血紅蛋白的提取和分離時

血紅蛋白的提取和分離時第1頁/共39頁血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵血紅素基團每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：第2頁/共39頁1.分離生物大分子的基本思路：

選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。

一、血紅蛋白的提取和分離第3頁/共39頁一、基礎知識（一）凝膠色譜法（分配色譜法）根據(jù)

分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝膠是一些微小的多孔球體，由多糖類化合物（如葡聚糖、瓊脂糖等）構成。凝膠粒相對分子質(zhì)量的大小第4頁/共39頁原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時相對分子質(zhì)量較小相對分子質(zhì)量較大凝膠內(nèi)部的通道容易進入無法進入凝膠內(nèi)部的通道只能在凝膠外部移動路程較長移動速度較慢路程較短移動速度較快相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。第5頁/共39頁分子量大小直徑大小大于凝膠顆?？障吨睆?，被阻擋在顆粒的外面運動方式垂直向下移動運動速度較快運動路徑較短洗脫次序先從凝膠柱洗脫出來小于凝膠顆粒空隙直徑，可以進入顆粒內(nèi)部垂直向下移動，無規(guī)則擴散進入顆粒內(nèi)部較慢較長后從凝膠柱洗脫出來第6頁/共39頁4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程第7頁/共39頁第8頁/共39頁

（二）緩沖溶液1.概念:

在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強酸或強堿的影響使原來溶液PH值基本保持不變的混合溶液。

能夠抵制外界的酸和堿對溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制:

通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。4.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察(紅色)和科學研究(活性)磷酸緩沖液第9頁/共39頁1.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。2.原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.電泳的類型：瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（三）電泳第10頁/共39頁陽極（+）陰極（—）帶正電的離子帶負電的離子電泳原理示意圖帶電性質(zhì)以及分子大小，形狀的不同分子遷移速度不同，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。第11頁/共39頁電泳檢測結果瓊脂糖凝膠電泳第12頁/共39頁

聚丙烯酰胺凝膠電泳1、在測定蛋白質(zhì)分子量時常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結構的凝膠。N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應第13頁/共39頁

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。

（SDS的作用）為了消除凈電荷對遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理：

SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3.SDS作用機理:第14頁/共39頁用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳，根據(jù)已知分子量的標準蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標準蛋白試劑出售。第15頁/共39頁使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第16頁/共39頁1.血液有哪些成分？二、實驗操作：樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定知識回顧血液血漿水分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細胞白細胞血小板紅細胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團第17頁/共39頁2.用雞的紅細胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提??；人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。第18頁/共39頁

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程

本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。(1)紅細胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過少。②洗滌操作：1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。第19頁/共39頁(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯

，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第20頁/共39頁(4)透析：(粗分離)

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。第21頁/共39頁透析過程動畫演示第22頁/共39頁練習鞏固1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結構B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)第23頁/共39頁2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較第24頁/共39頁2.凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。第25頁/共39頁（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠,浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第26頁/共39頁

④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。（2）凝膠色譜柱的裝填50cm高注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。第27頁/共39頁（3）樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第28頁/共39頁（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。第29頁/共39頁第30頁/共39頁ＡＣＤ凝膠色譜柱取長為40cm，內(nèi)徑為1．6cm，有關說法中，正確的是(多選)A．一般凝膠色譜柱直徑的大小不影響分離的效果B．凝膠色譜柱過高超過1m，不影響分離的效果C．凝膠色譜柱過矮，則影響混合物的分離度D．凝膠色譜柱直徑過大會耗用過多洗脫液，樣品的稀釋度過大第31頁/共39頁（三）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：3.方法步驟：（略）第32頁/共39頁收集得到的純化后的蛋白第33頁/共39頁

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？第34頁/共39頁三、實驗結果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了