微生物的分類鑒定

微生物的分類鑒定第一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日一、微生物分類鑒定步驟：①獲得該微生物的純種培養(yǎng)物②測定一系列必要的鑒定指標③查找權(quán)威性的鑒定手冊不同種類微生物應(yīng)采用不同的重點鑒定指標：真菌：形態(tài)特征較豐富、細胞體積較大，以形態(tài)特征為主要指標放線菌、酵母菌：形態(tài)特征與生理特征兼用細菌：形態(tài)特征較缺乏，使用較多的生理、生化和遺傳等指標第二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.

微生物的分類鑒定依據(jù)鑒于微生物形體微小、結(jié)構(gòu)較簡單等特點，微生物分類和鑒定除了像高等生物那樣，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征之外，還必須尋找新的特征作為分類鑒定的依據(jù)。

1.1經(jīng)典分類鑒定依據(jù)

1.1.1微生物的形態(tài)特征形態(tài)學(xué)特征始終被用作微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一，其中有兩個重要原因：一是它易于觀察和比較，尤其是在真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細菌中；二是許多形態(tài)學(xué)特征依賴于多基因的表達，具有相對的穩(wěn)定性。

①培養(yǎng)特征a.固體培養(yǎng)特征：菌落特征，大小、側(cè)面隆起、光澤、粘稠、顏色、邊緣、表面狀況、質(zhì)地、水溶性色素（粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)紅色或紫紅色色素）等b.半固體培養(yǎng)特征：明膠液化、鞭毛運動情況c.液體培養(yǎng)特征：表面菌膜、混濁，底部沉淀第三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日各種微生物形成的菌落特征第四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日粘液型菌落菌膜菌沉淀均勻渾濁對照固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基第五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日②細胞形態(tài)形態(tài)：球形、桿狀、弧形、螺旋形、絲狀、分枝及特殊形狀大?。浩渲凶钪匾氖羌毎膶挾然蛑睆脚帕校簡蝹€、成對、成鏈或其他特殊排列方式③特殊細胞結(jié)構(gòu)有無鞭毛、芽孢、莢膜（糖被）、菌膠團孢子：形狀、大小、顏色、著生位置、數(shù)量及排列細胞附屬物：如柄、絲狀物、鞘、異形胞等超微結(jié)構(gòu)：壁、內(nèi)膜系統(tǒng)、放線菌孢子表面特征等④細胞內(nèi)合物硫粒、異染顆粒、伴孢晶體、PHB、氣泡等第六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日⑤染色反應(yīng)革蘭氏染色、抗酸性染色抗酸性染色：分枝桿菌屬或諾卡氏菌屬的一些菌，普通方法染不上色，須加溫或長時間染色，染色后的細胞用酸或堿處理不能脫色，把具此性質(zhì)的細菌稱為抗酸性細菌（含分枝菌酸，能與石炭酸和復(fù)紅形成的復(fù)合物牢固結(jié)合，并能抵抗酸性酒精的脫色）。⑥運動性鞭毛泳動、滑行、螺旋體運動方式第七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.1.2微生物的生理生化特性生理生化特征與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)，酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物，所以，對微生物生理生化特征的比較也是對微生物基因組的間接比較，加上測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多，因此生理生化特征對于微生物的系統(tǒng)分類仍然是有意義的。在以實用為主要目的表型分類中，大量原核生物的屬和種，僅僅根據(jù)形態(tài)學(xué)特征是難以區(qū)分和鑒別的，所以生理生化特征往往是這些醫(yī)學(xué)上或其他應(yīng)用領(lǐng)域中重要細菌分類鑒定的主要特征。第八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（1）營養(yǎng)類型①光能無機自養(yǎng)型（光能自養(yǎng)型）②光能有機異養(yǎng)型（光能異養(yǎng)型）③化能無機自養(yǎng)型（化能自養(yǎng)型）④化能有機異養(yǎng)型（化能異養(yǎng)型）（2）對碳源的利用對各種單糖、雙糖、多糖以及醇類、有機酸等的利用

（3）對氮源的利用對蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸、含氮無機鹽、N2等的利用（4）對生長因子的需要對特殊維生素、氨基酸等的依賴性乳酸菌對生長因子的要求較高第九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（5）對氧的要求好氧、微好氧、厭氧及兼性厭氧

（6）對溫度的適應(yīng)性

最低溫、最適溫、最高溫、產(chǎn)物積累溫度、致死溫度（7）對PH的適應(yīng)性在一定PH條件下的生長能力及生長的PH范圍生長的PH范圍：腸道細菌較寬；血液寄生微生物較窄，因循環(huán)系統(tǒng)PH一般穩(wěn)定在7.3第十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（8）對滲透壓的適應(yīng)性對鹽濃度的耐受性或嗜鹽性

（9）對抗生素及抑菌劑的敏感性對抗生素、氰化鉀(鈉)、膽汁、石炭酸（系數(shù)）或某些染料的敏感性（10）代謝產(chǎn)物各種特征性代射產(chǎn)物如色素、有機酸、產(chǎn)氣、硫代氫、明膠液化作用大腸菌群乳糖發(fā)酵，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣第十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.1.3微生物的生態(tài)特性在自然界的分布情況與宿主關(guān)系：共生、寄生、致病性等宿主種類有性生殖情況生活史，等

第十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.1.4血清學(xué)試驗與噬菌體分型（1）血清學(xué)試驗細菌細胞和病毒等都含有蛋白質(zhì)、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物質(zhì)，不同微生物抗原物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，賦予它們不同的抗原特征。常借助特異性的血清學(xué)反應(yīng)來確定未知菌種、亞種或菌株。由于某些傳染病與特定的血清型密切相關(guān)，其分布也有一定的區(qū)域性特征，所以血清型的劃分在流行病的研究中有重要意義。通常是對全細胞或者細胞壁、鞭毛、莢膜或粘液層的抗原性進行分析比較。雖然血清學(xué)試驗被廣泛用于微生物分類鑒定的研究，但比較成功的應(yīng)用是對種內(nèi)（以及個別屬內(nèi)）不同菌株血清型的劃分。例如，根據(jù)鞭毛抗原(H抗原)蘇云金芽孢桿菌分成40多個血清型根據(jù)莢膜抗原肺炎鏈球菌分成近百個血清型根據(jù)菌體(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原將沙門氏菌屬細菌分成約2000個血清型大腸桿菌O-157第十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（2）噬菌體分型在原核生物中已普遍發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)種類的噬菌體。噬菌體對宿主的感染和裂解作用常具有高度的特異性，即一種噬菌體往往只能感染和裂解某種細菌，甚至只裂解種內(nèi)的某些菌株。所以，根據(jù)噬菌體的宿主范圍可將細菌分為不同的噬菌型和利用噬菌體裂解作用的特異性進行細菌鑒定。這對于追溯傳染病來源、流行病調(diào)查以及病原菌的檢測鑒定有重要意義。例如，鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)噬菌體已被用于對該菌的快速鑒定。在金黃色葡萄球菌引起的流行病的調(diào)查中，噬菌體分型也發(fā)揮了作用。此外，在工業(yè)生產(chǎn)中，噬菌體分型對防止噬菌體危害也有指導(dǎo)意義。第十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.2

