人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案

附件2人感染高致病性禽流感標(biāo)本采集及試驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案為剛好、科學(xué)地采集和運(yùn)輸人禽流感病例或疑似污染環(huán)境等各種類型的標(biāo)本，規(guī)范試驗(yàn)室檢測(cè)程序和檢測(cè)方法，提高檢測(cè)質(zhì)量，明確診斷或開展相關(guān)科學(xué)探討，特制定本方案。1采集對(duì)象1.1人禽流感醫(yī)學(xué)視察病例、疑似病例、臨床診斷病例及須要進(jìn)一步探討的確診病例。1.2其它須要進(jìn)行人禽流感診斷或解除者。1.3須要采集的環(huán)境標(biāo)本。2采集要求2.1從事人禽流感檢測(cè)標(biāo)本采集的技術(shù)人員必需經(jīng)過(guò)生物平安培訓(xùn)和具備相應(yīng)的試驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過(guò)程中，采樣人員參照（附件5）規(guī)定的防護(hù)措施進(jìn)行平安防護(hù)。2.2住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防限制機(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。2.3標(biāo)本采集詳細(xì)種類和數(shù)量由現(xiàn)場(chǎng)工作組確定。2.4親密接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防限制機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。2.5依據(jù)試驗(yàn)室檢測(cè)工作的須要，結(jié)合病程再次采樣。3標(biāo)本種類每個(gè)病例應(yīng)盡可能同時(shí)采集上、下呼吸道標(biāo)本；須要解除人禽流感的死亡病例則依據(jù)《傳染病病人或疑似傳染病病人尸體解剖查驗(yàn)規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部令第43號(hào)）的規(guī)定采集尸體標(biāo)本，沒有條件進(jìn)行尸體解剖的，可采集呼吸道灌洗液或經(jīng)皮穿刺采集肺組織標(biāo)本。3.1上呼吸道標(biāo)本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液、深咳痰液。最佳采集時(shí)間為發(fā)病后3天內(nèi)。3.2下呼吸道標(biāo)本：包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本。3.3尸檢標(biāo)本：病人死亡后應(yīng)依法盡早進(jìn)行解剖，在嚴(yán)格依據(jù)生物平安防護(hù)的條件下，進(jìn)行尸檢，主要采集肺、氣管組織標(biāo)本，條件允許下也可采集肝、腎、脾、心臟、腦、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本。3.4血清標(biāo)本：每一病例必需采集血清標(biāo)本，須采集急性期、復(fù)原期雙份血清。第一份血清應(yīng)盡早（最好在發(fā)病后7天內(nèi)）采集，其次份血清應(yīng)在發(fā)病后第3～4周采集。采集量要求5ml，以空腹血為佳，建議運(yùn)用真空采血管。3.5其它標(biāo)本：假如病例有腹瀉癥狀，可在發(fā)病后采集糞便標(biāo)本；有胸水者可采集胸水標(biāo)本。4標(biāo)本采集方法4.1咽拭子：用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時(shí)擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。4.2鼻拭子：將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)退出。取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔。上述兩根拭子浸入同一含3ml采樣液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。4.3鼻咽抽取物或呼吸道抽取物：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出，收集抽取的粘液，并用3ml采樣液沖洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集器）。4.4咽漱液：用10ml不含抗菌素的采樣液漱口。漱口時(shí)讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢”聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動(dòng)。然后將咽漱液收集于50ml無(wú)菌的螺口塑料管中。無(wú)條件的可用平皿或燒杯收集咽漱液并轉(zhuǎn)入10ml螺口采樣管中。4.5深咳痰液：要求病人深咳后，將咳出的痰液收集于50ml含3ml采樣液的螺口塑料管中。4.6呼吸道灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管（約30cm深處），注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來(lái)替代收集）。4.7胸水:在B超定位下進(jìn)行胸腔穿刺，抽取胸水5ml，置于無(wú)菌的塑料螺口管中。4.8肺組織活檢標(biāo)本：在超聲或X線定位下,經(jīng)皮穿刺取肺組織活檢標(biāo)本,置于含3ml采樣液的塑料螺口管中。4.9尸檢標(biāo)本：每一采集部位分別運(yùn)用不同消毒器械，以防交叉污染；每種組織應(yīng)多部位取材，各部位應(yīng)取20～50g，淋巴結(jié)取2個(gè)。4.10糞便標(biāo)本：采集5～10g糞便置于含5～10ml采樣液無(wú)菌螺口管中，嚴(yán)格密封。4.11血清標(biāo)本：用真空負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本5ml，室溫靜置30分鐘，1500～2000rpm離心10分鐘，收集血清于2ml無(wú)菌螺口塑料管中。