第三章 層析技術(shù)

第三章層析技術(shù)Chromatography作者：王英聯(lián)系電話、概述

層析（Chromatography）又稱為色譜,它利用混合物中各組分的物理、化學(xué)性質(zhì)間的差異(溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附力、分子親和力等)，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。

1、分配系數(shù)(Partitionchromatography)

混合物在層析過程中不管層析技術(shù)采用的流動相和固定相是哪種狀態(tài)都要達(dá)到分配平衡。敘述一種物質(zhì)在兩種特定的相中的分配程度用分配系數(shù)（K）來表示。在特定溫度時這個系數(shù)是一個常數(shù)。 溶質(zhì)在固定相中的濃度 Cs

K=———————————=——

溶質(zhì)在流動相中的濃度Cm

從一個混合物中分離、純化樣品的純度如何，取決于混合物中各組分K值的差異程度。

混合物中各組分若K值相差較大,則較易把混合物中的各樣品分離。反之,K值相差較小,則不易分離。2、塔板理論在層析分析過程把層析柱劃分(想象)為若干個連續(xù)部分,每個部分稱為一個塔板。理論板數(shù)(n)：在層析柱上，溶劑連續(xù)不斷加入，化合物在流動相和固定相中不斷分配平衡，所發(fā)生的平衡次數(shù)稱為理論板數(shù)。色譜歷史古羅馬人分析混合染料（類似輻射紙色譜）1903年，MichaelTswett提出色譜法1931年，Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年，Martin和Synge提出分配色譜法1944年，Martin等又提出紙色譜法1952年，Martin和James發(fā)明了氣液色譜法1955年，第一臺商品氣相色譜問世，標(biāo)志著現(xiàn)代色譜分析的建立1956年，Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC)1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析儀，確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色譜(high-performanceliquidchromatography,HPLC)儀1975年，Small等提出離子色譜

20世紀(jì)80年代，超臨界色譜20世紀(jì)90年代，毛細(xì)管電泳（1809年Re?ss第一次電泳實(shí)驗(yàn)）21世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展

層析法進(jìn)行時有兩個相組成，一個為固定相(Stationaryphase)，另一個為流動相(Mobilephase)。由于各組分所受的在固定相的阻力和流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得到分離。二、層析的一般原理三、層析技術(shù)的分類

(一)按兩相所處的物態(tài)分類以液體作為流動相的稱為液相層析以氣體作為流動相的稱為氣相層析其固定相也可有兩種狀態(tài):以固體作為吸附劑的固定相以涂布在固體表面的液體作為固定相（二）按固定相形式分類1、柱層析（columchromatography）將固定相裝在層析柱中2、紙層析（paperchrmatography）紙作為固定相3、薄層層析（thinlayperchromatography）將吸附劑在玻璃板或其他材料薄板上鋪成薄層作為固定相（三）按層析過程的機(jī)制可分類

1、吸附層析(adsorptionchromatography)利用不同組分吸附能力的不同進(jìn)行分離2、分配層析(partitionchromatography)利用不同組分配系數(shù)不同進(jìn)行分離3、離子交換層析（ion-exchangechromatography）

利用離子交換劑與各組分之間的靜電力不同4、凝膠層析（gelchromatography）利用不同組分之間分子大小不同進(jìn)行分離5、親和層析（affinitychromatography）利用生物大分子之間特有親和力的不同進(jìn)行分離

第一節(jié)凝膠層析

GelChromatography

一、概念：凝膠層析：按照被分離物質(zhì)分子大小,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔凝膠物質(zhì)進(jìn)行分離的一種方法。又稱為凝膠過濾或分子篩過濾或排阻層析。

主要機(jī)理是分子篩效應(yīng),當(dāng)被分離物質(zhì)流經(jīng)凝膠柱時,因各組份的分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。將樣品加入凝膠柱后,分子大的組份不能進(jìn)入凝膠中被排阻在外,而分子的小能通過孔隙進(jìn)入凝膠中。加入洗脫劑后,大分子就隨洗脫劑從凝膠顆粒間隙洗脫下來,其流程短流速快,而小分子物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又?jǐn)U散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復(fù)即流程長,故大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)后流出而得到分離。二、基本原理

