臨床微生物學(xué)檢驗：細(xì)菌的生物化學(xué)鑒定技術(shù)

1、概念：不同細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)各不相同，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用能力各異，它們在代謝過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，利用生物化學(xué)方法直接或間接檢測細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的反應(yīng)稱之為細(xì)菌生化反應(yīng)。 學(xué)習(xí)目標(biāo)： 掌握每個生化試驗原理及結(jié)果觀察！,2020/12/17,1,細(xì)菌的生物化學(xué)鑒定技術(shù),生化反應(yīng)分類,碳水化合物的代謝試驗 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗 碳源和氮源利用試驗 呼吸酶類試驗 其他生化試驗,2020/12/17,3,細(xì)菌的生物化學(xué)鑒定技術(shù),（一）碳水化合物的代謝試驗 1. 糖（苷、醇）類發(fā)酵試驗 作用：是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要,2020/12/17,4

2、,原理： 酶 不分解（） 糖（苷、醇） 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（） 產(chǎn)酸產(chǎn)氣 常用糖（苷、醇）類底物： 單糖： 葡萄糖、果糖、半乳糖等 雙糖： 乳糖、蔗糖、麥芽糖等 多糖： 淀粉、糊精、肝糖等 醇類： 甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇等 苷類：七葉苷、水楊素等,常用指示劑及顏色變化,pH域 酸色 堿色 酚紅 6.8-8.4 黃 紅 溴麝香草酚藍 6.0-7.6 黃 藍 溴甲酚紫 5.2-6.8 黃 紫 甲基紅 4.2-6.2 紅 黃 中性紅 6.8-8.0 紅 黃,2020/12/17,6,指示劑：溴甲酚紫 酸性：黃色 堿性：紫色,指示劑：酚紅 酸性：黃色 堿性：紅色,結(jié)果：,2020/12/17,7,2氧化發(fā)酵試

3、驗（O/F試驗） 作用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒 別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型 或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的 鑒別。,2020/12/17,8,原理：有些細(xì)菌僅能在有氧的情況下分解 葡萄糖（氧化型） 有些細(xì)菌在有氧無氧的情況下都可 以分解葡萄糖（發(fā)酵型） 有些細(xì)菌在有氧無氧的情況下都不 分解葡萄糖（產(chǎn)堿型） 結(jié)果：氧化 發(fā)酵 產(chǎn)堿 注意：需加無菌石蠟油隔絕空氣！,2020/12/17,9,指示劑為溴甲酚紫或溴麝香草酚蘭,2020/12/17,10,3半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗） 迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗均為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗主要用

4、于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。,2020/12/17,11,細(xì)菌正常分解乳糖必需具備半乳糖苷滲透酶 (主動運輸乳糖，乳糖進入細(xì)胞速度快）和-半乳糖苷酶（分解乳糖）。 遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌因為僅有-半乳糖苷酶，沒有半乳糖苷滲透酶，所以乳糖進入細(xì)胞只能依靠被動滲入，速度慢，表現(xiàn)為發(fā)酵乳糖的速度也很慢。 原理：-半乳糖苷酶試驗是用鄰硝基酚半乳糖苷（ONPG，本身無色）代替乳糖，由于其分子量小，不需要半乳糖滲透酶就可直接快速進入菌細(xì)胞，被-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰硝基酚，可快速檢測細(xì)菌是否具有-半乳糖苷酶（即細(xì)菌能否發(fā)酵乳糖）。 結(jié)果：黃色（+）,2020/12/17,12,細(xì)菌正常利用乳糖一般需要

5、兩個酶：促使乳糖進入細(xì)菌的半乳糖苷透過酶(galactoside permease)和催化乳糖分解第一步的-半乳糖苷酶(-galactosidase) 。,2020/12/17,ONPG(+) (-),-,-,+,4.七葉苷水解試驗(esculin test), ,七葉苷,pH7,(檸檬酸鐵),應(yīng)用：D群鏈球菌和腸球菌的鑒定。,2020/12/17,15,5、甲基紅試驗（MR試驗）、VP試驗 原理： 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 混合酸 KOH+空氣氧化 二乙酰 pH4.5 -奈酚（+胍基） 甲基紅指示劑 紅色化合物 紅色（VP試驗陽性） (甲基紅試驗陽性)結(jié)果：紅色為陽性培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨

6、水注意：兩種試驗看結(jié)果前均需加試劑！,MR試驗 （） （）,葡萄糖,甲基紅試劑,甲基紅試驗 Methyl Red,VP試驗（） （）,葡萄糖,V-P試劑 (KOH+-萘酚),脫羧,V P試驗 Voges-Proskauer Test,2020/12/17,18,（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗,1吲哚(靛基質(zhì))試驗 注意：觀察結(jié)果前需加吲哚試劑！,色氨酸酶,色氨酸,對二甲基氨基苯甲醛,吲哚 (-) (+),吲哚(靛基質(zhì))試驗(Indole test)原理,主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。,培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別,2. 硫化氫試驗原理,- +,含硫氨基酸(胱氨酸等),

7、分解,Fe2+/Pb2+,2020/12/17,21,3.尿素分解試驗(Urease test) 主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬 細(xì)菌的鑒定。,- +,尿素,尿素酶,酚紅,2020/12/17,23,尿素分解試驗（指示劑為酚紅）,（）,（）,4.苯丙氨酸脫氨酶試驗（phenylalanine deaminase test） 主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、 普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性， 腸桿菌科中其他細(xì)菌均為陰性。,苯丙氨酸,苯丙氨酸脫氨酶,10三氯化鐵, ,5.氨基酸脫羧酶試驗(amino acid decarboxylation test) 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定