現(xiàn)代分類鑒定依據(jù)

細胞化學(xué)成分分析鑒定法根據(jù)不同細菌和放線菌細胞壁的肽聚糖分子結(jié)構(gòu)和成分的差異，采用細胞壁成分分析法,對菌種分類鑒定有一定的作用放線菌全細胞水解液可分四類主要糖型,故采用全細胞水解液糖型分析法可進行初步分類鑒定位于細菌、放線菌細胞膜上的磷酸類脂成分,在不同屬中有所不同,可用于分類鑒別；諾卡氏菌形放線菌所含枝菌酸的碳鏈長度有明顯差別,故對枝菌酸的分析可用于屬的分類。此外，氣相色譜技術(shù)可分析微生物細胞和代謝產(chǎn)物中的脂肪酸類和醇類等成分,對厭氧菌等的鑒定很有用。

第十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.2.2核酸的堿基組成和分子雜交

與形態(tài)及生理生化特性的比較不同，對DNA的堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結(jié)果更加可信。比較DNA的堿基組成和進行核酸分子雜交，是目前通過直接比較基因組進行生物分類最常用的兩種方法。第十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（1）

DNA的堿基組成(G+C)mol%DNA的堿基組成和排列順序決定生物的遺傳性狀，所以DNA堿基組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征。分類學(xué)上，用G+C占全部堿基的摩爾百分比值（簡稱“GC比”）來表示各類生物的DNA堿基組成特征。親緣關(guān)系近的生物，它們應(yīng)該具有相似的GC比；若不同生物之間GC比差別大表明它們關(guān)系遠。但具有相似GC比的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系，因為核苷酸序列可差別很大高等植物的GC比范圍大約為35-50%；脊椎動物GC比約為35～45%之間；而原核生物中GC比變化幅度寬達22～80%，這也足以表明原核生物是一個極為多樣性的類群。

第十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日同一個種內(nèi)的不同菌株GC比差別應(yīng)在4～5%以下（差別＞5%肯定不是同一個種）(＜2%無意義，因測定方法本身的誤差可能高達2%)同屬不同種的差別應(yīng)低于10～15%，通常低于10%

（差別＞15%肯定不是同一個屬）是發(fā)表任何微生物新種時必須具有的重要指標

在疑難菌株鑒定、新種命名、建立一個新的分類單位時，G+C含量是一項重要的、必不可少的鑒定指標。其分類學(xué)意義主要是作為建立新分類單元的一項基本特征和把那些GC比差別大的種類排除出某一分類單元。第十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日測定DNA堿基組成的方法：由于熱變性溫度法操作簡單、重復(fù)性好而最為常用?；驹恚簩NA加熱，兩條單鏈逐漸被打開，從而使DNA溶液260nm紫外吸收明顯增加，稱DNA的增色效應(yīng)。G+C％增加，所需溫度也較高，當溫度高達一定值時，DNA完全分離成單鏈，此后紫外吸收不再增加。DNA的熱變性過程(即增色效應(yīng)的出現(xiàn))是在一個狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的，紫外吸收增加的中點值所對應(yīng)的溫度稱為該DNA的熱變性溫度(Tm)。在一定條件下，DNA的Tm值與DNA的G+Cmol%成正比。Tm＝69.3＋0.41（G+Cmol）％第十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（2）核酸的分子雜交①DNA-DNA雜交

基本原理：雙鏈DNA分子加熱可變性，冷卻處理時，又可復(fù)性。不僅同一菌株的DNA單鏈可以復(fù)性結(jié)合成雙鏈，來自不同菌株的DNA單鏈，只要二者具有同源互補的堿基序列，它們也會在同源序列之間互補結(jié)合形成雙鏈，這就稱之為DNA-DNA分子雜交。不同微生物之間，DNA同源程度越高，其雜交率就越高，若兩個菌株DNA分子序列完全相同，則應(yīng)100%地雜交結(jié)合。具體測定方法很多，按雜交反應(yīng)的環(huán)境可分為液相雜交和固相雜交兩大類。在這些方法中，有的需要用同位素標記DNA，有的則用非同位素標記，而"復(fù)性速率法"則是通過測定單鏈DNA分子復(fù)性結(jié)合的速率來計算DNA的同源性而不需要對DNA分子進行標記。

第二十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日細菌常用固相雜交法：

（參照菌株）A菌B菌（待測）↓↓

DNADNA↓↓（同位素標記、酶切并解鏈）單鏈單鏈（固定于濾膜上，未標記）↓最適溫度復(fù)性雜交↓洗滌↓測定放射強度↓雜交率（以參照菌株自身復(fù)性的放射性值為百分之百

）

﹥60%同一個種；﹥70%同一亞種；20～60%同屬不同種對于許多有爭議的種的界定和建立新種起了重要作用

第二十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日②

DNA-rRNA雜交rRNA是DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在生物進化過程中，其堿基序列的變化比基因組要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些堿基序列。因此，當兩個菌株的DNA-DNA雜交率很低或不能雜交時，用DNA-rRNA雜交仍可能出現(xiàn)較高的雜交率，因而可以用來進一步比較關(guān)系更遠的菌株之間的關(guān)系，進行屬和屬以上等級分類單元的分類。DNA-DNA雜交和DNA-rRNA雜交的原理和方法基本相同，只是在技術(shù)細節(jié)上有些差異，如DNA-rRNA雜交中，用同位素標記的是rRNA而不是DNA等等。第二十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日③核酸探針廣泛用于微生物鑒定、傳染病診斷、流行病調(diào)查、食品衛(wèi)生微生物檢測以及分子生物學(xué)許多領(lǐng)域。所謂核酸探針(probe)是指能識別特異核苷酸序列的、帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子。因此，一種核苷酸片斷能否作為探針用于微生物鑒定，最根本的條件是它的特異性，即它能與所檢測的微生物的核酸雜交而不能與其他微生物的核酸雜交。根據(jù)特異性的不同，在微生物鑒定與檢測中的作用也不同，有的探針只用于某一菌型的檢測，有的可能用于某一種、屬、科甚至更大類群范圍的微生物的檢測或鑒定。例如，從一株淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)隱蔽性質(zhì)粒制備的DNA探針，它具有種的特異性，可用來檢測和鑒定這種引起人類性行為傳播疾病的細菌。第二十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日使用核酸探針來鑒定或檢測微生物的方法，是將探針與所檢測的細菌進行雜交。在細菌鑒定或檢測臨床標本中的細菌時，常用菌落原位雜交法，大致步驟是：將細菌點種于硝酸纖維素膜上進行培養(yǎng)；加溶菌劑使細胞釋放出DNA分子；加變性劑使DNA離解成單鏈并固定于膜上；加入帶標記的核酸探針進行雜交；洗膜后進行顯色或顯影鑒定。用核酸探針來鑒定或檢測微生物，具有準確、快速等優(yōu)點，特別是當用常規(guī)方法難于鑒定和檢測時，往往更顯示其優(yōu)越性。第二十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

