基礎(chǔ)生物化學(xué)第10(1)dna章

1、10 DNA10 DNA的生物合成的生物合成 Chapter 10 DNA BiosynthesisChapter 10 DNA Biosynthesis， ReplicationReplication 本章重點與難點本章重點與難點 重點：掌握中心法則；半保留復(fù)制、半不重點：掌握中心法則；半保留復(fù)制、半不 連續(xù)復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、基因工程的概念；參連續(xù)復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、基因工程的概念；參 與與DNADNA復(fù)制的有關(guān)酶類和蛋白質(zhì)及復(fù)制的有關(guān)酶類和蛋白質(zhì)及DNADNA的復(fù)的復(fù) 制過程；制過程；DNADNA損傷修復(fù)的方式。損傷修復(fù)的方式。 難點：對難點：對DNADNA的半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)的半保留復(fù)制、半不

2、連續(xù)復(fù) 制的理解。制的理解。 復(fù)制（復(fù)制（DDDPDDDP） 轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（DDRPDDRP） 翻譯翻譯 DNA mRNA DNA mRNA 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RDDPRDDP） RNA RNA 復(fù)制（復(fù)制（RDRPRDRP） 復(fù)制復(fù)制( (replication) 是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代（母鏈）是指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代（母鏈） DNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNA的過程。的過程。 復(fù)制復(fù)制 親代親代DNA 子代子代DNA 一、一、DNADNA復(fù)制的基本規(guī)律復(fù)制的基本規(guī)律 （一般原理）（一般原理） Basic Rules of DNA Replication l復(fù)制的方式復(fù)

3、制的方式 半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semi-conservative replication) l復(fù)制的高保真性復(fù)制的高保真性(high fidelity) l雙向復(fù)制雙向復(fù)制(bidirectional replication) l半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication) （一）（一）DNA復(fù)制是半保留復(fù)制復(fù)制是半保留復(fù)制(semi-conservative replication) DNA生物合成時，母鏈生物合成時，母鏈DNA解開為兩解開為兩 股單鏈，各自作為模板股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對按堿基配對 規(guī)律，合成與模板互補

4、的子鏈。子代細(xì)胞的規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細(xì)胞的 DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另，一股單鏈從親代完整地接受過來，另 一股單鏈則完全從新合成。兩個子細(xì)胞的一股單鏈則完全從新合成。兩個子細(xì)胞的 DNA都和親代都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制堿基序列一致。這種復(fù)制 方式稱為方式稱為半保留復(fù)制半保留復(fù)制。 半保留復(fù)制的概念半保留復(fù)制的概念 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T

5、C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母鏈母鏈DNA 復(fù)制過程中形成復(fù)制過程中形成 的復(fù)制叉的復(fù)制叉 子代子代DNA 子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式（散布式）混合式（散布式） lDNADNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在19581

6、958年由年由M. Meselson M. Meselson 和和 F. Stahl F. Stahl 所完成的密度飄移實驗所證明。該實驗首先所完成的密度飄移實驗所證明。該實驗首先 將大腸桿菌在含將大腸桿菌在含15 15N N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNADNA中中 的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)榈膲A基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5 15N N。將大腸桿菌移至只含 。將大腸桿菌移至只含14 14N N的培養(yǎng)基 的培養(yǎng)基 中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNADNA，作密度梯，作密度梯 度離心，可得到下列結(jié)果：度離心，可得到下列結(jié)果： 密度梯度實驗密度

7、梯度實驗 實驗結(jié)果支持實驗結(jié)果支持半保留復(fù)制半保留復(fù)制的設(shè)想。的設(shè)想。 含重氮含重氮-DNA的細(xì)菌的細(xì)菌 培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普 通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代 繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于 普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代 梯度離心結(jié)果梯度離心結(jié)果 按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代與親代DNA A 的的堿基序列堿基序列一致一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺 傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。 半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義 遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)， 但但不是絕對的不是絕對的。 原核生物

