破壞另一個基基因的表達或或激活其它基基因（潛在的的危險）。使用巢式引物物進行連續(xù)多多輪擴增可以以提高特異性性和靈敏度。。第一輪是15到20個循環(huán)的的標(biāo)準(zhǔn)擴增。。將一小部分分起始擴增產(chǎn)產(chǎn)物稀釋100到1000倍加加入到第二輪輪擴增中進行行15到20個循環(huán)。?；蛘?，也可可以通過凝膠膠純化將起始始擴增產(chǎn)物進進行大小選擇擇。在第二輪輪擴增中使用用一套巢式引引物，其可以以同第一套引引物內(nèi)側(cè)的靶靶序列結(jié)合。。巢式PCR的使用降降低了擴增多多個靶位點的的可能性，因因為同兩套引引物都互補的的靶序列很少少。而使用同同樣的引物對對進行總數(shù)相相同的循環(huán)（（30到40）會擴增增非特異性靶靶位點。巢式式PCR可可以增加有限限量靶序列（（如稀有mRNA）的靈靈敏度，并且且提高了困難難PCR（如如5'RACE）的特特異性。巢式式PCR9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。06:11:0406:11:0406:1112/23/20226:11:04AM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。12月-2206:11:0406:11Dec-2223-Dec-2212、故人江海別別，幾度隔山山川。。06:11:0406:11:0406:11Friday,December23,202213、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2206:11:0406:11:04December23,202214、他他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生生白白發(fā)發(fā)，，舊舊國國見見青青山山。。。。23十十二二月月20226:11:04上上午午06:11:0412月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月226:11上上午12月-2206:11December23,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2022/12/236:11:0506:11:0523December202217、做前，能夠夠環(huán)視四周；；做時，你只只能或者