微生物全基因組序列

DNA是除少數(shù)RNA病毒以外的一切微生物的遺傳信息載體。每一種微生物都有其自身獨特而穩(wěn)定的基因組DNA序列，不同菌種間基因組序列的差異程度，代表著它們之間親緣關(guān)系的疏密。對那些與人類健康、生活和生產(chǎn)關(guān)系重大的微生物，進行全基因組DNA序列測定，是當前生物科學(xué)領(lǐng)域中掌握某微生物全部遺傳信息的最佳途徑，也是微生物現(xiàn)代分類鑒定中更細致和更精確的遺傳性狀指標。第二十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.2.4遺傳重組

大多數(shù)真核生物都能進行有性生殖，所以分類學(xué)上用能否進行有性生殖來定義物種。原核生物中，雖然沒有有性生殖，但它們可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合作用進行染色體基因的交換，這種交換通常具有種屬特異性。研究表明：發(fā)生接合、轉(zhuǎn)化和普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的細菌之間需要存在廣泛的染色體同源性，否則此類重組(同源重組)即不能發(fā)生。因此，在細菌分類中，發(fā)生同源重組可以作為細菌密切相關(guān)的證據(jù)。例如，轉(zhuǎn)化通常只在同屬內(nèi)的不同種之間發(fā)生，很少在屬間出現(xiàn)。值得注意的是：由于同源重組還涉及其他因素，當細菌之間不能發(fā)生重組時，不一定是由于DNA序列不同源，而有可能是由于其他因素所致。因此，不能以同源重組作為唯一的判斷標準。第二十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.2.5氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)的氨基酸順序直接反映mRNA順序而與編碼基因密切相關(guān)。因此，可以通過對某些同源蛋白質(zhì)氨基酸序列的比較來分析不同生物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，序列相似性越高，其親緣關(guān)系愈近。由此可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列資料構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和進行分類。一般來說，蛋白質(zhì)氨基酸順序的進化速率大體上是恒定的，但功能不同的蛋白質(zhì)常以不同的速率進化。功能重要的分子序列或序列區(qū)域往往進化變化速率低。但也有資料表明，某些蛋白質(zhì)分子其功能并非嚴格不變，進化變化速率也不恒定。所以，在研究中必須根據(jù)所比較的類群注意選擇適當?shù)姆肿?。一般來說，細胞色素和其他電子傳遞蛋白、組蛋白、熱休克蛋白、轉(zhuǎn)錄和翻譯的蛋白以及許多代謝酶的序列都可以用于微生物的分類研究。第二十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的氨基酸順序測定總的說還是很煩雜耗費間接的比較方法：電泳圖譜比較電泳圖譜比較進行分類或鑒定的前提是：親緣關(guān)系相近的微生物應(yīng)具有相似的蛋白質(zhì)，反之亦然；當把一個菌株所產(chǎn)生的系列蛋白質(zhì)在標準條件下電泳，就會產(chǎn)生特征性的電泳區(qū)帶組成的電泳圖譜(或稱蛋白質(zhì)“指紋”圖)，親緣關(guān)系相近的菌株，它們的指紋也應(yīng)相似。在細菌分類鑒定研究中，常采用可溶性蛋白或全細胞蛋白提取液進行電泳圖譜比較，或者比較同功酶的電泳遷移率。從目前資料看，蛋白質(zhì)電泳圖譜可以作為種和種以下分類和鑒定的一個指紋。對于屬以上分類單元的分類或鑒定效果較差。第二十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.2.6數(shù)值分類鑒定法所謂數(shù)值分類法，是通過廣泛比較分類單位的性狀特征（形態(tài)、生理、生化、遺傳、生態(tài)和免疫學(xué)等），然后計算它們之間的相似性，再根據(jù)相似性的數(shù)值劃分類群的一種分類方法。數(shù)值分類法的分類原則不同于傳統(tǒng)的分類法，其中最重要的區(qū)別在于：傳統(tǒng)分類法的分類特征有主次之分，而數(shù)值分類法則強調(diào)所采用的分類特征同等重要，在劃分類群時它們都具有同等的地位。第二十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日數(shù)值分類可大致分為五個步驟：①確定分類單位和選擇分類特征。數(shù)值分類最低等級的分類單位稱操作分類單位(簡稱OTU)，OTU可以是菌株，也可以是種或?qū)俚?。OTU確定后即選擇分類特征，數(shù)值分類要求特征函蓋面廣，項目數(shù)50個以上甚至幾百個；②進行特征測定或從文獻中收集有關(guān)OTU的各項特征的資料；③根據(jù)所編制的計算機程序要求，將特征資料進行編碼、標準化并輸入計算機；④由計算機計算各OTU之間的相似性（相關(guān)系數(shù)）并根據(jù)相似性的數(shù)值進行聚類分析、分群歸類；⑤輸出分類結(jié)果。第三十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日數(shù)值分類法是根據(jù)大量生物表型特征的總相似性進行分類，所以其分類結(jié)構(gòu)所表示的是一種表型關(guān)系，并不直接反映系統(tǒng)發(fā)育的自然規(guī)律，因此數(shù)值分類所劃分的類群又稱為表元(phenon)或表觀群(phemoticgroup)以區(qū)別于傳統(tǒng)的分類單元。但通過對數(shù)值分類結(jié)構(gòu)的分析，可以把其分類結(jié)果作為建立或修改傳統(tǒng)(自然)分類單元(如種、屬等)的依據(jù)。數(shù)值分類使生物分類從傳統(tǒng)分類的定性描述發(fā)展到進行定量分析的水平，其主要目的是建立一種客觀的聚類方法，并實現(xiàn)聚類過程的自動化。計算相關(guān)系數(shù)第三十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日1.3微生物的微量、簡便、快速或自動化鑒定技術(shù)如何使微生物鑒定技術(shù)快速、準確、簡易和自動化，一直是微生物學(xué)工作者研究的熱點。這方面已取得了突破性進展，許多方法技術(shù)，在微生物鑒定中廣為使用。國外的產(chǎn)品已標準化、系統(tǒng)化和商品化，主要有法國生物-梅里埃集團的API/ATB；瑞士羅氏公司的Micro-ID，Enterotube，Minitek；美國的Biolog全自動和手動細菌鑒定系統(tǒng)；日本的微孔濾膜塊等。其中API/ATB包括眾多的鑒定系統(tǒng)，共計有750種反應(yīng)，可鑒定幾乎所有常見的細菌。微量多項鑒測技術(shù)優(yōu)點突出，不僅能快速、敏感、準確、重復(fù)性好地鑒檢微生物，而且簡易，節(jié)省人力、物力、時間和空間，缺點是各系統(tǒng)差異較大，有的價格貴，有的個別反應(yīng)不準，難判定，但毫無疑問，它是微生物技術(shù)方法向快速、簡易和自動化發(fā)展的重要方向之一。