8、復(fù)制時，原核生物復(fù)制時，DNA從原點從原點 (起始點，起始點， origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向 相反的復(fù)制叉，稱為相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制雙向復(fù)制。 （二）（二）DNA復(fù)制是固定起點的雙向復(fù)復(fù)制是固定起點的雙向復(fù) 制制 復(fù)制中的放射自顯影圖象復(fù)制中的放射自顯影圖象 A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點及復(fù)制起始點 B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉復(fù)制中的兩個復(fù)制叉 C. 復(fù)制接近終止點復(fù)制接近終止點(termination, ter) ori ter A B C 真核生物每個染色體有多個復(fù)制真核生物每個染色體有多個復(fù)制 原點，是多復(fù)制子的復(fù)制。原點

9、，是多復(fù)制子的復(fù)制。 習(xí)慣上把兩個相鄰復(fù)制原點之間習(xí)慣上把兩個相鄰復(fù)制原點之間 的距離定為一個的距離定為一個復(fù)制子復(fù)制子(replicon) 。復(fù)。復(fù) 制子是能夠獨立完成復(fù)制的功能單位。制子是能夠獨立完成復(fù)制的功能單位。 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 復(fù)制子復(fù)制子 3 （三）（三）DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向 3 5 3 3 5 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈 (leading strand) 隨從鏈隨從鏈 (lagging strand) 順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的

10、，這 股鏈稱為股鏈稱為先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈或或領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈。 另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順 著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨隨 后鏈后鏈或或隨從鏈隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段（約。復(fù)制中的不連續(xù)片段（約1000個核個核 苷酸）稱為苷酸）稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment，1968)。 先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨后鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而隨后鏈不連續(xù)復(fù)制，稱為半不連 續(xù)復(fù)制或復(fù)制的續(xù)復(fù)制或復(fù)制的半不連續(xù)性半不連續(xù)性。 二、二、DNA復(fù)制的酶學(xué)復(fù)制的酶學(xué) （DNADN

11、A復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)）復(fù)制相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)） The Enzymology of DNA Replication 參與參與DNA復(fù)制的物質(zhì)復(fù)制的物質(zhì) 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，簡寫聚合酶，簡寫 為為 DDDP或或DNA-pol 模板模板(template) : 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈母鏈 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白質(zhì)因子其他的酶和蛋白質(zhì)因子 （一）復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)（一）復(fù)制的化學(xué)

12、反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 目目 錄錄 聚合反應(yīng)的特點聚合反應(yīng)的特點 DNA 新鏈生成需新鏈生成需引物引物和和模板模板 DNA復(fù)制是模板依賴性的，必須要以親代DNA 鏈作為模板。親代DNA的兩股鏈解開后，可 分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。 新鏈的延長只可沿新鏈的延長只可沿5 3 方向進(jìn)行方向進(jìn)行（模板方向為（模板方向為 3 5 ，合成方向為，合成方向為5 3 。）。） （二）（二）DNA聚合酶聚合酶 全稱：全稱：依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA- dependent DNA polymerase) 簡稱：簡稱：DNA-pol 活性：活性：1. 53

13、 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性 ? 能切除突變的能切除突變的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。 能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 1 1、原核生物的、原核生物的DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 催化催化DNA 聚合聚合 參與參與DNA損損

14、傷的應(yīng)急狀傷的應(yīng)急狀 態(tài)修復(fù)態(tài)修復(fù) 修復(fù)合成、修復(fù)合成、 切除引物、切除引物、 填補空隙填補空隙 功能功能 2040400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞 1011亞基數(shù)亞基數(shù) +-+5 外切酶活性外切酶活性 + 5 外切酶活性外切酶活性 +5 聚合酶活性聚合酶活性 pol IIIpol IIpol I E. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶 原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶 可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性 無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞 多亞基不對稱多亞基不對稱 二聚體二聚體 ？單肽鏈單肽鏈組成組成 250

15、120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性 無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子數(shù)分子數(shù)/細(xì)胞細(xì)胞 多亞基不對稱多亞基不對稱 二聚體二聚體 ？單肽鏈單肽鏈組成組成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 功能功能：對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和 修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補。修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補。 DNA-pol （109kD） 323個氨基酸個氨基酸

