黑籽重樓種內(nèi)形態(tài)標(biāo)記和ISSR標(biāo)記的遺傳分化研究

黑籽重樓種內(nèi)形態(tài)標(biāo)記和ISSR標(biāo)記的遺傳分化研究陳照，葉睿超，張瑞，李偉陽，王麗【內(nèi)容摘要】該文對黑籽重樓paristhibetica種內(nèi)兩變種——黑籽重樓原變種paristhibeticavar.thibetica與無瓣黑籽重樓paristhibeticavar.apetala在形態(tài)學(xué)及issr分子標(biāo)記上的差別進行了研究和比較。形態(tài)特征分析表示清楚黑籽重樓原變種與無瓣黑籽重樓在萼片長寬、花藥數(shù)、花絲長等7個花器官性狀方面有顯著差別，但通過在主成分分析圖上不能明顯區(qū)分兩個變種，兩變種總體形態(tài)上的分化不明顯。issr分析上，從100個issr引物中挑選出8個引物，在300～1500bp間共擴增出36條帶，其中黑籽重樓原變種特征帶有5條，無瓣黑籽重樓擴特征帶有8條。【本文關(guān)鍵詞語】黑籽重樓變種形態(tài)差別issrabstract:themorphologicaldifferentiationanalysisonparisthibeticavar.thibeticaandparisthibeticavar.apetalawasaccomplishedtoindicatethatthemorphologicaldifferentiationbetweenthosetwovarietieswerenotsignificant,whilethedifferentiationsofthefloralorgansweresignificant.generally,paristhibeticavar.thibeticaandparisthibeticavar.apetalacouldnotbeclassifiedbyprincipalcomponentanalysis.inissranalysis,8properprimerswereselectedfrom100issrprimers.and36bandswereamplifiedbyissr-pcr,ofwhichlengthrangewas300bpto1500bp.paristhibeticavar.thibeticahad5characteristicbands,whileparisthibeticavar.apetalahad8.keywords:paristhibetica;variety;morphologicaldifferentiation;issr重樓是延齡草科(trilliaceae)重樓屬(parisl.)植物的統(tǒng)稱，是一類極具藥用價值的植物?！采褶r(nóng)本草經(jīng)〕〔本草綱目〕〔植物名實圖考〕及〔中國藥典〕等都有所記載［1］，常用于治療疔瘡腫毒以及流行性腮腺炎等疾病。由于它還有抗癌止血，祛痰抑制細(xì)菌等成效［1］，如今是云南白藥等很多中成藥的重要成分［2］。在李恒系統(tǒng)中，重樓屬植物有24種，由于其形態(tài)變異較大，在種間、種內(nèi)又有穿插重疊，這對于其形態(tài)分類及種質(zhì)資源利用造成一定困難［3］。歷年的〔中國藥典〕只收載了滇重樓和華重樓2個種，實際上在民間除了少數(shù)稀有種外，幾乎所有重樓屬植物均能入藥［3］。黑籽重樓〔paristhibetica〕重要分布于西藏南部、云南西北部至西部,四川西半部至峨眉山、甘肅南部、錫金、不丹也有。其下有黑籽重樓原變種(p.thibeticavar.thibetica)與無瓣黑籽重樓(p.thibeticavar.apetala)兩個變種［1］。研究表示清楚黑籽重樓有明顯的鎮(zhèn)靜作用［4］，其富含的偏諾皂苷，是重樓的重要藥效成分［1］。在滇重樓等利用過度的情況下［5］，對黑籽重樓進行種內(nèi)分化和遺傳多樣性等研究，使其充足的了解種質(zhì)資源，顯得迫切并有需要。傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記是遺傳標(biāo)記的基礎(chǔ)［6］，是檢測遺傳多樣性和區(qū)分種屬間差異不同最直接的方法。