注：常用的采樣液配方為：pH7.4～7.6的Hanks氏液或MEM/DMEM液。在采樣液中需加入抗菌素，可用青霉素（終濃度為100U/ml）、慶大霉素（終濃度為1mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為2μg/ml）。5標(biāo)本包裝標(biāo)本采集后在生物平安Ⅱ級(jí)試驗(yàn)室生物平安柜內(nèi)分裝成一式三份（分裝標(biāo)本的生物平安柜不能用于提取核酸）。一份當(dāng)?shù)貦z測(cè)用，一份送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心檢測(cè)，一份保存以備復(fù)核。5.1全部標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的塑料管里，擰緊。容器外注明樣本編號(hào)、種類、姓名及采樣日期。5.2將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。5.3標(biāo)本有關(guān)信息填寫“疑似人感染高致病性禽流感/不明緣由肺炎病例標(biāo)本送檢單”見《疑似人感染高致病性禽流感/不明緣由肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)），用另一塑料袋密封。6標(biāo)本保存用于病毒分別和核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，24小時(shí)內(nèi)能檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃保存，24小時(shí)內(nèi)無(wú)法檢測(cè)的標(biāo)本則應(yīng)置于-70℃或以下保存。如無(wú)－70℃保存條件，則于－20℃冰箱暫存。血清可在7標(biāo)本送檢7.1上送標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性或可疑的原始標(biāo)本或分別物應(yīng)剛好送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心復(fù)核和進(jìn)一步檢測(cè)；省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)試驗(yàn)室檢測(cè)陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例的標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心進(jìn)一步檢測(cè)。7.2標(biāo)本運(yùn)輸?shù)纳锲桨惨笠罁?jù)《病原微生物試驗(yàn)室生物平安管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院424號(hào)令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第45號(hào)令）等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。7.3標(biāo)本送檢的程序各?。▍^(qū)、市）須要向中國(guó)疾病預(yù)防限制中心送檢標(biāo)本時(shí)，應(yīng)事先與中國(guó)疾病預(yù)防限制中心疾病限制與應(yīng)急處理辦公室聯(lián)系。詳細(xì)要求見《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第45號(hào)令）、《疑似人感染高致病性禽流感/不明緣由肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》（中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)）。8試驗(yàn)室生物平安從事人禽流感檢測(cè)的技術(shù)人員必需經(jīng)過(guò)生物平安培訓(xùn)和具備相應(yīng)的試驗(yàn)技能，在檢測(cè)的過(guò)程中必需實(shí)行生物平安Ⅲ級(jí)防護(hù)。不同的標(biāo)本檢測(cè)生物平安級(jí)別要求如下。8.1標(biāo)本的分裝和核酸提取在生物平安Ⅱ級(jí)試驗(yàn)室的生物平安柜內(nèi)進(jìn)行，病毒培育物的核酸提取必需在生物平安Ⅲ級(jí)試驗(yàn)室的生物平安柜內(nèi)進(jìn)行。8.2標(biāo)本的抗原快速檢測(cè)在生物平安Ⅱ級(jí)試驗(yàn)室的生物平安柜內(nèi)進(jìn)行。8.3人禽流感病毒的分別、鑒定必需在生物平安Ⅲ級(jí)試驗(yàn)室里進(jìn)行。8.4采納滅活抗原進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清抗體時(shí)，要求在生物平安Ⅱ級(jí)試驗(yàn)室內(nèi)操作。采納微量中和試驗(yàn)進(jìn)行血清抗體檢測(cè)必需在生物平安Ⅲ級(jí)試驗(yàn)室操作。8.5陽(yáng)性標(biāo)本和分別物的保存及銷毀應(yīng)依據(jù)《病原微生物試驗(yàn)室生物平安管理?xiàng)l例》（國(guó)務(wù)院第424號(hào)令）執(zhí)行。9標(biāo)本的試驗(yàn)室檢測(cè)9.1核酸檢測(cè)：方法包括RT-PCR和Real-TimePCR，建議運(yùn)用國(guó)家流感中心或世界衛(wèi)生組織舉薦的引物和探針。9.2抗原快速檢測(cè)方法包括ELISA法和金標(biāo)法，本方法僅具參考價(jià)值，不作為診斷依據(jù)。9.3病毒分別及鑒定：采納SPF雞胚和MDCK細(xì)胞分別方法。病毒的鑒定采納血凝抑制試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)或序列測(cè)定。9.4血清學(xué)檢測(cè)：方法包括微量中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單擴(kuò)溶血試驗(yàn)。以上試驗(yàn)室檢測(cè)方法詳見《全國(guó)流感/人感染高致病性禽流感監(jiān)測(cè)實(shí)施方案》。10檢測(cè)結(jié)果的推斷和報(bào)告10.1各檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)性報(bào)告H5基因核酸檢測(cè)：A型特異性引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物，兩對(duì)H5亞型特異性引物都能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物?？