8、。, ,氨基酸(鳥氨酸，賴氨酸，精氨酸）,（ ）脫羧酶,溴甲酚紫或酚紅, ,2020/12/17,26,2020/12/17,27,（三）碳源和氮源利用試驗 枸櫞酸鹽利用試驗 應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。 原理：有些細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一的碳源獲得能量也能利用銨鹽作為唯一的氮源，同時生成氨，使培養(yǎng)基堿化。 結(jié)果：指示劑為溴麝香草酚蘭,2020/12/17,28,（） （）,枸櫞酸鹽利用試驗,（） （）,細(xì)胞色素氧化酶參與的細(xì)菌呼吸途徑中電子傳遞,1.氧化酶試驗（Cytochrome oxidase test）,（四）呼吸酶類試驗,細(xì)胞色素C,細(xì)胞色素氧化酶,應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌

9、與假單胞菌的鑒別。,間接法 直接法,氧化酶試驗（Cytochrome oxidase test）結(jié)果,2.過氧化氫酶（觸酶）試驗( Catalase test),應(yīng)用：用于革蘭陽性球菌的初步分群。,觸酶,H2O2,3.硝酸鹽還原試驗(Nitrate reduction test)原理,對氨基苯磺酸,-萘胺,-萘胺偶氮苯磺酸,亞硝酸鹽,2020/12/17,33,原理：有些菌可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽或氨和氮等，前者可與-萘胺和對氨基苯磺酸反應(yīng)，生成紅色偶氮化合物。硝酸鹽還原試驗就是測定還原過程中所產(chǎn)生的亞硝酸鹽。 結(jié)果：立即出現(xiàn)紅色為陽性；若沒有紅色出現(xiàn)，原因可能為：真正陰性，可加鋅粉于陰性反應(yīng)物

10、中，變成紅色，為真正陰性；或假陰性（真陽性），加鋅粉不變色，因生成的亞硝酸鹽被進一步還原成NH3、N2 等。,鋅 硝酸鹽 亞硝酸鹽,硝酸鹽沒有被還原,硝酸鹽還原試驗(幾種結(jié)果演示),硝酸鹽培養(yǎng)基,+試劑（對氨基苯磺酸、 -萘胺）,本試驗在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等非發(fā)酵菌可還原硝酸鹽產(chǎn)生氮氣。,+,+,-,2020/12/17,35,1 DNA酶試驗 在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌產(chǎn)生此酶。,（五）其他生化試驗,2020/12/17,36,DNA酶試驗原理： DNA酶 長鏈DNA 寡核苷酸鏈（可

11、被酸沉淀：白色） （可溶于酸：透明）,2.血漿凝固酶試驗,作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。,致病性葡萄球菌具有兩種凝固酶: 結(jié)合凝固酶（結(jié)合在菌細(xì)胞壁上，相當(dāng)于纖維蛋白原的受體） 游離凝固酶（作用類似凝血酶原，激活后可使血漿凝固）,纖維蛋白原,纖維蛋白,（） （）,（Coagulase test）,玻片法,試管法,2020/12/17,38,3 CAMP試驗 在鏈球菌中，只有B群 鏈球菌產(chǎn)生CAMP因子，可促進葡萄球菌產(chǎn)生的beta-溶血素溶解紅細(xì)胞的能力。,金黃色葡萄球菌,4.膽汁溶菌試驗,原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生自溶酶使細(xì)菌溶解，而膽汁能激活自溶酶加快細(xì)菌溶

12、解。,應(yīng)用：肺炎鏈球菌的鑒定,5.卵磷脂酶試驗,原理：有的細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶 (-毒素)，在鈣離子存在時， 此酶可迅速分解卵磷脂，生成 渾濁沉淀狀的甘油酯和水溶性 磷酸膽堿,應(yīng)用：主要用于厭氧菌鑒定。,被檢菌劃線接種或點種于卵黃瓊脂平板上，于35培養(yǎng)3-6h,2020/12/17,41,（1）O/129抑菌試驗 用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬 對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。 （2）桿菌肽試驗 用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別（抑菌圈直徑10mm敏感） （3）奧普托欣（Optochin）試驗 主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別（抑菌圈14mm為敏感）。,6.常見抑菌試驗,肺炎鏈

13、球菌對optochin敏感 （抑菌圈14mm),A群鏈球菌對桿菌肽敏感 （抑菌圈10mm),2020/12/17,43,7. 復(fù) 合 生 化 試 驗,44,克氏雙糖鐵培養(yǎng)基,分解葡萄糖+乳糖 產(chǎn)酸(乳糖多，產(chǎn)酸多） 斜面和底層均變黃,(Kligler Iron Agar,KIA),組成：無糖培養(yǎng)基+1份葡萄糖+10份乳糖 + 鐵鹽 + 酚紅 營養(yǎng) 底物 底物 底物 指示劑,原理： 只分解葡萄糖 產(chǎn)酸（葡萄糖少，產(chǎn)酸量少）,斜面產(chǎn)生的酸被氧化、揮發(fā)、中和，呈紅色 底層缺氧，不氧化，黃色,產(chǎn)生硫化氫 + 鐵鹽 FeS 黑色沉淀,應(yīng)用：檢測腸桿菌科細(xì)菌對乳糖、葡萄糖的分解和產(chǎn)H2S能力。,2020/12/17,45,