第三十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日API20E系統(tǒng)是API/ATB中最早和最重要的產(chǎn)品，也是國際上應(yīng)用最多的系統(tǒng)。該系統(tǒng)的鑒定卡是一塊有20個分隔室的塑料條，分隔室由相連通的小管和小杯組成，各小管中含不同的脫水培養(yǎng)基、試劑，或底物等，每一分隔室可進行一種生化反應(yīng)，個別的分隔室可進行兩種反應(yīng)，主要用來鑒定腸桿菌科細菌，如圖12-4所示。第三十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日鑒定未知細菌的主要過程：將菌液加入每一個分隔室培養(yǎng)后，有的分隔室的小杯中需要添加試劑，觀察鑒定卡上20個分隔室中的反應(yīng)變色情況，根據(jù)反應(yīng)判定表，判定各項反應(yīng)是陽性還是陰性反應(yīng)按鑒定卡上反應(yīng)項目從左到右的順序，每三個反應(yīng)項目編為一組，共編為七組，每組中每個反應(yīng)項目定為一個數(shù)值，依次是1、2、4，各組中試驗結(jié)果判定的反應(yīng)是陽性者記“＋”，則寫下其所定的數(shù)值，反應(yīng)陰性者記“－”，則寫為0，每組中的數(shù)值相加，便是該組的編碼數(shù)，這樣便形成了7位數(shù)字的編碼，表12-10為舉例說明用7位數(shù)字的編碼查API20E系統(tǒng)的檢索表，或輸入計算機檢索，則能將檢驗的細菌鑒定出是什么菌種或生物型。第三十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日項目名稱

ONPGADHLDCODCCITH2SURETDAIND所定數(shù)值124124124試驗結(jié)果+-+++----記下數(shù)值104120000編碼530表12-10API20E舉例說明第三十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日另一種應(yīng)用廣泛的是Enterotube系統(tǒng)，可以稱為腸道管系統(tǒng)。它的鑒定卡是由帶有12個分隔室的一根塑料管組成，每個分隔室內(nèi)裝有不同的培養(yǎng)基瓊脂斜面，能檢驗微生物的15種生理生化反應(yīng)，一根接種絲穿過全部分隔室的各種培養(yǎng)基，并在塑料管的兩端突出，被兩個塑料帽蓋著，像一根火腿腸，如圖12-5所示。第三十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日鑒定未知菌時，將塑料管的兩端帽子移去，用接種絲一端的突出尖端接觸平板上待鑒定的菌落中心，然后在另一端拉出接種絲，通過全部分隔室，使所有培養(yǎng)基都被接種，再將一段接種絲插回到4個分隔室的培養(yǎng)基中，以保持其還原或厭氧條件。圖12-6示意腸道管系統(tǒng)的接種過程。第三十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日培養(yǎng)后，有的分隔室也需加試劑。然后按API20E類似的步驟，觀察反應(yīng)變色情況，判定試驗結(jié)果陰性或陽性，寫出編碼數(shù)，形成5位數(shù)的編碼，因12個分隔中有3個分隔中的培養(yǎng)基都能觀察到2種生化反應(yīng)，此腸道管系統(tǒng)共15個反應(yīng)，可分為5個組。根據(jù)編碼查腸道管系統(tǒng)的索引，或用計算機檢索，獲得鑒定細菌的種名或生物型。第三十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日Biolog微生物自動分析系統(tǒng)是美國Biolog公司研制開發(fā)的新型自動化快速微生物鑒定系統(tǒng)，以微生物對微平板上95種碳源（96孔的細菌培養(yǎng)板）的利用情況為基礎(chǔ)從而進行微生物鑒定。獨特的原理----代謝指紋法：碳源（或氮源）利用實驗原理。不同細菌會利用不同種類的碳源（或氮源）進行新陳代謝，將每種細菌能利用和不能利用的一系列碳源（或氮源）進行排列組合，就構(gòu)成了該種細菌特定的代謝指紋。在反應(yīng)體系中加入指示劑（TTC，無色的氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)樽仙倪€原型），根據(jù)反應(yīng)的陰陽性得到某一細菌的反應(yīng)圖譜。檢測時，將待檢菌的反應(yīng)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的代謝圖譜進行對照，從而得到該細菌的檢測結(jié)果。第三十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日鑒定菌種數(shù)量：＞2000種鑒定菌種范圍：包括腸桿菌、弧菌、嗜血桿菌、奈瑟菌、葡萄球菌、鏈球菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌、厭氧菌、酵母樣真菌、絲狀真菌等儀器讀數(shù)方法：比色生化反應(yīng)數(shù)量：95個生化反應(yīng)第四十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日有一種可攜帶的檢測水中大腸桿菌數(shù)的大腸桿菌測試卡，即微孔(Milliporo)濾膜菌落計數(shù)板(圖12-7)。它是在一塊拇指大小的塑料板上，裝有一薄層脫水干燥的大腸桿菌選擇鑒定培養(yǎng)基，其上覆蓋微孔濾膜(0.45μm)，整個塑料板有一外套。第四十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日檢測時，脫下外套，將塑料板浸入受檢水中約半分鐘，濾膜僅允許1毫升水進入有培養(yǎng)基的一邊，干燥的培養(yǎng)基則吸水溶解，擴散與濾膜相連，而1毫升水中的大腸桿菌則滯留在膜的另一邊，再將外套套上，培養(yǎng)12-24小時，統(tǒng)計濾膜上形成的蘭或綠色菌落數(shù)。菌落的多少可以表明水中污染大腸菌群的狀況。該測定卡攜帶和培養(yǎng)都方便，適于野外工作和家庭使用，因可以放在人體內(nèi)衣口袋中培養(yǎng)。置換塑料板上的培養(yǎng)基，可以制成檢測各種樣品的微孔濾膜塊。第四十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.細菌的分類2.1細菌分類的依據(jù)2.1.1形態(tài)特征形態(tài)、排列、革蘭氏染色、鞭毛、芽孢、莢膜、內(nèi)含物

培養(yǎng)特征瓊脂平皿培養(yǎng)特征（菌落大小、顏色、透明度、粘稠度；邊緣、表面、隆起）明膠穿刺培養(yǎng)特征（是否液化，是否產(chǎn)生明膠酶）液體培養(yǎng)特征（是否有菌膜、混濁、沉淀）2.1.3生理特征及生化反應(yīng)（1）發(fā)育的溫度、需氧程度、最適PH、致病性、產(chǎn)毒素（2）營養(yǎng)源：碳源（單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、有機酸、醇、CO2等）、氮源（蛋白質(zhì)、蛋白胨、氨基酸、銨鹽、硝酸鹽、N2）、能源第四十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象第四十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日聚β-羥基丁酸Polyhydroxybutyricacid(PHB)硫粒sulfurglobules

第四十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日異染顆粒metachromaticgranule

－－貯藏磷元素和能量氣泡Gasvacuoles第四十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第四十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日Left:單菌染色結(jié)果(G+或G-)Right:混合菌染色結(jié)果(G+和G-)細菌細胞結(jié)構(gòu)革蘭氏染色結(jié)果及細菌分類革蘭氏染色陰性第四十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第四十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日矮小芽孢桿菌第五十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日在液體培養(yǎng)基上:

1.多數(shù)細菌呈現(xiàn)均勻渾濁（表現(xiàn)均勻生長）。

2.部分形成菌膜(專性需氧菌），在液體培養(yǎng)基表面上形成菌膜，液體透明或者稍渾濁。

3.形成菌環(huán)，在液體中間形成一圈環(huán)狀物形成沉淀。

4.在液體底部形成沉淀。第五十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第五十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（3）代謝特征a.糖發(fā)酵試驗不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞ㄤ寮追幼希┘鞍l(fā)酵管檢驗。觀察培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性；若為半固體培養(yǎng)基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力，從而進行各種細菌的鑒別。如大腸菌群：發(fā)酵乳糖第五十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日糖發(fā)酵試驗結(jié)果判斷反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述酸性變色、有氣泡分解××糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣酸性變色、無氣泡分解××糖產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣培養(yǎng)基不變色不分解××糖第五十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日糖發(fā)酵試驗第六十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日糖發(fā)酵試驗第六十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗

細菌對糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含有低有機氮的培養(yǎng)基，用以鑒定細菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗廣泛用于細菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測定細菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。第六十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日穿刺接種在上述培養(yǎng)基中。用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝1：1混合后滅菌），約加0.5－1厘米厚，以隔絕空氣為閉管，不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。適溫培養(yǎng)，觀察結(jié)果。結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿（1－2d），后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。第六十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第六十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日b.甲基紅試驗（methylredtest）腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。大腸桿菌+產(chǎn)氣桿菌–應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌第六十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第六十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日c.V-P試驗(V-Ptest)葡萄糖→丙酮酸→丙酮酸縮合脫羧

→乙酰甲基甲醇→→強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化

→二乙?！c蛋白胨中的精氨酸的胍基作用→紅色化合物（+產(chǎn)氣桿菌）無色化合物（-大腸桿菌）測定某些細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。應(yīng)用：是腸道桿菌常用的生化反應(yīng)試驗，主要用于區(qū)別大腸肝菌和產(chǎn)氣腸桿菌第六十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第六十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日葡萄糖發(fā)酵形成丙酮酸后的不同代謝途徑葡萄糖丙酮酸大量混合酸pH降至4.4以下甲基紅試劑培養(yǎng)基變紅乙酰甲基甲醇二乙酰V-P試劑培養(yǎng)基變紅脫羧第六十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日d.吲哚試驗(indoltest)細菌產(chǎn)生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)。色氨酸→吲哚（無色）＋對二甲基氨基苯甲醛→玫瑰吲哚（紅色，+大腸桿菌）不產(chǎn)吲哚（無色，-產(chǎn)氣桿菌）試驗方法：取培養(yǎng)24h培養(yǎng)液，先加入少量乙醚，搖動試管以提取和濃縮吲哚，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入吲哚試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定第七十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日Indoltest吲哚試驗tryptophan色氨酸→indole吲哚→玫瑰吲哚↑Kovac'sreagent吲哚試劑

（對二甲基氨基苯甲醛）-+E.coli蛋白胨水試管第七十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日枸櫞酸鹽利用試驗(citratetest)某些細菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鹽作為碳源，細菌生長過程中分解枸櫞酸鹽及分解培養(yǎng)基中的銨鹽后，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑呈堿性反應(yīng)。培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基試劑：溴麝香草酚藍（pH6.0以下呈黃色，pH7.6以上呈藍色）結(jié)果：培養(yǎng)基變藍：+

培養(yǎng)基不變色：－應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒別第七十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第七十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日e.硫化氫（H2S）試驗有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。含硫氨基酸→H2S＋醋酸鉛→黑色沉淀（+產(chǎn)氣桿菌）無黑色沉淀（-大腸桿菌）應(yīng)用：常用于腸道桿菌的鑒定第七十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日苯丙氨酸脫氨實驗原理：有的細菌具有苯丙氨酸脫氨酶，可使培養(yǎng)基中的苯丙氨酸脫氨，形成苯丙酮酸，后者與三氯化鐵作用，形成綠色化合物。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂試劑：10％三氯化鐵結(jié)果：加入試劑后培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色為陽性應(yīng)用：多用于腸道桿菌的鑒定第七十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第七十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日氨基酸脫羧酶的測定

有些細菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進行。當培養(yǎng)基含胺類時呈堿性反應(yīng)，使指示劑變色。

接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種，直接接種。接種后封油，對照管與測定管同時接種封油。腸肝菌科的細菌于37℃培養(yǎng)4天觀察。當指示劑（溴甲酚紫）呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。第七十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日丙二酸鹽利用試驗丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細菌鑒定中的一個鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，如丙二酸不被分解，則琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng)，抑制了三羧酸循環(huán)。接種和觀察結(jié)果：

用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基，于適溫培養(yǎng)1－2d，觀察培養(yǎng)基變色情況。

如測定培養(yǎng)基生長并變藍色（溴麝香草酚藍，pH6.0以下呈黃色，pH7.6以上呈藍色），表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。反之，如測定培養(yǎng)基未變色，而空白對照培養(yǎng)基生長，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。第七十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第八十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日f.硝酸鹽還原試驗（硝酸鹽還原酶）硝酸鹽→亞硝酸鹽→氨、氮（徹底還原）

無色→紅色（陽性）

無色（繼續(xù)如下實驗）鋅（催化劑）＋硝酸鹽→加熱→亞硝酸鹽→亞硝酸鹽試液→紅色（不能利用，陰性）仍無色（說明硝酸鹽被徹底還原，陽性）亞硝酸試劑A液：對氨基苯磺酸（磺胺酸冰醋酸溶液）B液：α-萘胺（α－萘胺乙醇溶液）第八十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日臨試前將試劑的A和B試液各0.2ml等量混合，取混合試劑約0.1ml，加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，觀察顏色變化。某些細菌能夠把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽；亞硝酸鹽與乙酸反應(yīng)生成亞硝酸；亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，形成對重氮苯磺酸；對重氮苯磺酸與α-萘胺結(jié)合，形成紅色的α-萘胺偶氮苯磺酸第八十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第八十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日g.石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時呈淡紫色，酸性時呈粉紅色，堿性呈藍色，還原時則自上而下地褪色變白。細菌對牛奶的作用有以下幾種：酸凝固――細菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，使石蕊變紅，當酸度很高時，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固――有些細菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，在中性環(huán)境發(fā)生。通常這種菌還具有酪蛋白水解酶，能分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍。胨化――細菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。胨化作用可以在酸性或堿性條件下進行。還原――細菌生長旺盛，使培養(yǎng)基氧化還原電位降低，因此石蕊還原褪色。接種與觀察結(jié)果：接種待測菌株，適溫培養(yǎng)2~3d，按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。7d后仍無變化為陰性反應(yīng)。第八十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日H.三糖鐵（TSI）瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物，穿刺接種并涂布于斜面，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基：乳糖：蔗糖：葡萄糖=10：10：1；加有酚紅本試驗可同時觀察糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。只能利用葡萄糖的細菌，葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。

