細胞培養(yǎng)的基本條件演示文稿

細胞培養(yǎng)的基本條件演示文稿當前1頁，總共65頁。（優(yōu)選）細胞培養(yǎng)的基本條件當前2頁，總共65頁。一、實驗室設計及設備器材1.細胞培養(yǎng)室設計原則及要求◆保證無微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影響具體工作：器皿洗刷試劑和培養(yǎng)液的配制制備細胞孵育細胞傳代細胞的凍存、復蘇和運輸當前3頁，總共65頁。◆必須樹立無菌觀念，堅持一貫的無菌操作，進行無菌處理?！魧嶒炇覒譃闊o菌室、準備室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室須分隔開外，無菌室和準備室可在同一房間內，但需劃分出不同功能區(qū)，即無菌操作區(qū)和培養(yǎng)、觀察區(qū)。無菌觀念當前4頁，總共65頁。1）無菌室◆為無菌操作而設計的空間，包括操作間和緩沖間?！舨僮鏖g又可分為細胞室和感染室◆緩沖間能保護無菌間的無菌環(huán)境，可兼有更換無菌衣帽和進行一些簡單操作（如放孵育箱、離心等）的功能?！粽麄€面積約10m2，通入經(jīng)濾過的無菌空氣，與周圍實驗室比較應保持正壓，常備紫外燈，室內其他陳設盡量減少。當前5頁，總共65頁。

無菌室結構模式圖

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當前6頁，總共65頁。使用無菌室時應按以下順序：①熟悉實驗計劃，背鰭必要的材料和器具，杜絕試驗過程中反復出入無菌室。②傳戴無菌衣帽和口罩。③關閉殺菌燈，通過一定路線拿如必要物品（應盡量減少出入的次數(shù)）。④手部消毒后再進行操作。⑤完成實驗后將用完的物品移出室外。⑥擦凈實驗臺，退出后打開滅菌燈。當前7頁，總共65頁?！蠲咳眨ㄊ褂们埃┳贤庹丈洌?－2小時），☆每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）☆每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒?！顚嶋H工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。無菌室的維護當前8頁，總共65頁?！钭⒁夥乐篃o菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風沒有被過濾除菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。

當前9頁，總共65頁。2）超凈工作臺（凈化工作臺）比較密閉，分垂直流和側流式，外界空氣通過濾器從上面、側面或正面流入操作箱內，并能形成氣流屏障，以保持臺面無菌。超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環(huán)境。

當前10頁，總共65頁。超凈臺的使用與保養(yǎng)：★平均風速保持在米/秒為宜★使用前最好開啟超凈臺內紫外燈照射10－30分鐘，然后讓超凈臺預工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；★使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺當前11頁，總共65頁。無菌工作臺操作布局示意圖當前12頁，總共65頁。3）無菌箱當前13頁，總共65頁。（1）大型設備工具類

①無菌室、實驗室、超凈工作臺、無菌操作箱等②二氧化碳（CO2）孵箱、恒溫孵箱、試管架2.設備器材當前14頁，總共65頁。CO2培養(yǎng)箱設定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。當前15頁，總共65頁。倒置顯微鏡③倒置顯微鏡、普通顯微鏡、實體解剖顯微鏡及照相系統(tǒng)當前16頁，總共65頁。④高速離心機（水平式500～4000r/min）⑤普通、低溫冰箱及液氮裝置⑥藥品柜、器械柜、實驗臺等當前17頁，總共65頁。（2）消毒滅菌設備①高壓蒸汽滅菌器②干熱滅菌器③濾過器（蔡氏濾器、微量超濾膜濾器等）④紫外燈、離子發(fā)生器⑤耐酸耐高溫容器、吸管自動沖洗器、玻璃器皿清洗箱當前18頁，總共65頁。（3）配液用具①蒸餾水制作系統(tǒng)、陰離子交換樹脂裝置。②天平稱量系統(tǒng)。③pH儀或試紙（精密）④量筒、漏斗、溶量瓶、磁力攪拌器等當前19頁，總共65頁。（4）制備、培養(yǎng)、保存細胞用品①刀、剪、鑷等解剖用具，80～200目尼隆網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)，血細胞計數(shù)板②培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)管、培養(yǎng)板（4、6、12、24、48、96孔）、離心管③吸管、滴管、吹打管、試管④500ml、250ml、100ml、50ml等溶液瓶⑤渦流混勻器、恒溫磁力攪拌器、恒溫水浴鍋等⑥細胞凍存管等當前20頁，總共65頁。當前21頁，總共65頁。培養(yǎng)板當前22頁，總共65頁。培養(yǎng)瓶當前23頁，總共65頁。酶標儀微孔板震蕩器當前24頁，總共65頁。二、實驗器材的處理防止微生物污染和細胞污染1.清洗1）玻璃器皿的清洗（1）浸泡★新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，★然后用5％鹽酸浸泡過夜；★用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應立即浸入清水中備刷洗。當前25頁，總共65頁。★注意讓水灌滿瓶皿，以利充分浸泡、沖洗?！镉形廴镜钠髅蟊仨毾认緶缇笤俳?、沖洗。（2）刷洗★軟毛刷★優(yōu)質洗滌劑或專用洗滌劑★輕刷，不宜刷洗次數(shù)太多當前26頁，總共65頁。（3）浸酸◆器皿干燥后浸酸◆器皿內要充滿清潔液，勿留氣泡◆注意安全◆浸清潔液處理后的器皿必須徹底沖洗（4）沖洗◆自來水流水沖洗◆蒸餾水沖洗3遍當前27頁，總共65頁。清潔液配制注意事項①選用耐酸塑料桶或不銹鋼桶配置為宜⑤清潔液腐蝕性極強，配置與應用時必須小心，做好防護④清潔液配好后呈棕紅色，帶邊綠色是標明失效③緩緩加入濃硫酸，切忌過急，否則將大量產熱而發(fā)生危險（決不可將重鉻酸鉀液倒入濃硫酸中）②先將重鉻酸鉀溶于水中（用玻璃棒攪拌助溶，有時不能完全溶解）當前28頁，總共65頁。清洗示意圖白箭頭：玻璃制品黑箭頭：橡膠制品

