實(shí)驗(yàn)八不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳賈躍騰羅世翔實(shí)驗(yàn)八：不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳賈躍騰羅世翔一、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)（P138）

實(shí)驗(yàn)分組（每人做一管，每組配一份膠）

認(rèn)清試劑（試劑和吸管對(duì)號(hào)、量器的使用）

封管

分離膠配制與灌膠（濃度為6%，化學(xué)聚合，A1C2H2G5，每組總體積為10ml，灌膠高度為7-8cm）

封正丁醇3mm（手法、高度、15min左右出現(xiàn)折光線時(shí)可進(jìn)行下一步操作）1.1分離膠的配制注意事項(xiàng)：1、封管要嚴(yán)，防止漏液。2、固定玻璃管要豎直，防止夾碎。3、每組配一份膠，試劑與移液管對(duì)號(hào)，準(zhǔn)確加量。4、配膠后立即灌膠（用滴管灌膠，用后立即清洗）5、正丁醇沿管壁緩緩加入濃縮膠配制（濃度為3%，光聚合，B1D2E1F4，每組總體積為8ml）

倒掉正丁醇灌濃縮膠（灌膠高度為1.5cm,上面留1cm空隙加樣）

封正丁醇3mm（觀察界面，10分鐘左右出現(xiàn)折光線時(shí)可倒去正丁醇）

1.2濃縮膠的配制注意事項(xiàng)：1、倒掉正丁醇，用濾紙吸干再灌濃縮膠。2、配膠后立即灌膠（用滴管）3、灌膠后立即清洗滴管，防止膠凝固于管中。4、撕掉封口膜，用膠塞將玻璃管固定于電泳槽上（豎直，防漏）5、加電極緩沖液（注意液面）安裝電泳槽（結(jié)構(gòu)、原理、電流及電極的方向、不漏水、除氣泡）

加buffer（沒(méi)過(guò)上下管口）

樣品處理并加樣（20ul）

電泳（6mA/管，距底1cm時(shí)停止）

剝膠

固定（時(shí)間5min）

染色（時(shí)間2min）

漂洗脫色至背景透亮1.3安裝、加樣、電泳

二、電泳基本原理及相關(guān)知識(shí)

2.1電泳的概念

帶電粒子（膠體顆粒、離子等）在電場(chǎng)的作用下在特定的介質(zhì)中向與其電荷性質(zhì)相反的電極方向定向泳動(dòng)的現(xiàn)象。廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離和鑒定.2.2電泳的基本原理利用物質(zhì)的兩個(gè)差異來(lái)分離物質(zhì)1.電荷差異

(1)電荷性質(zhì)

(2)電荷數(shù)量2.分子差異

(1)分子大小

(2)分子形狀2.3電泳分離蛋白質(zhì)的原理蛋白質(zhì)兩性解離與等電點(diǎn)若向蛋白質(zhì)溶液中加入適量的酸或堿，使羧基和氨基的解離度相同，此時(shí)溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（PI）。

2.

溶液pH與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)決定蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)與數(shù)量3.

不同蛋白質(zhì)分子大小和分子形狀的差異

2.4實(shí)驗(yàn)室中常用到的電泳方法（以介質(zhì)分類）1.紙電泳：是最早使用的一種電泳技術(shù)，濾紙為支持物2.醋酸纖維膜電泳：醋酸纖維膜為其支持物3.凝膠電泳（1）瓊脂糖凝膠電泳（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

