人工合成細胞Science .doc

1、 創(chuàng)建由化學合成的基因組控制的細菌細胞 摘要： 我們報道了根據(jù)基因組測序結(jié)果來設計、合成并裝配一個1.08mmb的支原體mycoplasma mycoides jcv1syn1.0 的基因組，然后把這個基因組移植進入一個支原體m. capricolum受體細胞中，產(chǎn)生了一個僅由合成的基因組控制的新的mycoplasma mycoides細胞。在這個細胞中唯一的dna就是我們設計合成的dna序列，上面包括“水印序列”（watermark）和其他一些設計進去的基因缺失和多態(tài)性以及在基因組構建過程中帶進去的突變。這個新的細胞已經(jīng)呈現(xiàn)出我們預期的表型，而且能夠進行連續(xù)的復制（增殖）。1977年，san

2、ger和同事測定了噬菌體x174的完整的遺傳序列【1】，這是第一個被完全測序的dna基因組。18年后，也就是在1995年，我們團隊解讀了第一個完整的自我復制的細菌流感嗜血桿菌（haemophilus influenzae）的遺傳序列【2】。在這些最初的研究的基礎上，對多物種的基因組序列進行解讀已經(jīng)成指數(shù)般快速發(fā)展起來。在過去的25年中，快速對基因組測序的能力已經(jīng)增長了逾8個數(shù)量級【3】。隨著對所有這些新的基因組信息的理解和探究，催生了大量新的計算機模擬以及實驗研究方面的范例（指著名的研究成果），但是我們對基因組的了解仍然是十分有限。就生物學功能而言，還沒有任何一個細胞系統(tǒng)中的基因能夠被我們?nèi)?/p>

3、理解。即便是在一個單細胞細菌中，它的染色體就包含了遺傳需要的所有信息嗎？如果這樣，一個完整的遺傳系統(tǒng)能夠通過化學合成的方法根據(jù)計算機中測定好的dna序列信息來起始合成嗎？我們對大dna分子和染色體的合成的興趣萌生于我們在過去的15年中努力去構建一個僅含有必須基因的最小細胞。這項工作在1995年就已經(jīng)開展，當時我們測序了生殖支原體mycoplasm genitalium的基因組。 m. genitalium是一種目前已知的能夠在實驗室獨立生長的擁有最小基因組的細菌。當我們一次失活一個基因進行研究，發(fā)現(xiàn)在該m. genitalium的485個編碼蛋白質(zhì)的基因中有超過100個基因都是非必須的【4-6

4、】。我們發(fā)展了一種通過把病毒粒子大小的片段組裝成大分子dna的策略，這樣使我們能夠在4個階段把化學合成的平均6kb大小的一些dna區(qū)段（cassette)組裝成人工合成的m. genitalium基因組。這是通過體外酶學以及酵母菌體內(nèi)重組相結(jié)合的方法來完成的。這個完全人工合成的基因組（含582970堿基對）作為一個酵母著絲粒質(zhì)粒（ycp）可以穩(wěn)定地在酵母細胞中生長【7】。在移植一個化學合成基因組進入受體細胞并進行表達的過程中遇到的一些難題已經(jīng)被我們克服了。我們現(xiàn)在需要改進從酵母體內(nèi)提取完整的基因組的方法，同時需要掌握如何把這些基因組轉(zhuǎn)入受體菌細胞來構建一個完全由合成基因組控制的細胞。基于m.

5、genitalium生長速率過慢，我們想到了兩種快速生長的支原體，即m. mycoides的亞種capri (gm12)作為供體（提供基因組信息），而m.capricolum的亞種capricolum (ck)作為受體（去除自身基因組后，接收合成的基因組）。為從酵母體內(nèi)移植出合成基因組創(chuàng)造條件和流程，我們發(fā)展出把作為酵母菌著絲粒質(zhì)粒的整個細菌染色體進行克隆的方法，包括克隆了m.mycoides天然的基因組【8，9】。然而，起先將m. mycoides的基因組從酵母中提取出來進而移植入m. capricolum的嘗試失敗了。我們發(fā)現(xiàn)供體和受體支原體利用相同一套限制系統(tǒng)。供體細胞基因組在天然的m.