第八十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第八十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日I.硫化氫-靛基質(zhì)-動力（SIM）瓊脂試驗試驗方法：以接種針穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加吲哚試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面，靜置10min，若試劑呈紅色為吲哚陽性。培養(yǎng)基未接種的下部，可作為對照。本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。第八十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.1.4微生物酶的測定

a.氧化酶（細胞色素氧化酶）氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑（鹽酸二甲基對苯二胺

）呈粉紅色~深紫色；陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。第八十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日b.過氧化氫酶的測定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解成水和氧。H2O2→H2O+O2枯草芽孢桿菌+產(chǎn)氮芽孢桿菌-

試驗方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1環(huán)培養(yǎng)18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產(chǎn)生。第八十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第九十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日c.尿素酶（Urease，脲酶）試驗有些細菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。酚紅：黃色→紅色（+普通變形桿菌）黃色（-大腸桿菌）試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，搖均，于36±1℃培養(yǎng)，觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養(yǎng)24h左右，觀察結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定，變?yōu)榉奂t色為陽性。第九十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日UreaseTest

尿素酶試驗：urea尿素ammonia氨第九十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日D.β-半乳糖苷酶（ONPG）的測定本試驗應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定由于β-半乳糖苷酶催化水解β-半乳糖苷化合物中的β-D-半乳糖苷鍵，ONPG（鄰硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷）是一種常用的色素原基質(zhì)，在β-半乳糖苷酶存在下，此無色的ONPG復(fù)合物會分解成半乳糖和鄰硝基酚（ONP），鄰硝基酚是黃色的。測定步驟：挑取1大環(huán)培養(yǎng)18h的菌苔入約0.25mL的生理鹽水中制成菌懸液，每管加1滴甲苯，搖勻（有助于酶的釋放），于37℃放置5分鐘。在菌懸液中加入0.25mL的0.75mol/LONPG，測定管置于37℃水浴培養(yǎng)。經(jīng)30分、1、2、3、……24h進行觀察，如有黃色者則為陽性。第九十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第九十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.2

簡捷分類（分類到屬）在實際生產(chǎn)中，常常要進行的菌種判別的要求并不高，而只希望快速而簡單，主要進行下列四項實驗，就可判斷常見常用細菌的屬：①顯微鏡觀察，球菌還是桿菌②革蘭氏染色，陽性還是陰性③產(chǎn)芽孢試驗④VP試驗簡捷分類表第九十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

細菌

球狀桿狀↓↓革蘭氏染色革蘭氏染色↓↓

G+G-G+G-∣奈氏菌屬∣腸桿菌及其它G-菌

V-P試驗芽孢染色

＋－＋－葡萄球菌屬鏈球菌屬芽孢桿菌屬短桿菌屬梭狀芽孢桿菌屬棒狀菌屬第九十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3

發(fā)酵工業(yè)中常用常見細菌

腸膜狀明串珠菌形態(tài)特征：球狀，成對或成鏈，G+，無芽孢，菌落灰白，小，有莢膜生理特征：微需氧或兼性厭氧，適溫20～30℃，超過55℃死亡，生長在含糖濃度高的培養(yǎng)基中生化特征：不液化明膠，能利用多種糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，生長需谷氨酸、纈氨酸與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)葡聚糖（可作代血漿）同屬：蝕橙明串珠菌、戊糖明串珠菌（可作乳制品發(fā)酵菌種）第九十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3.2枯草芽孢桿菌形態(tài)特征：桿狀，G+，有芽孢，無莢膜，鞭毛周生或側(cè)生，菌落粗糙。生理特征：好氧或兼性厭氧，適溫30～39℃生化特征：液化明膠（能產(chǎn)生蛋白酶），胨化牛奶，利用淀粉，還原硝酸鹽與生產(chǎn)關(guān)系：蛋白酶、淀粉酶生產(chǎn)用菌同屬：蘇云金芽孢桿菌、炭疽桿菌2.3.3醋化醋桿菌形態(tài)特征：桿狀；革蘭氏染色幼齡G-，有的菌株老齡不穩(wěn)定；無芽孢；運動或不運動生理特征：嚴格好氧，適溫30℃，PH4～6.3生化特征：乙醇、乳酸鹽是良好碳源，不利用乳糖、糊精和淀粉與生產(chǎn)關(guān)系：釀醋（加乙醇能氧化為醋酸）同屬：膠醋酸桿菌（使醋變質(zhì)，生產(chǎn)中應(yīng)除去）、紋膜醋酸桿菌（使葡萄酒發(fā)酸）第九十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3.4德氏乳酸桿菌形態(tài)特征：桿狀，成鏈狀排列，無芽孢，不運動，革蘭氏染色不穩(wěn)定（G+→G-），菌落粗糙生理特征：厭氧，適溫40～44℃，PH5.5～5.8，在平皿上不形成菌落，而通入5～10％CO2能形成菌落生化特征：不胨化牛奶，不產(chǎn)生吲哚，不產(chǎn)生H2S，接觸酶、氧化酶陰性，營養(yǎng)要求復(fù)雜，需氨基酸、短肽、維生素、核酸衍生物，能利用糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣與生產(chǎn)關(guān)系：制作酸乳、干酪發(fā)酵菌劑同屬：干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌第九十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3.5乳鏈球菌形態(tài)特征：球狀，鏈狀排列，無芽孢，革蘭氏染色G+，不運動〕生理特征：兼性厭氧，適溫37℃，PH6.8～7.2，在6.5％NaCl培養(yǎng)基中能生長生化特征：能發(fā)酵多種糖產(chǎn)酸，不液化明膠，不胨化牛奶，不水解淀粉，對石蕊牛奶有還原作用，營養(yǎng)要求復(fù)雜，需氨基酸、嘌呤、維生素、短肽與生產(chǎn)關(guān)系：酸乳制品的發(fā)酵菌劑同屬：化膿鏈球菌、溶血性鏈球菌（能引起咽喉?。┑谝话夙摚惨话傥迨?，2022年，8月28日2.3.6大腸埃希氏桿菌（糞便污染指示菌）形態(tài)特征：桿狀，近球菌，單個或成對，G-，無芽孢，有莢膜，菌落白色生理特征：需氧或兼性厭氧，適溫37℃，寄生于溫血動物的腸道內(nèi)，離開腸道可生存數(shù)月生化特征：能分解利用多種糖（葡萄糖、乳糖、麥芽糖）產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能利用尿素，不胨化牛奶，不液化明膠，利用絲氨酸能產(chǎn)生吲哚，甲基紅陽性，V-P試驗陰性，H2S陰性與生產(chǎn)關(guān)系：糞便污染指示菌，是谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶的生產(chǎn)菌種，蘇氨酸、纈氨酸生產(chǎn)菌種，基因工程“工程菌”（接受外源基因）同屬：（致病性）大腸桿菌第一百零一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3.7丙酮丁醇梭菌形態(tài)特征：桿狀，單個或成對，G+，有芽孢（膨大），運動或不運動生理特征：專性厭氧，適溫37℃，PH6.0～7.0生化特征：液化明膠，使石蕊中乳產(chǎn)酸凝固、產(chǎn)氣，不胨化牛奶，能利用多糖、淀粉、糊精，生產(chǎn)丙酮、丁醇、乙醇、丁酸與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)丙酮、丁醇同屬：巴氏芽孢梭菌（能固定N2）、溶纖維芽孢梭菌（能分解纖維素）、肉毒芽孢梭菌（分解蛋白質(zhì)能力很強）、破傷風芽孢梭菌（無分解糖、蛋白質(zhì)能力，只能利用氨基酸作為碳源、氮源）第一百零二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日2.3.8北京棒狀桿菌形態(tài)特征：短桿狀、棒狀，單個，斷裂后成“八”字排列，G+，無芽孢，不運動，有莢膜生理特征：好氧或兼性厭氧，適溫26～37℃，PH6.0～7.5生化特征：不液化明膠，不胨化牛奶，能利用多種糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，需要生物素為生長因子與生產(chǎn)關(guān)系：生L－谷氨酸（味精）同屬：白喉棒狀桿菌第一百零三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日3.放線菌的分類3.1放線菌的分類依據(jù)特點：①原核生物；②有菌絲、孢子，直徑與細菌相似；③細胞壁成分為肽聚糖；④易受噬菌體感染；⑤與細菌相似，對多種抗生素敏感；⑥PH6.0～7.0，G+地位：原核生物界·細菌門·真細菌綱·放線菌亞綱·放線菌目分類依據(jù)：以形態(tài)和培養(yǎng)特征為主第一百零四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日培養(yǎng)特征高氏（Ⅰ號）合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～15天觀察：①孢子絲、孢子的顏色：白、灰、黃、紅、綠等②氣生菌絲的顏色：白灰等③基內(nèi)菌絲的顏色：黃、紅、綠、紫、褐等④分泌可溶性色素的顏色：水溶性、脂溶性形態(tài)特征①基內(nèi)菌絲：直徑，斷裂方式（不規(guī)則斷裂：嗜皮菌科；垂直方向斷裂：放線菌科）②氣生菌絲：有無，直徑③孢子絲：直立、彎曲、螺旋、輪生、對生④孢子：表面結(jié)構(gòu)（是否平滑、刺突、毛發(fā)），鞭毛第一百零五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日放線菌菌落形態(tài)第一百零六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日垂直彎曲叢生單輪（無螺旋）松環(huán)初級螺旋鉤狀松螺旋緊螺旋單輪（有螺旋）雙輪（無螺旋）雙輪（有螺旋）第一百零七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第一百零八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第一百零九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