3.仇1聚丙杏烯酰層胺凝聲膠電較泳原器理聚丙濕烯酰欲胺凝泊膠電順泳(p宋ol昂ya氏cr憲yl花am續(xù)id火e騰ge乎l敢el愈ec貧tr奴op奇ho旺re寒si扛s，簡(jiǎn)衛(wèi)稱PA陶GE校)是以焰聚丙桿烯酰把胺凝蓋膠作廈為支句持介徒質(zhì)的簡(jiǎn)一種湯常用德電泳喇技術(shù)限。1、聚嬌丙烯與酰胺偶凝膠控由單體母丙烯厲酰胺和甲基硬雙丙有烯酰處胺聚合挪而形臥成的鬼三維來(lái)網(wǎng)狀濟(jì)結(jié)構(gòu)明，聚傳合過(guò)朽程由籌自由退基催頓化完坡成。2、催?；勰z合的尋常用鋪方法胖有兩憐種：鐵化學(xué)敬聚合竭法和赴光聚采合法估。(1隨)在化洲學(xué)聚左合過(guò)擦程中門(mén)，以過(guò)硫亭酸銨鋒（AP）為催疤化劑帥，以四甲旗基乙濃二胺冷（TE拉ME跡D）為加雅速劑,玩TE促M(fèi)E另D催化AP產(chǎn)生毛自由換基；(2區(qū))在光移聚合翻過(guò)程膀中，殖以核黃弱素為催惱化劑規(guī)，光羨催化暈核黃激素產(chǎn)壯生自蠢由基繁。自丈由基任引發(fā)農(nóng)丙烯可酰胺話單體晝聚合耗，同逮時(shí)甲咐基雙指丙烯娃酰胺荷與丙她烯酰麻胺鏈閱間產(chǎn)嫩生甲鹿基鍵犯交聯(lián)貪，從居而形新成三職維網(wǎng)射狀結(jié)功構(gòu)。3.虎2聚丙套烯酰疊胺凝玩膠的疫特性(1裁)在一葵定濃連度時(shí)矮，凝老膠透禽明，質(zhì)有彈份性，甚機(jī)械饒性能林好；(2僚)化學(xué)孝性能顯穩(wěn)定拍，與闖被分萬(wàn)離物序不起繩化學(xué)西反應(yīng)脆，在首很多趙溶劑壞中不跪溶；(3丑)對(duì)pH和溫藍(lán)度變卵化較勝穩(wěn)定月；(4搖)幾乎兄無(wú)吸塔附和電電滲饒作用識(shí)，只報(bào)要Ac萄r純度櫻高，尊操作浮條件伍一致蹲，則產(chǎn)樣品故分離逃重復(fù)凱性好肝；(5濁)樣品振不易怪?jǐn)U散策，且岸用量像少，潔其靈好敏度熔可達(dá)10-6g(6敵)凝膠幸孔徑頸可調(diào)妻節(jié)，鞏根據(jù)盞被分徑離物肅的分根子量籃選擇輪合適摩的濃艱度，傍通過(guò)備改變乖單體券及交番聯(lián)劑悉的濃嶄度調(diào)磨節(jié)凝拔膠的襪孔徑莫；(7悅)分辨欲率高吳，尤有其在無(wú)不連侮續(xù)凝墓膠電恥泳中譯，集撫濃縮耕、分葬子篩絨和電厭荷效撐應(yīng)為谷一體鹿。因粒而較送醋酸治纖維爛薄膜沙電泳呀、瓊雪脂糖仔電泳宿等有嫁更高行的分竹辨率微。3.沖3聚丙親烯?；虬纺⒛z電桿泳的淹分類1.根據(jù)舒其有摩無(wú)濃躺縮效移應(yīng)，宮分為間：（1）連端續(xù)系跑統(tǒng)——連續(xù)田系統(tǒng)音電泳努體系憑中緩濾沖液pH值及凍凝膠背濃度蠅相同粱，帶瘋電顆糠粒在免電場(chǎng)桌作用米下，精主要檔靠電待荷和茂分子珠篩效淹應(yīng)（2）不居連續(xù)遭系統(tǒng)——不連凈續(xù)系新統(tǒng)中協(xié)由于藝緩沖棍液離耳子成珠分，pH，凝年膠濃衰度及余電位艙梯度磚的不蓄連續(xù)園性，賓帶電燭顆粒睬在電寺場(chǎng)中翻泳動(dòng)尸不僅窯有電箏荷效稼應(yīng)，捷分子盤(pán)篩效予應(yīng)，霜還具請(qǐng)有濃倍縮效盲應(yīng)，沖因而豎其分翅離條倒帶清河晰度必及分能辨率啦均較膚前者鑰佳。2.根據(jù)友蛋白縣質(zhì)樣終品變正性與尺否，賣(mài)分為摧：（1）變明性電騾泳——也就男是SD飾S-掃PA余GE，蛋燦白質(zhì)看失去川二三禿級(jí)結(jié)沫構(gòu)；（2）非冶變性沖電泳——蛋白絹質(zhì)能磁夠保沖持完治整狀箭態(tài)，催并依哀據(jù)蛋隸白質(zhì)堡的分弱子量樂(lè)大小爹、蛋倦白質(zhì)青的形介狀及經(jīng)其所漁附帶貸的電日荷量睜而逐吐漸呈娘梯度檢分開(kāi)役。3.根據(jù)換電泳嚴(yán)槽體緣瑞系的乖類型踢，分棗為：（1）圓幻玉盤(pán)電至泳（2）板妄狀電方泳兩者架電泳庭原理盯完全斧相同遵。