back當前29頁，總共65頁。2）塑料器皿沖洗流水沖洗晾干后包裝，以備滅菌蒸餾水漂洗3次2％～5％鹽酸浸泡30min自來水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）浸泡過夜晾干自來水沖洗當前30頁，總共65頁。3）膠塞等橡膠類用品的處理自來水沖洗2％氫氧化鈉（NaOH）煮沸15min2％～5％鹽酸煮沸15min蒸餾水漂洗5次以上晾干后包裝自來水沖洗自來水沖洗5次以上蒸餾水煮沸10min烘干備用高壓滅菌當前31頁，總共65頁。4）金屬器械的清洗新的先用沾有汽油的紗布擦去油脂再用水洗凈最后用乙醇棉球擦拭，晾干用過的先以清水煮沸消毒，再擦拭干凈使用前以蒸餾水煮沸10分鐘，或包裝好后101.3kPa高壓滅菌15分鐘當前32頁，總共65頁。5）除菌濾器的處理2、包裝目的：防止消毒滅菌后再次遭受污染包裝材料：包裝類型：常用的包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙或棉線繩局部包裝全包裝當前33頁，總共65頁。3、消毒滅菌1.干烤7.抗生素消毒滅菌6.熏蒸消毒5.射線4.紫外線2.高壓蒸汽滅菌3.濾過滅菌當前34頁，總共65頁。當前35頁，總共65頁。消毒劑類別名稱濃度(%)用途重金屬鹽紅汞2皮膚、粘膜、小創(chuàng)面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化劑高錳酸鉀0.1皮膚、尿道、水果、蔬菜消毒過氧化氫3皮膚、粘膜、創(chuàng)傷消毒過氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纖維消毒鹵素類碘液2.5皮膚消毒醇類乙醇70～75皮膚、體溫計消毒酚類石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒來蘇3～5同上、也常用于手及皮膚消毒表面活性劑新潔爾滅0.1手術器械消毒酸堿類生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龍膽紫2～4表淺創(chuàng)傷消毒8.化學消毒劑當前36頁，總共65頁。三、培養(yǎng)用液是維護組織細胞生存、生長及進行細胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶液平衡鹽溶液（balancedsaltsolution,BSS）天然培養(yǎng)液合成培養(yǎng)液當前37頁，總共65頁。1.細胞培養(yǎng)對水的要求純化水蒸餾水（三蒸水）存放時間最好不要超過2周（一）離子交換裝置（二）蒸餾水裝置當前38頁，總共65頁。2.平衡鹽溶液主要成分：無機鹽葡萄糖酚紅：指示劑常用的BSS種類：（一）Hanks液（三）PBS液（二）Earle液當前39頁，總共65頁。BSS的配制要求：①要防止鈣的沉淀②要有良好的緩沖作用主要用途：①作為配制培養(yǎng)液的基礎溶液②配制各種試劑③用于洗滌組織和細胞當前40頁，總共65頁。水：新鮮配置的三蒸水或去離子水1.pH7.2PBS貯備液（10×）配法

NaCl8.5gKCl0.2gNa2HPO4﹒12H2O2.85gKH2PO40.27g

溶于100ml雙蒸水中2.PBS使用液配法貯備液50ml

雙蒸水450ml細胞培養(yǎng)用液的配制當前41頁，總共65頁。成分RingerPBSEarleHanksDulbeccoD-HanksNaCl(g)8.008.006.808.008.008.00KCl(g)0.420.200.400.400.200.40CaCl(g)0.25

0.200.140.10

MgCL·6H2O(g)