但形態(tài)特征的變異除與本身遺傳基礎(chǔ)的變異相關(guān)外，還與其所處的環(huán)境等因素相關(guān)，是對基因的間接反映，而且形態(tài)標(biāo)記的結(jié)果在缺乏嚴(yán)密的生物統(tǒng)計學(xué)分析下，結(jié)論往往不夠完善。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，dna分子標(biāo)記由于具有直接分析遺傳物質(zhì)，與基因表達無關(guān)，信息量大和所需樣品量小等優(yōu)點，當(dāng)前被普遍以為是評判遺傳構(gòu)造最好的方法。簡單反復(fù)序列間標(biāo)記(inter-simplesequencerepeat，issr)是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的分子標(biāo)記［7］,具有簡便、多態(tài)性高,穩(wěn)定性和反復(fù)性好等優(yōu)點，在分類學(xué)、種系發(fā)生學(xué)、保衛(wèi)生物學(xué)和種群遺傳學(xué)等方面得到迅速應(yīng)用［6］。本實驗通過形態(tài)差別分析結(jié)合數(shù)量統(tǒng)計方法對不同生境下黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓的14項形態(tài)特征進行測定和分析，觀察黑籽重樓的種內(nèi)形態(tài)分化的水平，以到達了解其遺傳多樣性水平的目的。并采取issr分子標(biāo)記技術(shù)對同域生長的黑籽重樓種下的黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓進行分子水平的遺傳分化的研究，尋找區(qū)別兩變種的特征帶。1材料和方法1.1材料用于形態(tài)分析的黑籽重樓共來自于10個居群，其中黑籽重樓原變種〔paristhibeticavar.thibetica〕分別來自于不同的7個居群，無瓣黑籽重樓(paristhibeticavar.apetala)分別來自于不同的3個居群〔見表1〕。表1形態(tài)分析材料〔略〕用于issr分析的黑籽重樓原變種〔paristhibeticavar.thibetica〕和無瓣黑籽重樓(paristhibeticavar.apetala)均收集于四川彭州龍門山〔海拔2560m〕，各變種各取3株，葉片均用硅膠枯燥。憑證標(biāo)本藏于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室。1.2方法1.2.1形態(tài)指標(biāo)測量及相關(guān)數(shù)據(jù)分析選取10個居群的黑籽重樓的14個形態(tài)學(xué)指標(biāo)進行測定。用spss13.0軟件計算各形態(tài)學(xué)指標(biāo)的平均值〔x〕、標(biāo)準(zhǔn)差〔δ〕、單因素方差分析、使用ntsys-pc2.10進行主成分分析［8］。1.2.2基因組dna提取基因組dna提取采取ctab法［9］，提取的黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓基因組dna分別為各變種的3個個體的混合樣。通過1%的瓊脂糖電泳檢測dna質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3issr-pcr擴增issr-pcr擴增體系為20μl的pcr反應(yīng)液。其中包含:10×buffer2.5μl，mg2+2μl(2mmol/l)，dntp2μl(0.12mmol/l)，issr引物2μl(1μmol)，taq酶0.5μl(1.5u)，模板2μl(50～100ng)，超純水9.5μl。taq酶，dntp和均購自takara公司，issr引物序列由從加拿大哥倫比亞大學(xué)〔ubc〕提供。