6、 mycoides細胞中被甲基化，所以在從這個供體細胞中提取基因組并進行移植入受體的過程中，移植的基因組因甲基化保護免遭受體細胞限制性酶系的破環(huán)【10】。但是，生長于酵母中的細菌基因組沒有被甲基化，因此在遭遇受體細胞中的限制系統(tǒng)的限制時不會受到保護。我們就用純化的甲基化酶或m. mycoides提取物亦或m. capricolum提取物使供體dna基因組先甲基化，或者干脆破壞掉受體細胞的限制系統(tǒng)以克服這一限制系障【8】。我們現(xiàn)在已經(jīng)把原先建立起來的程序進行了組合，在這里報道我們通過合成、組裝、克隆一個1.08-mb的基因組（命名為m.mycoidesjcvi-syn1.0基因組）并進行成功移植

7、，從而創(chuàng)造了一個由合成基因組所控制的新細胞。 1合成基因組的設計 m. mycoides jcvi-syn1.0基因組的設計是在m. mycoides亞種capri gm12【8，9，11】的兩種試驗用菌株基因組序列被高度精確測定的基礎上進行的：一個是被lartigue et al.運用的供體基因組（genbank序列號：cp001621）【10】；另一個是在酵母中克隆和經(jīng)遺傳改造過的基因組ycpmmyc1.1-dtypeiiires(genbank序列號：cp001668)【8】通過移植后創(chuàng)造的菌株【8】。我們這項工程的關鍵依賴于這些序列的精確程度。盡管我們相信這兩套已經(jīng)測序完成的m. my

8、coides基因組序列都很可靠，但它們之間在95個位點仍存在差別。在兩套基因組序列測序完成之前，我們就開始了設計合成基因組的工程。所以，設計合成的大部分dna區(qū)段（cassette)的序列是來自于cp001621的序列【11】。當這兩套基因組序列的測序工作完成后，我們就選擇了從酵母中成功移植出的基因組序列（序列號cp001668）作為我們的設計參考（我們保留的typeiiires完整基因是例外）。所有存在于cp001668序列和之前我們合成的dna區(qū)段之間的顯著生物學差異被一一修正，使兩者精確地匹配【11】。在我們合成的dna區(qū)段序列和cp001668序列之間仍有19處位點序列差異，但因?qū)ι?/p>

9、是無害的，所以沒有被修正。因而這樣在我們合成的基因組（jcvi-syn1.0）和克隆自酵母的天然基因組（ycpmmyc1.1，作為基因組移植標準或?qū)φ眨┬蛄兄g就存在19個序列多態(tài)性差異【8】。為了進一步區(qū)別合成基因組和天然基因組，我們設計了4種水印序列，用它們?nèi)ヌ鎿Q一個或多個dna區(qū)段中被預測的（水印序列3和水印序列4）或已經(jīng)試驗證明的（水印序列1 和水印序列2）位置，但這些位置不會影響到細胞的生存。這些水印序列可編碼成特定的識別標簽，而不會被翻譯成多肽。表格s1列出了合成基因組和天然基因組之間的區(qū)別。圖s2展示了一張m. mycoides的jcvi-syn1.0基因組圖。dna區(qū)段和組裝片

10、段中間體的邊界、水印序列、缺失、插入，以及m. mycoides中jcvi-syn1.0基因組的基因在圖s2中都標示出來，而移植得到的支原體克隆smmycp235-1的序列已經(jīng)被提交至genbank（序列號cp002027）。2合成基因組的組裝策略 我們設計的起始的dna片段一般大小為1080bp，與相鄰的dna片段有80bp的重疊序列【11】。這些dna片段是由blue heron公司（bothell， washington）通過把化學合成的寡核苷酸進行組裝形成的，每個dna片段是單獨合成并由廠商經(jīng)過測序校對過的。為了有助于后面的構建過程，這些dna片段和裝配中間體的末端被設計成含有not

