基因克隆：第四章 重組體的篩選

1、第四章 重組體的篩選 （Recombinant Screening,第一節(jié) 重組 DNA導(dǎo)入受體細胞,一、外源DNA片段同載體分子的重組 二、受體細胞 三、重組 DNA導(dǎo)入受體細胞的方法 四、轉(zhuǎn)化(transformation,第二節(jié) 重組體的篩選,一、遺傳表型篩選法（Genetic phenotype selection ） 二、電泳篩選法（Electrophoresis selection） 三、分子雜交檢測法（Molecular hybridization selection） 四、免疫化學(xué)檢測法（Immunochemical selection） 五、亞克隆法 （Subcloning

2、selection,第一節(jié) 重組 DNA導(dǎo)入受體細胞,一、外源DNA片段同載體分子的重組 1、外源DNA片段同載體分子的連接方法 （1）平末端 （2）粘性末端 銜接體（linker) 結(jié)合體 （adaptor) 同聚體加尾 （homopolymer,二、受體細胞,1、受體細胞(receptor cell)的概念 2、受體細胞的選擇原則 1）便于重組DNA的導(dǎo)入 2）能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中 3）便于重組體的篩選 選擇與載體所含的選擇性標記相匹配的受體細 胞基因型 4）遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長,5）安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染 6）選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺

3、失或蛋白酶含量低的細胞，利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的積累。 7）受體細胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯的偏好性 編碼氨基酸的同義密碼子之間的選擇是有偏好的。植物的葉綠體和線粒體基因在同義密碼子第三位上偏好使用A、U 8)具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達 9)在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應(yīng)用價值,一）原核生物細胞,1、理想的受體細胞類型 1）沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入 2）沒有核膜，染色體 DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì) 3）基因組簡單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析 4）單細胞生物,缺欠,1、不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng) 2、

4、缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng) 3、內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源 蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定。 大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌,枯草桿菌,1) 枯草桿菌具有胞外酶分泌調(diào)節(jié)基因 2）不產(chǎn)生內(nèi)毒素 3）具有芽孢形成能力,二）真菌細胞,1）簡單的真核生物 2）蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工系統(tǒng) 3）不含特異的病毒，不產(chǎn)生毒素 4）培養(yǎng)簡單 5）外源基因表達產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中,三）植物細胞,全能性 （四）動物細胞 1）識別除去外源真核基因中的內(nèi)含子 2）翻譯后能能被正確的加工與修飾 3）易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 4）產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中,三、重組 DNA導(dǎo)入受體細胞的方法,1) 轉(zhuǎn)化（transformation

5、） 2) 轉(zhuǎn)染（transfection） 3) 顯微注射技術(shù)（microinjection） 4)電轉(zhuǎn)化法（electro-tranformation）,也稱為電穿孔（electroporation） 5）基因槍法（gene gun/particle gun），又稱微彈轟擊（micro-projectile bombardment） 6）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（liposome mediated gene transfer） 7）花粉管通道法,質(zhì)粒的不相容性(incompatibility) 每個細菌細胞只能導(dǎo)入一個質(zhì)粒DNA分子； 每個菌落（一個單克隆）都是由一個細菌細胞形成的； 每個克隆中所有的細

6、胞都只含有同一種質(zhì)粒,2、受體細胞的感受態(tài),1）感受態(tài)細胞（competent cell)的概念 （2）感受態(tài)的機制 局部原生質(zhì)體化假說 即局部失去了細胞壁結(jié)構(gòu)或局部溶解細胞壁，使外源DNA分子能通過質(zhì)膜進入細胞 。 酶受體假說 感受態(tài)細胞表面形成一種能接受DNA的酶切位點，使DNA分子能進入細胞,3）轉(zhuǎn)化的過程 冰冷的50m mol/lCacl2溶液 DNA分子在轉(zhuǎn)化過程中將經(jīng)歷四個階段 第一個是吸附階段，完整的雙鏈DNA分子將吸附于感受態(tài)細胞的表面 第二個為轉(zhuǎn)入階段，雙鏈的DNA分子解鏈，以單鏈的形式進入細胞，而另一鏈則被降解； 第三階段是自身穩(wěn)定階段，外源質(zhì)粒在細胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DN