大分子不能進(jìn)入凝膠孔隙中,被排阻在外,受到阻力小,流程短，流速快，先從柱中流出。

小分子進(jìn)入凝膠孔隙中,阻力大，流程長，流速慢，后從中柱流出

。

三、凝膠層析的數(shù)理關(guān)系

1、柱床體積(VT)：即凝膠顆粒的體積以及外部間隙體積的總和。2、洗脫體積（Ve）：即欲分離物質(zhì)被洗脫下來所需的洗脫液的體積。3、外水體積（V0）：即凝膠顆粒間隙水的體積，相應(yīng)于流動相的體積。4、內(nèi)水體積（Ｖｉ）：即凝膠顆粒內(nèi)所含水的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。5、凝膠顆粒干體積（Ｖｇ）ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

洗脫體積（Ｖｅ）與Ｖｏ及Ｖｉ之間的關(guān)系

Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉＫｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ

Ｋｄ為分子量不同的樣品組分在凝膠內(nèi)部和外部兩相間的分配系數(shù)。它與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小有關(guān)，而與柱的長短粗細(xì)等物理條件無關(guān)。

Kd=0時,Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,在固定相分布為0,全部分布于流動相里而最先流出。當(dāng)Kd=1時,Ve=Vo+Vi,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.當(dāng)0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd為處于兩種極端行為之間的分子。

凝膠層析柱洗脫的三部分示意圖

凝膠層析優(yōu)點(diǎn)：1.凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。2.凝膠層析的操作條件較溫和。3.樣品得率高,重復(fù)性好。缺點(diǎn)：1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用,如芳香族化合物與脂蛋白等。四、常用凝膠的結(jié)構(gòu)與性能（一）葡聚糖凝膠：（二）瓊脂糖凝膠（三）聚丙烯酰胺凝膠

（一）葡聚糖凝膠：

葡聚糖凝膠是用交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷使線狀的葡聚糖之間通過醚鍵交聯(lián)聚合成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。葡聚糖凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)孔的大小取決于交聯(lián)劑的百分含量。交聯(lián)劑的百分含量高,交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)緊密,吸水后膨脹小,網(wǎng)孔小，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低,凝膠網(wǎng)孔大，分離物質(zhì)的分子量也大。

瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠,其工作范圍的下限是Sephadex的上限,可分離MW40萬以上的物質(zhì),因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷,不受微生物作用而降解,但對熱不穩(wěn)定,易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定）.

Sephadex為葡聚糖凝膠的商品名，葡聚糖凝的型號表示每克干凝膠吸水值的10倍,如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。主要種類：G-10，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，G-200Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸和堿,耐熱耐堿但不耐酸。（二）瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)（三）聚丙烯酰胺凝膠

使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似,但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定,可在pH2～11范圍內(nèi)使用。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-GelP），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。五、凝膠層析的應(yīng)用

1、分離純化（蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖等）2、脫鹽3、高分子溶液的濃縮4、測分子量（一）凝膠的選擇凝膠顆粒的大小直接影響分離效果。細(xì)粒凝膠柱流速低，分辨率高，多用于精制分離或分析。粗粒凝膠柱流速高，分辨率低，多用于粗制分離，如脫鹽等。凝膠層析經(jīng)常遇到的兩種分離形式。一種是將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如分離蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類分離。另一種是將分子量相差不大的物質(zhì)分離，如將血清白蛋白與球蛋白分離，這叫做分級分離。后者對實(shí)驗(yàn)條件和操作要求都比較高。選擇凝膠型號時必須使各種物質(zhì)的Kd值盡可能相差大一些。六、凝膠層析應(yīng)注意的事項

凝膠層析有稀釋作用，樣品濃度應(yīng)盡量大，但樣品濃度過大往往導(dǎo)致粘度增大，使分辨率下降。對蛋白質(zhì)樣品濃度以不大于4％為宜。分析層析加樣量為1～2mL/100mL柱床，制備層析加樣量為20～30mL/100mL柱床，這樣可使洗脫體積小于各組分樣品之間的分離體積，可獲得較滿意的分離效果。

選用細(xì)長的柱作凝膠過濾。用來脫鹽時，柱床高50cm較合適；分級分離時采用100cm柱床。柱床高與直徑比值在7～10之間。（三）加樣量（二）柱床高度

樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）濃度為5%，相對粘度11.8;（2）濃度為2.5%，相對粘度4.2;（3）濃度為1%.