11、i 限制性酶切位點，在載體存在情況下，在酵母中可以發(fā)生重組，并進行生長和篩選【7，11】。我們設計了一個分級策略，來分三步，從1.07kbdna片段開始，通過轉(zhuǎn)化及在酵母中同源重組，把整個基因組組裝起來【12，13】。 圖1 在酵母菌中進行m. mycoides化學合成合成基因組的組裝。m. mycoides合成基因組是由1078個重疊dna區(qū)段（cassette)經(jīng)過3步組裝而成。第一步，每10個由重疊的合成的寡核苷酸生成的1080-bp區(qū)段（橘黃色箭頭）重組在一起，共生成109個約10-kb的組裝序列（assemble藍色箭頭）；每10個這樣10-kb的組裝序列重組在一起，共生產(chǎn)11個10

12、0-kb的組裝序列（綠色箭頭）；在組裝的最后階段，這11個組裝序列進一步重組生成完整的基因組（紅色環(huán)）。除了兩個片段結(jié)構（27）（白色箭頭）是在體外通過酶促反應重組外，其他的組裝序列都是通過體內(nèi)同源重組在酵母中完成。在這個合成基因組中區(qū)別于天然基因組的絕大多數(shù)突變區(qū)域用黃色圈表示。這些突變區(qū)域包括4個水印區(qū)域（wm1wm4），一個被有意切除的4-kb區(qū)域（94d），以及促進酵母生長及基因組移植的有關因子的區(qū)域。另外，在20個位點上存在核苷酸多態(tài)性（如星形所示）?；蚪M上的坐標是相對于天然m. mycoides基因組中序列上第一個核苷酸，設計的序列共是1，077，947bp。asc i和bssh

13、 ii的限制酶切位點如圖所示。dna片段1號和800-810號都不重要,所以從組裝策略中去掉【11】。dna片段2號和區(qū)段1104號重疊，dna片段799號和區(qū)段811號存在重疊。2.1 10 kb人工合成中間序列的組裝 第一階段，dna區(qū)段cassette和載體在酵母菌中重組，然后被轉(zhuǎn)移到大腸桿菌。質(zhì)粒dna隨后從大腸桿菌單個克隆中分離出，這些質(zhì)粒dna被酶切來檢測含有載體上攜帶有10-kb長的組裝片段assemble的細胞。成功重組的10-kb組裝片段如圖2a所示?？傮w上，每檢測10個酵母菌細胞后至少有一個細胞含有10-kb組裝片段，然而成功率在10%-100%間變化。所有的第一階段中間組

14、裝片段都被測序，111個組裝片段有19個含有錯誤。又篩選了一些克隆，經(jīng)測序驗證無誤后，進入下一個組裝階段【11】。2.2 人工合成的100kb中間組裝片段的組裝 以上這些制備好的10-kb組裝片段和它們各自的載體按照上面的方法轉(zhuǎn)化入酵母中以生產(chǎn)100-kb人工合成中間組裝片段。我們的試驗結(jié)果表明這些產(chǎn)物在大腸桿菌體內(nèi)不能夠穩(wěn)定的存在，因此重組的dna不得不從酵母中提取。我們用復式pcr來對選擇的酵母菌克隆進行篩選（圖s3和表格s2）。因為在這個pcr分析中，每個10-kb中間組裝片段都對應一對引物，那么如果所有擴增子（用每對引物進行pcr得到的擴增產(chǎn)物）都存在就可以代表一個100-kb中間組裝