乖焖贆z測(cè)：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果推斷為陽(yáng)性。病毒分別及鑒定：分別出病毒，并經(jīng)鑒定為H5亞型或H5N1亞型。血清學(xué)檢測(cè)：雙份血清抗體滴度4倍或以上增高有診斷意義。10.2各檢測(cè)項(xiàng)目陰性報(bào)告H5基因核酸檢測(cè)：兩對(duì)H5亞型特異性引物均不能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物?？乖焖贆z測(cè)：依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果推斷為陰性。病毒分別：培育物紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)陰性。血清學(xué)檢測(cè)：血清抗體滴度＜1:20為陰性。10.3H5基因核酸檢測(cè)不一樣兩對(duì)H5亞型特異性引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果不一樣時(shí)，則對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，假如為H5N1病毒序列，則推斷為陽(yáng)性。標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果有關(guān)信息填寫“人感染高致病性禽流感標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果反饋表”（詳細(xì)見《疑似人感染高致病性禽流感/不明緣由肺炎病例標(biāo)本送檢、接收、檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告反饋工作流程》中疾控疾發(fā)[2005]526號(hào)）。11試驗(yàn)室檢測(cè)流程應(yīng)采集人禽流感檢測(cè)對(duì)象上呼吸道標(biāo)本和下呼吸道標(biāo)本進(jìn)行禽流感病毒的核酸檢測(cè)和病毒分別，同時(shí)要采集病例的急性期和復(fù)原期血清標(biāo)本進(jìn)行H5N1亞型特異性抗體檢測(cè)。原則上，先由省級(jí)及以下疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)進(jìn)行初步檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心復(fù)核；省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)試驗(yàn)室檢測(cè)陰性，且有明確流行病學(xué)證據(jù)的病例標(biāo)本送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心進(jìn)一步檢測(cè)。省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)不具備檢測(cè)條件的，送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心或鄰近具備相應(yīng)條件和資格認(rèn)證的省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。詳細(xì)步驟見人感染高致病性禽流感標(biāo)本試驗(yàn)室檢測(cè)流程圖。12人禽流感試驗(yàn)室檢測(cè)職責(zé)12.1中國(guó)疾病預(yù)防限制中心職責(zé)對(duì)省級(jí)以及其它人禽流感檢測(cè)試驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，并對(duì)上送的標(biāo)本做進(jìn)一步檢測(cè)。對(duì)不具備禽流感病毒核酸檢測(cè)、病毒分別條件的省級(jí)上送的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)需做微量中和試驗(yàn)的血清標(biāo)本進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。對(duì)分別到的禽流感病毒株做抗原及基因分析。剛好向送檢標(biāo)本的機(jī)構(gòu)反饋檢測(cè)結(jié)果。對(duì)省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)試驗(yàn)室人員進(jìn)行試驗(yàn)室技術(shù)和生物平安培訓(xùn)。對(duì)省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)試驗(yàn)室供應(yīng)技術(shù)和試劑支持并進(jìn)行質(zhì)量限制。對(duì)省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)的試驗(yàn)室檢測(cè)和生物平安工作進(jìn)行督導(dǎo)。12.2省級(jí)疾病預(yù)防限制機(jī)構(gòu)職責(zé)對(duì)轄區(qū)內(nèi)人禽流感標(biāo)本的采集工作供應(yīng)技術(shù)指導(dǎo)和物質(zhì)支持，必要時(shí)干脆參加標(biāo)本的采集。依據(jù)生物平安要求，對(duì)采集到的標(biāo)本進(jìn)行禽流感病毒的核酸檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)和抗原檢測(cè)。獲得國(guó)家認(rèn)證的生物平安Ⅲ級(jí)試驗(yàn)室才可開展病毒分別和微量中和試驗(yàn)。依據(jù)生物平安要求妥當(dāng)保存原始標(biāo)本或禽流感病毒株。符合上送條件的標(biāo)本或毒株按規(guī)定剛好送中國(guó)疾病預(yù)防限制中心。剛好向中國(guó)疾病預(yù)防限制中心上報(bào)人禽流感檢測(cè)的相關(guān)信息。剛好向送檢標(biāo)本的機(jī)構(gòu)反饋檢測(cè)結(jié)果。依據(jù)疫情的發(fā)展和工作須要，向中國(guó)疾病預(yù)防限制中心申請(qǐng)指定轄區(qū)內(nèi)符合