洗脫的流速對分離效果有很大影響，下圖顯示了同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線。較快的流速冼脫峰較平寬。流速低洗脫峰窄而高。也就是說，流速低，分辨率高，樣品稀釋度小。

流速對洗脫曲線的影響

（四）洗脫的流速

洗脫的流速與洗脫的壓力有關(guān)，與凝膠顆粒的粗細(xì)（型號）也有關(guān)。在同樣的壓力下，凝膠顆粒粗（型號?。┑牧魉倏欤活w粒細(xì)（型號大）的流速慢。對于同種凝膠來說，在一定范圍內(nèi)，洗脫的壓力加大，流速加快。

欲達(dá)到流速恒定的目的，可自制恒壓加液裝置（下圖），更可靠的是使用微量恒流泵。

凝膠層析恒壓加液裝置

層析系統(tǒng)連接示意圖1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動收集器；

7.檢測儀

葡萄糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被細(xì)菌和霉菌分解。聚丙烯酰胺凝膠本身不被微生物作用，但微生物能在凝膠床上生長，這樣會破壞凝膠的特性，影響分離效果。為防止細(xì)菌生長和發(fā)酵，可用0.02％疊氮化鈉、0.05%三氯叔丁醇（僅在弱酸有效，也適用于其他離子交換劑）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯汞（在弱堿中有效，也適用于其他陰離子交換劑）以及0.1mol／L氫氧化鈉溶液等作防腐劑。層析前再用水或平衡液將防腐劑洗去。

七、凝膠的再生和保養(yǎng)凝膠用過后，有幾種保存方法：

濕態(tài)保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；

半收縮保存：水洗后濾干，加70％乙醇使膠收縮，再浸泡于70％乙醇中保存；

干燥保存：水洗后濾干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結(jié)塊。第二節(jié)離子交換層析

ionexchangechromatography一、概念及原理：

利用離子交換劑對各種離子的親和力不同而進(jìn)行樣品分離的方法。

固定相：帶有大量電荷的離子交換劑。流動相：具有一定pH值和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液。洗脫方法：增加離子強(qiáng)度、改變pH值。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。

二、離子交換劑的種類

在惰性載體上引入帶有電荷的活性基團(tuán)即成離子交換劑。（一）按活性功能基團(tuán)帶電荷性質(zhì)不同陽離子交換劑：帶負(fù)電荷與陽離子交換陰離子交換劑：帶正電荷與陰離子交換（二）按載體種類不同1、離子交換樹脂：主要有聚苯乙烯樹脂苯乙烯+二乙烯苯

聚苯乙烯（單體）（交聯(lián)劑）交聯(lián)度=————————×100%二乙烯苯苯乙烯+二乙烯苯

交聯(lián)度大，網(wǎng)孔小，大分子量的離子不能進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)發(fā)生離子交換。在不影響分離的情況下，采用交聯(lián)度較高的樹脂為好，這樣可以提高樹脂對離子的選擇性。

陽離子交換樹脂：

1、強(qiáng)酸型含磺酸基團(tuán)(R-SO3H)2、中等酸型含磷酸基團(tuán)(-O-PO2H4)3、弱酸型含酚基、羧基陰離子交換樹脂：

1、強(qiáng)堿型含季胺基團(tuán)[-N+(CH3)3]2、弱堿型含叔胺、伯胺基團(tuán)[-N(CH3)2

陰離子交換樹脂對化學(xué)試劑及熱穩(wěn)定不如陽離子交換樹脂。

2、離子交換纖維素：陰離子交換纖維素:DEAE-纖維素pH8.6以下分離中性或酸性物質(zhì),具有二乙胺乙基。陽離子交換纖維素:CM-纖維素一般pH>4條件下使用,具有羧甲基。3、離子交換凝膠：分離大分子物質(zhì)

葡聚糖（Sephadex）聚丙烯酰胺（PAG）瓊脂糖（Sepharose）三、操作注意點(diǎn)

（一）離子交換劑的選擇原則：根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇對被分離物質(zhì)各組分之間結(jié)合力差異大的交換劑，以保證通過離子交換層析后能得到比較滿意的結(jié)果?？紤]因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷。2.被分離物質(zhì)分子的大小，大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素。3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境。4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)。5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量。根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件：強(qiáng)酸強(qiáng)堿：應(yīng)用廣泛弱酸型：只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型：只能在酸性pH范圍內(nèi)使用

(三)洗脫劑原則：所用洗脫液比樣品具有更活潑的離子或基團(tuán)。改變pH或離子強(qiáng)度：降低被分離物與離子交換劑的結(jié)合力。洗脫方式：梯度洗脫（二）緩沖液的選