15、片段已經(jīng)產(chǎn)生?？傮w上，25%甚至更多的被檢測的酵母菌克隆都能擴增出所有的擴增子（預期是一個完整裝配片段擴增所需要的擴增子）。這些克隆中有一個被選出進行進一步篩選。環(huán)狀的質(zhì)粒dna被提取后和超螺旋標記物一起進行瓊脂糖凝膠電泳檢測大小。第二階段中，一個成功的裝配片段加上載體長度在105kb（如圖2b）左右。當所有的擴增子經(jīng)過復式pcr生成后，而大小也合適的第二階段裝配片段中間體（中間組裝片段）也就得到了。但在一些情況下，會發(fā)生小的序列缺失；在另一些情況下，多個10-kb片段會被組裝起來會生成一個比預期更大的第二階段中間組裝片段。有幸的是，這些差別在完整的基因組組裝之前可以在瓊脂凝膠電泳時被輕易的檢

16、測出來。2.3完整基因組的組裝 在準備組裝的最后階段時，必須分離到微克量的11個第二階段組裝片段（中間組裝片段）【11】。據(jù)報道【14】，像我們試驗中得到的第二階段組裝片段大小的環(huán)狀質(zhì)?？梢酝ㄟ^堿裂解法將其從酵母原生質(zhì)體中分離。為了進一步純化這11個中間組裝片段，我們將其用外切酶處理（去除線性酵母染色體），并通過陰離子交換柱。在全部質(zhì)粒dna中取一小部分被not i消化，并經(jīng)過倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳(fige)分析（圖2c）。以上方法可以在400 ml的酵母培養(yǎng)基中（約10的11次方個細胞）生產(chǎn)出含有1微克dna的單個第二階段組裝片段（環(huán)形形式，在載體上）。而以上方法并不能完全的去除酵母線性染色體d

17、na，而酵母的線性染色體dna的存在在很大程度上會降低下一步酵母轉(zhuǎn)化和dna組裝的效率。為了進一步富集這11個環(huán)形中間組裝片段，我們把含有200ng樣品的單個組裝片段富集并且和熔融的瓊脂混合。當瓊脂凝固的時候，纖維穿過瓊脂并“困住”環(huán)狀dna【15】，沒有被“困住”的線性dna便可以通過電泳從瓊脂塊中分離出來，這樣達到富集環(huán)形dna分子的目的。這11個環(huán)狀中間組裝序列用not i消化使得其中的插入片段可以釋放出來；隨后，將插入片段從瓊脂塊中提取出來，通過倒轉(zhuǎn)電場凝膠電泳（fige）分析（圖2d），并轉(zhuǎn)入酵母的原生質(zhì)體中。在組裝的第三和最后階段，不需要附加載體序列，因為酵母克隆因子已經(jīng)存在于81

18、1-900號組裝片段中（可以讓重組后的合成基因組穩(wěn)定在酵母中復制）。為了篩選一個完整的基因組，我們用11對引物進行了復合pcr反應，每對引物擴增的是相鄰兩個中間裝配片段的連接位置（表格s3）。在篩選過的48個菌落中，來自一個克隆（smmycp235）中提取的dna可以擴增生成所有的11個擴增子；在野生型（ycpmmyc1.1）陽性對照組的pcr中，也產(chǎn)生了一套與之難以區(qū)分的11個擴增子（圖3a）。為了深入證實我們已經(jīng)完整地組裝一個m. mycoides合成基因組，完整的dna用瓊脂塊法從酵母分離出來，用兩個限制性內(nèi)切酶進行酶切分析：asc i和bssh ii【11】。因為這些限制性內(nèi)切酶的切割

19、位點存在于4個水印序列中的3個序列中，所以選擇這樣的酶分別去切合成基因組和天然基因組，產(chǎn)生的酶切片段是不同的（圖1和3b）。smmycp235克隆產(chǎn)生的限制性酶切片段模式符合我們預期的一個完全組裝合成基因組的酶切結(jié)果（圖3c）。2.4 合成基因組的移植 在以上電泳試驗中用到的瓊脂塊方法（圖3c）在基因組的移植試驗中也被用到【11】。來自smmycp235酵母克隆體中的完整的m. mycoides合成基因組，如所述【8】，被移植入無限制系統(tǒng)的m. capricolum受體細胞中，在含有四環(huán)素和x-gal的sp4培養(yǎng)基中在37攝氏度培養(yǎng)，選擇藍色菌落就可以得到結(jié)果。從該酵母smmycp235克隆中