7、A； 第四階段是表達階段，即目的基因隨同質(zhì)粒的復(fù)制子一起復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯,4）轉(zhuǎn)化反應(yīng),轉(zhuǎn)化反應(yīng)是使重組體DNA分子在熱休克（heat shock）的短暫時間之內(nèi)被導(dǎo)入受體細胞 1）取制備好的感受態(tài)細胞100l，置冰上5min融化。 2）加入重組10l，冰上放置30分鐘。 3）將管置42恒溫水浴中熱休克90秒鐘，再置冰上10分鐘。 4）向管中加入LB液體培養(yǎng)基1ml，混勻后置37恒溫臬中保溫1小時,宿主細胞少數(shù)能發(fā)展感受態(tài)細胞 萬分之一的質(zhì)粒分子能夠進入感受態(tài)細胞 極少數(shù)能夠良好的增殖,5）轉(zhuǎn)化率(transformation efficiency,5）轉(zhuǎn)化率(transformation

8、efficiency,轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率 以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示， 以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細胞數(shù)的比率表示,練習(xí),1 ng l kb DNA的分子數(shù)約為 1 109個 如果用1 ng l kb DNA進行轉(zhuǎn)化處理，得到1000個轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率是? 答案：轉(zhuǎn)化率是103109=10-6 含義是106個DNA分子才能獲得1個轉(zhuǎn)化子,第二節(jié) 重組體的篩選（Recombinant Screening/Selection,篩 選,選 擇,1,2,選擇（selection）與篩選（screening,選擇壓力 （抗藥性的選擇,細胞群中進行

9、鑒定 （藍白篩選,為什么要進行重組體的篩選,需要的重組DNA分子,連接體系,未連接上的載體分子,未連接上的DNA片段,連接污染DNA片段 的重組DNA分子,宿主細胞108（轉(zhuǎn)化率10-6,100個轉(zhuǎn)化子 9 999 900個未轉(zhuǎn)化的細胞,目的重組DNA分子連接污染DNA片段的重組DNA分子 插入失活法自身環(huán)化的載體分子,目的重組DNA分子 連接污染DNA片段的重組DNA分子,目的重組DNA分子連接污染DNA片段的重組DNA分子 自身環(huán)化的載體分子,插入失活法,凝膠電泳篩選方法 分子雜交,Genetic phenotype selection,Sub-cloning selection,Immu

10、nochemical selection,Electrophoresis selection,遺傳表型 篩選法,Molecular hybridization selection,重組體的篩選方法The methods of recombinant selection,一、遺傳表型篩選法（Genetic phenotype selection,1、抗藥性篩選/抗生素抗性篩選 （Antibiotic resistance selection） 2、插入失活法（Insertional inactivation,一、遺傳表型篩選法,1、抗藥性篩選/抗生素抗性篩選 （Antibiotic resist

11、ance selection） 利用載體 DNA分子上的抗藥性選擇標記進行篩選 Apr (Ampr) ：抗氨芐青霉素 （ampicillin）基因 Cmr (Cmpr) ：抗氯霉素（chloramphenicol）基因 Kn r (Kanr) ：抗卡那霉素（ kanamycin ） 基因 Tcr (Tetr) ：抗四環(huán)素（tetracymic）基因 Sm r (Strr) ：抗鏈霉素（strentomycin）基因 Aps (Amps) ：氨芐青霉素 敏感（sensitive）基因,正向選擇方式,含質(zhì)粒（重組）的受體菌能在抗藥性培養(yǎng)基生長 不含質(zhì)粒的受體菌不能在抗藥性培養(yǎng)基生長 注意：Tc、C

12、m、Ap：觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間以1216小時為宜,pBR322質(zhì)粒載體的物理圖譜,如何區(qū)分轉(zhuǎn)化子中的重組子 和非重組子,2、插入失活法（Insertional inactivation,1）抗藥性基因插入失活法 質(zhì)粒的抗藥性基因(抗生素抗性基因)內(nèi)部插入外源DNA片段，造成重組質(zhì)粒的抗藥性失活,問題,具有Ampr Tets 表型的細胞所攜帶的pBR322，在其 基因內(nèi)帶有插入的外源基因,具有Amps Tetr 表型的細胞所攜帶的pBR322，在其 基因內(nèi)帶有插入的外源基因,2）藍白篩選法（Blue-white screening ） -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)/乳糖篩選（Lac scree