0.10

MgSO4·7H2O(g)

0.200.20

Na2HPO4·H2O(g)

1.56

0.06

0.06NaH2PO4·2H2O(g)

0.14

1.42

KH2PO4(g)

0.20

0.060.200.06NaHPO4(g)

2.200.35

0.35葡萄糖(g)

1.001.00

酚紅(g)

0.020.020.020.02幾種常用的BSS配方（g/L）當前42頁，總共65頁。3.細胞培養(yǎng)常用試劑1）細胞分離液（消化液）：胰蛋白酶依地酸二鈉（disodiumedetate,EDTA-2Na）膠原酶常用的消化液：當前43頁，總共65頁。

◆胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。◆胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。◆胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。（1）胰蛋白酶當前44頁，總共65頁。◆蛋白酶液消化時間：2-10分鐘?！糇钸m作用條件為pH8.0、37℃◆用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用當前45頁，總共65頁。（2）EDTA(0.01-0.02%)◆一種化學螯合劑，其溶液又稱Versene液◆對細胞有一定的解離作用◆毒性小，價格低廉，使用方便當前46頁，總共65頁。（3）胰酶-EDTA◆分散細胞效力好◆濃度分別為0.25和0.02%◆

-20℃保存，不易反復凍融當前47頁，總共65頁。（4）膠原酶(1-5mg/ml)◆從溶組織芽孢梭菌等細菌的培養(yǎng)液中分離得到的一組對膠原蛋白有較強水解作用的酶?！裟z原蛋白富含甘氨酸、羥脯氨酸，普通的蛋白水解酶對其的水解能力弱?！舴N類多，不同生化試劑公司的產品種類、純度、酶活性都有一定差異?！粢话闩涑?0×貯備液，使用前作10倍稀釋當前48頁，總共65頁。2）pH調整液◆細胞生長的最適pH為7.0～7.2，可耐受的pH范圍是6.6～7.8。◆合成培養(yǎng)液大多呈弱酸◆常用的調正液

NaHCO2；7.4%，5.6％，3.7％

HEPES:10-50mmol/L1NHCL10%HAC1NNaOH當前49頁，總共65頁?！艏毎囵B(yǎng)液PH濃度的調節(jié)最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)，◆羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其對細胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH迅速變動的特性而用于開放細胞培養(yǎng)技術中，其最大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細胞觀察時能維持較恒定的PH值。當前50頁，總共65頁?！舳趸技仁羌毎x產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH值?！舸蠖鄶?shù)細胞的適宜PH為，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。有資料顯示，原代羊水細胞培養(yǎng)PH6.8時最適。當前51頁，總共65頁。3）抗菌素溶液：◆在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長?！舫Ｓ糜星嗝顾?、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、兩性霉素B等，常聯(lián)合使用。◆常配成100×或200×濃度，分裝，冷凍保存，使用前加入培養(yǎng)液中。當前52頁，總共65頁。抗生素液鏈霉素(100ug/ml)

青霉素(100單位/ml)

制霉菌素(100單位/ml)

終濃度不超過萬分之一為宜當前53頁，總共65頁?？股貪舛?量/ml）抗菌范圍貯存使用真菌細菌支原體青霉素G10000u100u＋＋＋＋＋＋鏈霉素10000μg100μg＋＋＋慶大霉素10000u

50u＋＋卡那霉素

5000μg

50μg＋＋＋多粘菌素

5000μg

50μg＋＋四環(huán)素

1000μg

10μg＋＋＋＋紅霉素

5000μg

50μg＋＋兩性霉素B

500μg

5μg＋＋＋＋制菌霉素

5000u

25μg＋＋＋＋金霉素10000μg

50μg

＋＋＋＋抗生素用量和抗菌范圍當前54頁，總共65頁。4）L-Glutamin溶液◆制備時取L-Glutamin（分子量146.15）6g，溶于三蒸水200ml中，濾過除菌，分裝，－20℃冰凍保存◆每100ml培養(yǎng)液中加1mlL-Glutamin溶液當前55頁，總共65頁。4.常用培養(yǎng)基◆培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，◆按其物質狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；◆按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。當前56頁，總共65頁。天然培養(yǎng)基（naturalmedia)：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限，成分復雜，個體差異大影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染當前57頁，總共65頁。（1）雞血漿的制備血漿含有纖維蛋白和一些營養(yǎng)成分，與雞胚胎汁混合會發(fā)生凝固，構成組織細胞生長的環(huán)境，有利于細胞向三維空間生長。制備為選擇1年左右體大、健壯的雄雞，禁食1天，從雞翅取血，混勻離心取上清，分裝，－20℃保存當前58頁，總共65頁。①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子③激素；④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分（2）血清當前59頁，總共65頁。一般說來．含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死．但支持細胞生長一般需加10％血清．對于血清支持細胞生長的生物學效應已得到證明，但對血清中的復雜成分至今尚未完全清楚．血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，