20、分離的基因組進行移植，對應每個瓊脂塊可以產(chǎn)生了5-15個抗四環(huán)素的藍色菌落，這個數(shù)目和陽性對照ycpmmyc1.1產(chǎn)生的藍色抗性菌落數(shù)目差不多。在所有的移植試驗中，菌落的出現(xiàn)主要依賴于m. capricolum受體細胞和m. mycoides基因組這兩者要共同存在。圖2. 中間組裝片段的分析（a）not i和sbf i雙酶切分析從大腸桿菌（e. coli）中純化的組裝片段341-350號。這些限制性酶從10-kb插入片段中釋放出載體片段（5.5kb和3.4kb）。插入片段dna在0.8%的e-凝膠中（invitrogen公司）與載體dna分開。m是1-kb marker（neb公司)。（b）自

21、酵母菌純化的501-600號組裝片段的分析。 105-kb的環(huán)型dna（5-kb載體加上100-kb插入序列）在1%瓊脂凝膠和外加電壓4.5v/cm條件下電泳3小時將其與線性酵母染色體dna分開。s指示bac-tracker dna 超螺旋marker（epicentre公司）。（c）not i酶切分析純化自酵母菌的11個100kb組裝片段。這些dna片段在1%的瓊脂凝膠上經(jīng)反轉(zhuǎn)凝膠電泳分析。每個組裝序列的插入序列的大小如圖示。指示lambda分子量marker（neb）。（d）經(jīng)過如圖（c）中所示通過拓撲捕獲和not i酶切分析的11個組裝片段集中富集轉(zhuǎn)化酵母菌，c為用來轉(zhuǎn)化酵母菌的dna的

22、40分之一的用量。圖3. 從酵母中分離的合成基因組的分析。（a）含有完全組裝合成基因組的酵母克隆通過復合pcr（利用可生成11種擴增子的一套引物，其中每對引物擴增的是11個組裝片段彼此連接處的區(qū)域）來進行篩選。從酵母克隆smmycp235(235)提取的dna為模板擴增生成了用于完整基因組組裝的11個組裝片段對應的11個pcr產(chǎn)物。作為比較，從酵母（wt，野生型）中提取的天然基因組也被分析。pcr產(chǎn)物在2%的電泳膠（invitrgen公司）電泳分開。l指示100-bp 分子量marker（neb）。（b）預期的天然野生型m. mycoides基因組和合成基因組經(jīng)過asc i和bssh ii酶切

23、后的限制性片段的大小。（c）天然（野生型）和合成（235）m. mycoides基因組利用瓊脂塊法從酵母體內(nèi)分離。另外，dna從宿主株（h）中純化。含dna的瓊脂塊被asc i或者bssh ii消化后得到的dna片段則通過chee電泳得到分離。，所對應的正確尺寸大小的限制性片段由片段的編號（如圖b中）指示。3. 半合成基因組的組裝與移植 為了幫助測試每個100-kb合成的組裝片段的功能，我們構建半合成基因組并進行了移植，通過把天然片段和合成片段混合，每個成功構建的100-kb合成組裝片段不需要測序其中間片段就可以得到核實。按照之前所描述的方法，我們在酵母中克隆了100-kb的11個重疊天然組裝

24、序列【16】：在11個平行反應中，選擇平均長度100-kb的片段（將m. mycoides天然基因組dna（ycpmmyc1.1）片段化得到）和為其設計的與100-kb插入序列末端重疊的pcr擴增載體在酵母中進行共轉(zhuǎn)化。pcr擴增載體末端含有40-bp序列與100-kb合成組裝片段重疊，可用來克隆100-kb合成組裝片段，這樣在確保有適當?shù)闹丿B的條件下促進天然片段與合成片段的重組。構建的半合成基因組中含有2到10個中間組裝序列是屬于11個100-kb的人工合成的組裝序列（表格1）。移植之后產(chǎn)生的可繁殖菌落證明了在每個基因組中的部分合成序列沒有發(fā)生致死突變，在這些100-kb的中間組裝片段中只有