pcr反應(yīng)程序為94℃5min，1個循環(huán)；94℃30s，36℃60s，72℃90s，40個循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴增產(chǎn)品以takara公司100bpdnaladder為分子標(biāo)記，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后用eb染色，并用genegeniusbioimagingsystem凝膠成像儀上成像觀察。2結(jié)果與分析2.1居群間形態(tài)變異對于來自于10個居群的黑籽重樓〔黑籽重樓原變種7個居群，無瓣黑籽重樓3個居群〕的14項形態(tài)特征進行統(tǒng)計分析〔見表2〕，7個黑籽重樓原變種在居群間水平上，在除了葉片長、萼片寬的12個性狀的差別極顯著。3個無瓣黑籽重樓在居群間水平上，葉柄長、花藥數(shù)、花絲長、花藥長、萼片數(shù)5個形狀的差別顯著。表2居群間形態(tài)性狀的單因素方差分析〔略〕2.2變種間形態(tài)差別為討論變種間的形態(tài)差別，采取單因素方差分析對兩變種的各形態(tài)指標(biāo)進行了分析〔見表3〕，14個形態(tài)特征中，兩個變種在花藥數(shù)、花絲長、花藥長、花瓣數(shù)、花瓣長5個花器官性狀方面的差別到達極顯著，在萼片長和寬上有顯著差別。表3兩變種具有顯著性差別的7個形態(tài)性狀的單因素方差分析〔略〕2.3各形態(tài)學(xué)指標(biāo)的主成分分析為進一步討論兩變種在形態(tài)上的分化式樣，對71個個體進行了形態(tài)特征的主成分分析〔見圖1〕。前3個主成分的累積方差奉獻率為86.43%，選取前2個主成分為黑籽重樓及其變種的綜合性狀的主要主成分〔見表4〕。其中主成分1重要代表了株高、葉片長、葉片寬等營養(yǎng)器官的特征，主成分2重要代表了花藥數(shù)、花絲長、萼片數(shù)、萼片寬、花瓣數(shù)、花瓣長等花器官的特征、葉片數(shù)等性狀，主成分3重要代表花藥長。固然主成分分析圖〔見圖1〕中變種間及變種內(nèi)穿插的現(xiàn)象較明顯，不能明確區(qū)分兩變種。但也有一定的聚類趨向，如主成分二軸上，無瓣黑籽重樓個體重要均分布于下半部分。另外，分布較近的居群趨于聚合在一起，如峨眉山太子坪和洗象池兩個居群〔橢圓區(qū)域內(nèi)〕。表4黑籽重樓兩變種形態(tài)特征主因子載荷矩陣〔略〕2.4兩變種的issr分析為討論兩變種在dna水平上的差別，對兩變種進行了issr-pcr擴增〔見圖2〕。從100個序列引物中挑選出8個擴增條帶較多、信號強、背景清楚明晰的引物(見表5)。統(tǒng)計100bp-1500bp之間的清楚明晰可見帶，共擴增出36條帶,其中多態(tài)性帶13條，占總條帶數(shù)的36.11%。每個引物擴增出dna帶數(shù)3～8條,平均4.5條,多態(tài)性帶平均1.625條。黑籽重樓原變種擴增出28條帶，其中多態(tài)性帶有5條，其中兩條片段長度為800bp，另外3條片段長度分別為400bp，550bp，和1200bp。無瓣黑籽重樓擴增出32條帶，其中多態(tài)性帶有8條，其中兩條片段長度為750bp，還有兩條片段長度為600bp，另外4條片段長度分別為380bp，400bp，580bp，和1300bp。表5挑選出的8個issr隨機引物及擴增條帶統(tǒng)計〔略〕3討論重樓屬植物種類繁多,化學(xué)成分復(fù)雜,藥理活性強,臨床應(yīng)用范圍廣。重樓屬植物不同種的某些外部形態(tài)特征較類似,容易混同,使得藥用品質(zhì)不一;某些種形態(tài)變異較大,表現(xiàn)出較大的多樣性。加上天然和人為的因素，對重樓屬植物相關(guān)的物種遺傳背景研究的缺乏,這些都將給重樓的繁衍以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展帶來較大的影響［10］。