13、ning） -互補（-complementation）篩選法,-互補（-complementation,大腸桿菌株系 質(zhì) 粒 修飾的Lacz基因（少Lacz 基因） pUC8（Lacz 基因） -半乳糖苷酶的 -半乳糖苷酶的 C末端 N末端-肽鏈 -半乳糖苷酶 X-gal （顯色劑） IPTG （誘導(dǎo)物） 深藍色菌落,-互補（-complementation,大腸桿菌株系 質(zhì) 粒 修飾的Lacz基因（少Lacz 基因） pUC8(Lacz) 插入外源基因 -半乳糖苷酶的 C末端 pUC8重組質(zhì)粒 不能編碼N末端-肽鏈 不能合成-半乳糖苷酶 X-gal （顯色劑） IPTG （誘導(dǎo)物） 白色菌落

14、,藍白篩選,X-gal （顯色劑）： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷 （5- bromo 4 chloro 3 indolyl - D galacto - pyranoside） IPTG（誘導(dǎo)物）： 異丙基-D-硫代半乳糖苷,半乳糖苷酶可以將X-gal分解成一種深藍色的產(chǎn)物，這個反應(yīng)很靈敏。當(dāng)帶有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中加有 X-gal及IPTG時，那些能合成完整-半乳糖苷酶的未重組子就會因它能酶解X-gal而變成深藍色，而重組子因lacz基因被破壞不能合成完整的-半乳糖苷酶而呈白色，此謂藍白篩選,Blue-white screening,A more sophisticated p

15、rocedure for screening the presence of recombinant plasmids, which can be carried out on a single transformation plate, is called blue-white screening. This method also involves the insertional inactivation of a gene , as the name implies, uses the production of a blue compound as an indicator,The g

16、ene in this case is Lacz, which encodes the enzyme -galactosidase, then expression of a Lacz gene may be induced using IPTG ,and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate X-gal to yield a blue product,Insertional inactivation of Lacz in the production of a recombinant plasmid would yi

17、eld a white product,二、電泳法篩選,凝膠電泳分離DNA分子的基本原理Separation of DNA molecules by gel electrophoresis,凝膠電泳分離DNA分子的基本原理Separation of DNA molecules by gel electrophoresis,1,2,3,質(zhì)粒抽提篩選法,二、電泳法篩選,1、質(zhì)粒抽提篩選法,堿裂解法主要是基于染色體DNA 與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異，當(dāng)細胞在NaOH和SDS（十六烷基磺酸鈉）溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，加入中和液醋酸鉀后，進行離心，蛋白質(zhì)與染色體DNA隨細胞碎片沉

18、淀下來，使質(zhì)粒DNA留在上清液中,2、限制性酶解法,電泳,質(zhì)粒抽提,酶切,電泳或測序,質(zhì)粒抽提,PCR,3、PCR的方法,三、分子雜交篩選法,原理 1968年Cavnegie Institute of Washington 的Roy Britten發(fā)明的。 具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強度等條件下，可按堿基互補配對原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈,三、分子雜交篩選法,原理 雜種核酸分子 當(dāng)帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起時，其相應(yīng)的同源區(qū)段發(fā)生退火所形成的雙鏈結(jié)構(gòu)。 探針 雜交的雙方是待測的核酸序列和用于檢測的已知核酸片段,2、雜交步驟,轉(zhuǎn)移

19、 雜交,經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，通過 毛細管作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上,將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記 或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交,尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜、疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM)、二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE,3、核酸分子雜交檢測法的分類,Southern印跡雜交 （ Southern blot ） Northern印跡雜交 （ Northern blot ） 斑點和狹線印跡雜交 （dot and slot blotting） 菌落和噬菌斑雜交 （colony and plaque blotting,1）Southern印跡雜交（ Southe

20、rn blot,鑒別DNA的雜交 1975年英國科學(xué)家E.M.Southern發(fā)明的，雜交受體是DNA片段，受體從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜（或尼龍膜）上，與探針進行雜交,2） Northern印跡雜交 （ Northern blot,鑒別RNA的雜交 雜交的受體是RNA片段，探針可用RNA也可用DNA，也需將受體從凝膠轉(zhuǎn)移到氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM)上，與探針片段進行雜交,3）斑點印跡雜交和狹線印跡雜交（dot and slot blotting hybridization,在Southern blot雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的類似的快速檢測核酸分子的方法。其主要步驟 為：采用抽真空或多孔過濾進樣器將核酸轉(zhuǎn)移到雜交膜上，進