生理生化明膠液化淀粉水解纖維素水解牛奶的利用（凝固、胨化）對各種糖的利用

噬菌體和血清學(xué)反應(yīng)3.2簡捷分類主要通過菌落觀察及油鏡鏡檢第一百一十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

放線菌

具有良好的菌絲體一般無氣生菌絲無氣生菌絲，基內(nèi)菌有分枝、無橫隔↓絲無橫隔、不斷裂↓基內(nèi)菌絲有橫隔，↓孢子絲多種多樣孢子絲盤卷形成球形，能斷裂成桿形、球形孢子單個著生于基具有各種顏色孢囊內(nèi)有無鞭毛的孢囊孢子內(nèi)菌絲的短梗頂端↓孢子↓↓

鏈霉菌屬↓諾卡氏菌屬

小單孢菌屬

孢囊鏈霉菌屬第一百一十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日3.3常見放線菌

鏈霉菌屬形態(tài)：菌絲發(fā)達，上千個種與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)抗生素，2000～3000種抗生素，用于臨床、植保，現(xiàn)實用的有50多種代表種：委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（生產(chǎn)氯霉素）、卡拉鏈霉菌（卡拉霉素生產(chǎn)用菌）

諾卡氏菌屬形態(tài)：菌絲不發(fā)達（只產(chǎn)基內(nèi)菌絲）與生產(chǎn)關(guān)系：產(chǎn)生30多種抗生素，治療結(jié)核、麻瘋病（利福霉素），石油脫蠟、烴類發(fā)酵，可用于含腈污水處理代表種：地中海諾卡氏菌（生產(chǎn)利福霉素用菌）第一百一十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

小單孢菌屬形態(tài)：孢子單生，基內(nèi)菌絲無橫隔、不斷裂與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)抗生素，能利用氮化物和碳水化合物，也可用于污水處理代表種：降紅小單孢菌（生產(chǎn)慶大霉素用菌）

孢囊鏈霉菌屬形態(tài)：菌絲發(fā)達與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)抗生素，抑制細菌、病毒、腫瘤，產(chǎn)生多霉素代表種：粉紅孢囊鏈霉菌（生產(chǎn)多霉素用菌）第一百一十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日4

酵母的分類

4.1酵母分類的依據(jù)地位：真菌門·子囊菌綱和不完全菌綱（半知菌綱）

無性繁殖和生長特點①營養(yǎng)細胞的生長特點a.液體和固體培養(yǎng)基上的生長特點液體：菌膜、混濁、沉淀固體：菌落（大小、顏色、粘稠）b.假菌絲和真菌絲假菌絲：酵母出芽后，芽長大而沒有脫落于母體，接觸面積小，藕節(jié)狀。真菌絲：酵母以裂殖方式，長出竹節(jié)狀細胞串（較少見）。第一百一十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日酵母菌的菌落啤酒酵母菌落與細菌的相仿，但由于細胞比細菌的大，細胞內(nèi)有許多分化的細胞器，細胞間隙含水量相對較少，以及不能運動等特點，因此菌落較大、較厚、外觀較稠和較不透明。第一百一十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日②無性繁殖a.芽殖：絕大多數(shù)的繁殖方式b.裂殖：較少數(shù)。中間產(chǎn)生橫隔，將細胞一分為二。裂殖酵母屬c.擲孢子：少數(shù)。在酵母母體上先長出小梗，然后在小梗上長出孢子，成熟后將孢子擲遠處。擲孢酵母屬d.厚坦孢子：有的產(chǎn)生，酵母壁較厚，如假絲酵母中的酵母菌。

有性繁殖①有無：有（子囊菌），無或沒發(fā)現(xiàn)（半知菌）②子囊孢子的數(shù)目（4或8個），孢子形態(tài)，表面第一百一十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

生理生化①碳源的利用a.發(fā)酵各種糖的能力酵母發(fā)酵糖類時會產(chǎn)生CO2和乙醇，可根據(jù)產(chǎn)生的多少或產(chǎn)不產(chǎn)氣來判定酵母對某種糖的發(fā)酵能力。b.碳源同化能力凡某一酵母能發(fā)酵某種糖，就能同化（利用）這種糖，所以只需做那些不能被發(fā)酵的碳源。糖類以外的有機物如乙醇的同化作用，也是酵母分類的重要標志之一。測試碳源的種類，包括糖類、醇類、糖苷和有機酸共32種。第一百一十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日②氮源的利用a.明膠液化b.硝酸鹽利用c.脲酶試驗③是否產(chǎn)酯酯具有芳香味，用嗅覺可以判斷，是鑒定某些酵母的指標。第一百一十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日④產(chǎn)酸測定一般酵母均能生產(chǎn)一定量的酸，但量并不大，且多數(shù)酵母還能消化自身所產(chǎn)生的酸。但也有些酵母能產(chǎn)大量的酸，如酒香酵母屬的酵母。酸+CaCO3→溶解→透明圈⑤分解脂肪測定