25、含811-900號片段的基因組不能進行繁殖。起初，包含有錯誤的組裝片段（811-820）號的酵母克隆用來生成一個合成基因組，發(fā)現(xiàn)不能進行移植，這結(jié)果是可以預期的，因為該錯誤是由于單個堿基缺失導致dnaa中發(fā)生移碼突變（dnaa是染色體復制中的關鍵基因）。在這之前我們并沒有意識到會存在這個突變。通過構建半合成基因組，我們明確的指出811-900號組裝片段才是導致合成移植試驗失敗的罪魁禍首。因此，我們開始重新組裝了一個無誤的（811-900）號組裝序列，并進一步生成smmycp235酵母菌株。在dnaa突變基因組中和smmycp235合成基因組中僅僅有一個核苷酸的差別，我們把突變基因組作為我們移植

26、實驗的陰性對照實驗組。 我們利用基因組工程在811-900號組裝片段上對dnaa突變進行了修復（17），這樣在組裝的最后階段一個修復的811-900號組裝片段被用來生成一個含有修復基因組的酵母克隆。這個酵母克隆被命名為smmycp142并且可以移植。由11片段組裝起來的并可以成功移植的所有基因組如表格1所示。table 1. 由這11個片段組裝成并成功移植的基因組。組裝片段2-100號，1；組裝片段101-200，2；組裝片段201-300，3；組裝片段301-400，4；組裝片段401-500，5；組裝片段501-600，6；組裝片段601-700，7；組裝片段701-799，8；組裝片段8

27、11-900，9；組裝片段901-1000，10；組裝片段1001-1104， 11。 wm，指水印序列（watermark）。4. 合成并移植的基因組的性狀研究 為了快速區(qū)分m.capricolum的合成移植細胞和m.mycoides的天然細胞，我們引入了兩步分析方法。第一步，設計4對引物，對應與4種水印序列中的每一個水印序列，在一次復合pcr能產(chǎn)生4種擴增子（如表格s4），所有的這4種擴增子由smmycp235的移植株產(chǎn)生，而不是ycpmmyc1.1（如圖4a）。第二步，如上所述（如圖3c）基因組用asci和bsshii酶切，進行電泳分析，得到的限制性酶切片度模式與由m.mycoides合

28、成基因組產(chǎn)生的移植細胞相一致。 fig.4. 移植細胞的分析 （a）含有合成基因組的移植細胞通過復合pcr篩選，利用該pcr所用引物對可以對應擴增生成4個擴增子，每個擴增子內(nèi)有一個水印標記。我們對源自酵母克隆體smmycp235的移植體（syn1.0）和酵母中的天然非合成基因組（wt即野生型）一同進行了分析。含有合成基因組的移植體生成了4種pcr產(chǎn)物，而wt（野生型）基因組沒有生成任何產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物在2%的凝膠（）中分離。 （b）天然的（wt）基因組和人工合成的m. mycoides基因組用瓊脂塊法從m. mycoides移植細胞中分離。瓊脂快被asc1或者bssh11消化，基因組片段則通過

29、chef電泳分離。如圖3b，所對應的正確尺寸大小的酶切限制性片段由片段的數(shù)字編號指示。來源于smmycp235合成基因組的單個移植細胞被測序，我們命名該移細胞為m.mycoides jcvi-syn1.0。測得的序列與我們預想的設計幾乎吻合，僅在已知的核苷酸多態(tài)性、8個新的單核苷酸的多態(tài)性、大腸桿菌轉(zhuǎn)座子插入序列以及85-bp重復區(qū)（二倍體化）上有差別（表格s1）。轉(zhuǎn)座子插入序列和is1（一種大腸桿菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)座子）在大小和序列上精確的吻合，似乎是合成基因組過程中在移入大腸桿菌階段時is 1進入10-kb組裝片段中。is 1的兩側(cè)是來自于m.mycoides的正向重復序列，這暗示is1是通過轉(zhuǎn)座