四、焦變性絡(luò)聚丙搭烯酰鵲胺凝霉膠電順泳沒(méi)（SD覆S-陡PA能GE）SD武S-滔PA脫GE僅根躬據(jù)蛋險(xiǎn)白質(zhì)驅(qū)亞基舌分子全量的光不同服就可獵以分概開(kāi)蛋蔬白質(zhì)依。該頓技術(shù)星最初歡由sh杠ap蝴ir摟o于19銳67年建映立，民他們示發(fā)現(xiàn)奮在樣召品介汗質(zhì)和罷丙烯攝酰胺名凝膠俘中加杯入離曠子去呆污劑打和強(qiáng)籌還原纖劑后林，蛋老白質(zhì)摩亞基話的電冷泳遷意移率作主要棵取決栽于亞核基分左子量抹的大拜?。ㄒ呖梢酝秃雎陨n電荷烏因素車(chē)），尾其原討理在尋于：1.去電舍荷：由于SD箏S（十轟二烷扶基硫饅酸鈉勒）產(chǎn)匹生的牽十二扮烷基塵硫酸民根帶韻負(fù)電迅，使辦各種華蛋白趣質(zhì)-S惱DS復(fù)合君物都促帶上無(wú)相同掩密度丈的負(fù)補(bǔ)電荷鋤，它榴的量誓大大先超過(guò)伶了蛋值白質(zhì)抄分子具原的榮電荷隆量，兩因性而掩乒蓋了莊不同哀種蛋昨白質(zhì)剪間原泳有的拳電荷茅差別妻；2.破壞掃結(jié)構(gòu)衰：SD倆S能斷籃裂分叔子內(nèi)灰和分別子間崇的氫油鍵，書(shū)使分飄子去秀折疊裕，破宏壞蛋幕白分困子的旋二、蟻三級(jí)論結(jié)構(gòu)規(guī)。如且果蛋醫(yī)白質(zhì)繭是由蒸不同滾的亞成基組囑成的榴，它巷在電亦泳中作可能旅會(huì)形專成分繳別對(duì)箭應(yīng)于烘各個(gè)距亞基邊的幾話條帶發(fā)；3.統(tǒng)一猛構(gòu)象烈：SD副S與蛋遠(yuǎn)白質(zhì)殊結(jié)合鵲后，西還可遍引起據(jù)構(gòu)象勻改變囑，蛋給白質(zhì)-S績(jī)DS復(fù)合行物形蛾成近繁似“雪茄問(wèn)煙”形的里長(zhǎng)橢鎖圓棒蘭，不渾同蛋額白質(zhì)況的SD須S復(fù)合蒸物的啟短軸妄長(zhǎng)度唉都一蔬樣，杠約為18疤A；這樣鍬的蛋娛白質(zhì)-S則DS復(fù)合艘物，燥在凝菠膠中稿的遷賠移率允，不暢再受與蛋白攤質(zhì)原丘來(lái)的侮電荷壘和形瓜狀的丹影響評(píng)，而收取決斑于分杯子量子的大英小。SD巧S-臣PA蕩GE的原荷理四、桌不連飄續(xù)聚榆丙烯吳酰胺挪凝膠兄電泳4.逮1不連執(zhí)續(xù)PA俗GE的原憂理三個(gè)械不連耽續(xù)三個(gè)筑效應(yīng)凝膠矛孔徑嚷不同緩沖情液pH不同緩沖飲液離糕子成派分不漂同濃縮抽效應(yīng)電荷趣效應(yīng)分子勾篩效迫應(yīng)4.獲2不連撕續(xù)體種系的欄組份不連外續(xù)體托系由膀濃縮俘膠、托分離笨膠及濾電極芹緩沖叮液所仍組成榆。1.濃縮閣膠是疊由核河黃素變催化今聚合希而成爬的大倘孔膠針，凝擋膠緩慚沖液劣為pH旺6.溜7的Tr獎(jiǎng)is固-H嫌C1。2.分離味膠是監(jiān)由AP催化劑聚合蒜而成海的小肯孔膠況，凝產(chǎn)膠緩稻沖液有為pH革8.貿(mào)9黨Tr酬is夫-H效C1。3.電極洪緩沖掙液是pH胡8.沫3沒(méi)Tr悶is夕-甘氨蟻酸緩蔬沖液思。2種孔鹽徑的搬凝膠融、2種緩蟲(chóng)沖體菊系、3種pH值使想不連皺續(xù)體員系形集成了執(zhí)凝膠甘孔徑秩、pH值、止緩沖陷液離假子成麥分的辭不連旦續(xù)性綱，這疤是樣健品濃融縮的踏主要漆因素唯。4.某3樣品待濃縮崇效應(yīng)1.凝膠己孔徑衣不連前續(xù)性口；2.緩沖激體系奮離子猛成分玻及pH值的嗚不連快續(xù)性寸；在pH附6.書(shū)7的凝怎膠緩四沖體性系中前導(dǎo)相離子悠或快烏離子糧：HC弓1解離眾出的診氯根(C徹1-)尾隨旗離子(t蜂ra垂il踢in壺g光io夸n)或慢殺離子國(guó)：甘逐氨酸坦根mclcl>mpp>mGG(C謙l代表株氯根匪，P代表管蛋白滲質(zhì)，G代表匠甘氨記酸根)有效配遷移偵率=m，m為遷血移率襲，為解賭離度)當(dāng)進(jìn)已入pH拜8.口9的分薦離膠斬時(shí)，魯甘氨濱酸解布離度按增加寄，其價(jià)有效系遷移畏率超攔過(guò)蛋閃白質(zhì)讀；3.電位格梯度自的不姻連續(xù)論性。Gl策y-Pr黑o-Cl-Gl巾y-Pr卻o-Cl