黑籽重樓種內(nèi)分化和遺傳多樣性等研究不僅對重樓屬植物的系統(tǒng)劃分有主要意義，還在滇重樓等利用過度的情況下，充足了解和更好地利用其他重樓種質(zhì)資源上具有積極的現(xiàn)實意義。3.1黑籽重樓居群間分化通過形態(tài)指標(biāo)的單因素方差分析表示清楚:黑籽重樓的各形態(tài)特征在不同居群之間都有一定水平的變異，葉柄長、葉片數(shù)、葉片寬、株高、花藥數(shù)、花絲長、花藥長、萼片數(shù)等性狀均呈極顯著性差別，即黑籽重樓種內(nèi)居群間的形態(tài)變異水平較高。黑籽重樓原變種居群間的形態(tài)特征變異水平接近整個黑籽重樓居群間的水平，而無瓣黑籽重樓居群間的差別重要表如今花藥數(shù)、花絲長、花藥長、萼片數(shù)，而且差別只呈顯著性差別，表示清楚黑籽重樓原變種的形態(tài)多樣性高于無瓣黑籽重樓，與唐銘霞等［11］得出的黑籽重樓原變種遺傳多樣性高于無瓣黑籽重樓的結(jié)論相吻合。由主成分分析結(jié)果可知,黑籽重樓的形態(tài)特征在整體水平上表現(xiàn)為居群間無規(guī)律性，在同一居群的多數(shù)個體常能聚在一起，但也有不同居群個體聚集的現(xiàn)象。比方云南中甸下久洛和云南麗江玉龍山烏頭地的兩個居群個體聚集，可能是由于這兩組居群所處地點的生境類似，類似的環(huán)境因素同一物種的形態(tài)分化較小，且黑籽重樓各居群間基因流較大〔nm=1.6870〕［11］，能夠一定水平抵御遺傳漂變引起的居群分化［12］，故遺傳一致度較高。3.2黑籽重樓變種間分化黑籽重樓兩變種的形態(tài)特征經(jīng)過單因素方差分析表示清楚初步的形態(tài)分類不能到達完全區(qū)別這兩個變種的目的。但兩變種在花藥數(shù)、花絲長、花藥長、花瓣數(shù)、花瓣長這5個花器官性狀上均有極顯著性差別，能從這些形態(tài)差異不同上區(qū)分兩個變種。兩變種的重要差別還是具體表現(xiàn)出在花器官上，十分是花瓣數(shù)目上。云南彝良朝天麻地區(qū)的無瓣黑籽重樓與黑籽重樓原變種形態(tài)標(biāo)記主成分分析出現(xiàn)了部分聚集的現(xiàn)象。黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓之間具有一定的進化關(guān)系，存在很近的親緣關(guān)系，十分是同域生長的這兩個變種。在黑籽重樓的種下遺傳分化研究方面，重要是通過探索黑籽重樓issr的條件，找出黑籽重樓兩變種的特征帶。本實驗選取四川彭州龍門山的黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓進行issr分析，是由于黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓本就是在同一生境混生的兩個變種［1］。而同域生長的兩變種的基因溝通可能是很頻繁的，比方云南彝良朝天麻地區(qū)的黑籽重樓原變種和無瓣黑籽重樓這兩變種個體就聚集在一起。黑籽重樓兩變種在形態(tài)分化的顯著性差別重要是集中在幾個花器官形態(tài)特征上，而表型是由遺傳和環(huán)境因素共同決定的，選用同域生長的黑籽重樓兩變種，排除了環(huán)境因素的影響。而通過形態(tài)差別分析得到兩變種重要在花器官特征上存在顯著性差別，說明兩變種的遺傳差別重要造成的是花器官的差別。至于通過issr所得的13條差別帶，終究是由哪些基因控制以及它們之間的互相關(guān)系，還有待進一步的研究分析?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】［1］李恒.重樓屬植物［m］.北京:科學(xué)出版社,1998.［2］邊洪榮，李小娜，王會敏.重樓的研究及應(yīng)用進展［j］.中藥材,2002,25(3):218.［3］尹鴻翔,張浩,薛丹，等.川滇地區(qū)重樓屬藥用植物資源質(zhì)量初評［j］.雜志,2007,32(13):1344.［4］武姍姍，高文遠(yuǎn)，段宏泉，等.重樓化學(xué)成分和藥理作用研究進展［j］.中草藥,2004,35(3):344.［5］陸輝,許繼宏,陳銳平，等.云南重樓屬植物資