30、子機制插入的。85-kb重復區(qū)（二倍體化）是非同源性末端連接的結(jié)果，這是在我們之前的10-kb組裝階段的測序中沒有被檢測到的。這兩個插入序列所影響的是不重要的基因區(qū)域。目前我們沒有發(fā)現(xiàn)任何合成基因組的序列能被證明是屬于受體細胞m.capricolum，這暗示在移植過程中我們的合成基因組完全取代了m.capricolum的基因組。只含有合成基因組的細胞能進行自我復制且能夠呈對數(shù)擴增。掃描和透射電子顯微鏡（ems）下的m.mycoides jcvi-syn1.0細胞呈現(xiàn)為細小卵形，由細胞漿包裹的細胞（圖5，圖c,圖f）。蛋白質(zhì)組學分析：同時對m.mycoides jcvi-syn1.0基因組和野生

31、對照組進行雙向電泳分析，兩者都顯示相同的蛋白質(zhì)點分布模式，這與之前報告的關于受體m.capricolum【10】的蛋白質(zhì)點分布有所不同（圖s4）。m.mycoides jcvi-syn1.0基因組中的14個基因被切除或受影響，然而，在瓊脂糖平板上培養(yǎng)出現(xiàn)的菌落百分率和菌落形態(tài)與含天然基因組mmcyycp1.1ycp1.1的m.mycoides很相似（比較圖5，圖a，圖b）。在顏色變化單元分析中我們確實觀察到了二者生長率上的輕微差別，jcvi-syn1.0移植株細胞比m.capricolummmcyycp1.1對照株生長稍微快些（圖s6）。 fig.5 m.mycoides jcvi-syn1.

32、0和wt m.mycoides的圖片。 為了比較jcvi-syn1.0和non-ycpwt株的表型，我們通過將細胞涂布在含有x-gal的sp4瓊脂板上培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)。 在培養(yǎng)三天后，jcvi-syn1.0的菌落因為其細胞中含有l(wèi)acz基因可以合成 -galactosidase（-半乳糖苷酶）而表現(xiàn)藍色，這種酶可以將x-gal轉(zhuǎn)化為藍色化合物。 （a）野生型細胞不含有l(wèi)acz基因而保持白色。 （b）兩種細胞類型均有為大多數(shù)支原體所特有的煎雞蛋似的菌落形態(tài)。我們使用兩種方法對jcvi-syn1.0分離物進行了電子顯微觀察。 (c)為了電子顯微觀察，樣品被四氧化鋨預先固定，脫水并用二氧化碳臨界

33、點干燥，最后在2千電子伏的條件下用hitachisu6600 掃瞄式電子顯微鏡下觀察。 (d)用1%的醋酸鈾在純碳源培養(yǎng)基上對分裂細胞進行透射電子顯微鏡觀察前負染，在80千電子伏條件下用jeol 1200ex透射電子顯微鏡觀察。為了檢查細胞的形態(tài)，我們比較了用醋酸鈾染色后的m. mycoides jcvi-syn1.0細胞的電子顯微圖像（e）及用電子顯微鏡觀察在2006年培養(yǎng)的曾用鉬酸銨染色的野生型細胞（f）。兩種細胞都顯現(xiàn)同樣的卵形形態(tài)和一般外形。電子顯微鏡（em）是由圣地亞哥加里福利亞大學國家顯微成像研究中心的t.deerinck和m.ellisman提供。.討論 在1995年，基因測序的質(zhì)量水平大概是10000bp中出現(xiàn)一個錯誤，而測序一個微生物的基因組需要數(shù)月。今天，基因測序的精確性大大的提高了。覆蓋30到50倍基因組的測序已經(jīng)常見，而且測序只需要幾天的時間。然