脂酶+鈣鹽

脂肪→脂肪酸→脂肪酸鈣（白堊狀）4.2

簡捷分類第一百一十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

酵母菌

芽殖裂殖擲孢子↓↓↓假菌絲形成裂殖酵母屬擲孢酵母屬

－＋↓↓子囊孢子形成子囊孢子形成

－＋－＋↓↓↓↓紅色素孢子形狀假絲內(nèi)孢霉屬形成↓酵母屬

－＋球形尖帽、半球形↓↓↓↓圓酵紅酵表面表面硝酸鹽的利用母屬母屬有刺無刺↓↓－＋德巴利酵母屬↓↓酵母屬畢赤氏漢遜酵母屬酵母屬第一百二十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日4.3

常見酵母

酵母屬形態(tài)：圓形、橢圓形、香腸形，無真菌絲，有的假菌絲繁殖無性：芽殖，多極出芽，有性：子囊孢子，1～4個，生活史：單倍體、雙倍體生理生化：能發(fā)酵多種糖（半乳糖、棉子糖），產(chǎn)生CO2＋乙醇，不能同化乳糖，不同化硝酸鹽、尿素，脲酶試驗“－”，不能利用淀粉與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)乙醇、酒、面包、飼料等代表種：啤酒酵母、釀酒酵母、面包酵母第一百二十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

漢遜氏酵母屬形態(tài)：圓柱形、橢圓形、球形，有的有真菌絲或假菌絲，繁殖無性：芽殖，多邊芽殖，有性：子囊孢子1～4個，多數(shù)產(chǎn)生2個，孢子呈帽形、半圓形，表面光滑生理生化：發(fā)酵產(chǎn)生少量乙醇或不發(fā)酵，同化葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不同化乳糖，同化硝酸鹽，脲酶“－”與生產(chǎn)關(guān)系：產(chǎn)生乙酸乙酯的生產(chǎn)菌種代表種：異常漢遜氏酵母、土星漢遜氏酵母第一百二十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

假絲酵母屬形態(tài)：圓形、臘腸形，有假菌絲，有的真菌絲，也可形成厚垣孢子繁殖：無性、多邊芽殖，未發(fā)現(xiàn)有性繁殖生理生化：有酒精發(fā)酵能力，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖，不能發(fā)酵半乳糖，不同化乳糖，利用碳氫化合物，產(chǎn)生單細胞蛋白，硝酸鹽“＋/－”，脂肪“－/＋”與生產(chǎn)關(guān)系：生產(chǎn)單細胞蛋白（SCP），生產(chǎn)檸檬酸，產(chǎn)脂肪酶代表種：產(chǎn)朊假絲酵母、解脂假絲酵母、熱帶假絲酵母第一百二十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

紅酵母屬形態(tài)：圓形、臘腸形，產(chǎn)紅/黃色素繁殖：無性，多邊芽殖，未發(fā)現(xiàn)有性繁殖生理生化：無酒精發(fā)酵能力，能同化葡萄糖、麥芽糖，不同化乳糖，能產(chǎn)脂肪，硝酸鹽“－/+”，脲酶“－”與生產(chǎn)關(guān)系：合成β－胡蘿卜素代表種：粘紅酵母、深紅酵母

裂殖酵母屬形態(tài)：圓柱形，可形成真菌絲繁殖：無性裂殖；有性繁殖產(chǎn)1～8個子囊孢子生理生化：能發(fā)酵多種糖，不同化乳糖，硝酸鹽“－”，脲酶“＋”與生產(chǎn)關(guān)系：高產(chǎn)酒精代表種：八孢裂殖酵母、粟酒裂殖酵母第一百二十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日5

霉菌的分類（不產(chǎn)大型肉質(zhì)子實體）產(chǎn)小型子實體的絲狀真菌。地位：藻狀菌綱·子囊菌綱·半知菌綱5.1分類依據(jù)5.1.1菌落形態(tài)生長和發(fā)育速度：培養(yǎng)一定天數(shù)后，測量菌落直徑，以生長極慢、慢、中等和快來說明顏色：孢子顏色，菌絲顏色，背面顏色表面：平滑或有皺紋，致密或疏松，有無同心環(huán)或輻射狀溝紋質(zhì)地：棉絮狀、絨毛狀、氈狀、粉粒裝、皮革狀等滲出物：如青霉，常在菌落表面出現(xiàn)帶顏色的液滴另有邊緣、高度、培養(yǎng)基顏色變化、氣味等第一百二十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日

產(chǎn)黃青霉菌落圖青霉“帚”

第一百二十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日由粗而長的分枝狀菌絲組成，菌落疏松，呈絨毛狀、絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀，比細菌菌落大幾倍到幾十倍，有的沒有固定大小。各種霉菌，在一定培養(yǎng)基上形成的菌落大小、形狀、顏色等相對穩(wěn)定，所以菌落特征也為分類依據(jù)之一。霉菌的菌落第一百二十七頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日青霉的菌落青霉的菌落各種曲霉的菌落第一百二十八頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日霉菌的菌落形態(tài)1.產(chǎn)黃青霉2.紫紅曲3.點青霉4.黑曲霉5.米曲霉第一百二十九頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日5.1.2個體形態(tài)①菌絲假根分生孢子梗形態(tài)營養(yǎng)菌絲匍匐菌絲氣生菌絲孢子囊梗形態(tài)足細胞直徑，有無橫隔膜②子實體（顏色、形狀、大小、結(jié)構(gòu)等）無性：分生孢子頭、孢子囊（頭）有性：子囊果（閉囊殼、子囊殼、子囊盤）③孢子（大小、顏色、形狀、表面特征）無性：分生孢子、孢子囊孢子、節(jié)孢子、厚垣孢子有性：子囊孢子、接合孢子、卵孢子第一百三十頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日匍匐菌絲、假根（類似樹根，吸收營養(yǎng)），功能是固著和吸收營養(yǎng)。第一百三十一頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第一百三十二頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日子囊果按其外形可分3類

①閉囊殼（cleistothecium）：完全封閉式，呈球圓形Eg.不整囊菌綱②子囊殼（perithecium）：子囊果似燒瓶狀，有孔口Eg.核菌綱③子囊盤（apothecium）：開口的、盤狀的子囊果Eg.盤菌綱第一百三十三頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日第一百三十四頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日厚垣孢子

某些霉菌種類在菌絲中間或頂端發(fā)生局部的細胞質(zhì)濃縮和細胞壁加厚，最后形成一些厚壁的休眠孢子，稱為～。Eg.毛霉屬中的總狀毛霉第一百三十五頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（1）卵孢子：菌絲分化成形狀不同的雄器和藏卵器，雄器與藏卵器通過授精管結(jié)合后所形成的有性孢子叫卵孢子。第一百三十六頁，共一百五十三頁，2022年，8月28日（2）接合孢子：由菌絲分