16、小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA，進(jìn)行，進(jìn)行 分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 它參與它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 功能：功能：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。是原核生物復(fù)制延長中

17、真正起催化作用的酶。 DNA-pol ：由十種亞基組成，其中：由十種亞基組成，其中亞基具有亞基具有 5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有復(fù)制的酶活性，因而具有復(fù)制DNADNA的功能；而的功能；而 亞基具有亞基具有3535外切酶的活性，因而與外切酶的活性，因而與DNADNA復(fù)制的校復(fù)制的校 正功能有關(guān)。正功能有關(guān)。 (250kD) 2 2、真核生物的、真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。 延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。 參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 。 在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)

18、和填補缺在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補缺 口的作用?？诘淖饔?。 在在線粒體線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 填填補補引引物物 空空隙隙，切切 除除修修復(fù)復(fù)， 重重組組 延延長長子子 鏈鏈的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 線線粒粒體體 DNA復(fù)復(fù) 制制 低低保保 真真度度 的的復(fù)復(fù) 制制 起起始始引引 發(fā)發(fā)，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.0

19、16.5分分子子量量（kD） DNA-pol 填填補補引引物物 空空隙隙，切切 除除修修復(fù)復(fù)， 重重組組 延延長長子子 鏈鏈的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 線線粒粒體體 DNA復(fù)復(fù) 制制 低低保保 真真度度 的的復(fù)復(fù) 制制 起起始始引引 發(fā)發(fā)，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD） DNA-pol l在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNADNA聚合酶有五種，聚合酶有五種， 分別命名為分別命名為DNADNA聚合酶聚合酶

20、（pol pol ），），DNADNA聚合聚合 酶酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），）， DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（pol pol ）。）。 l其中，參與染色體其中，參與染色體DNADNA復(fù)制的是復(fù)制的是pol pol （延長（延長 隨從鏈）和隨從鏈）和pol pol （延長領(lǐng)頭鏈），參與線粒（延長領(lǐng)頭鏈），參與線粒 體體DNADNA復(fù)制的是復(fù)制的是pol pol ，polpol與與DNADNA損傷修復(fù)、損傷修復(fù)、 校讀和填補缺口有關(guān)，校讀和填補缺口有關(guān)，pol pol 只在其他聚合酶只在其他聚合酶 無活

21、性時才發(fā)揮作用。無活性時才發(fā)揮作用。 （三）復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)（三）復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù) 復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn) 確傳代的基本原理。確傳代的基本原理。 復(fù)制保真性的酶學(xué)機制：復(fù)制保真性的酶學(xué)機制： DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀的核酸外切酶活性和及時校讀 復(fù)制的保真性和堿基選擇復(fù)制的保真性和堿基選擇 1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀的核酸外切酶活性和及時校讀 A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用的外切酶活性切除錯配堿基；并用 其聚合活性摻入正確配對的底物。其聚合活性摻入正確配對的底物。 B：堿基配對正

22、確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。 2 2、復(fù)制的保真性和堿基選擇、復(fù)制的保真性和堿基選擇 DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵） 與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng) 的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型反式構(gòu)型。 1. 遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2. 聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能； 3. 復(fù)制出錯時復(fù)制出錯時

23、DNA-pol的及時校讀功能。的及時校讀功能。 DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制復(fù)制的保真性至少要依賴三種機制 （四）復(fù)制中的分子解鏈及（四）復(fù)制中的分子解鏈及DNA 分分 子拓?fù)鋵W(xué)變化子拓?fù)鋵W(xué)變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把 DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。 1、解螺旋酶、引物酶和單鏈、解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白 理理順順DNA鏈鏈拓拓?fù)鋼洚惍悩?gòu)構(gòu)酶酶 (gyrA, B) 穩(wěn)穩(wěn)定定已已解解開開的的單單鏈鏈單單鏈鏈DNA 結(jié)結(jié)合合蛋蛋白白 SSB 催催化化RNA引引物物生生成成引引物物酶酶DnaG

24、(dnaG) 運運送送和和協(xié)協(xié)同同DnaB DnaC (dnaC) 解解開開DNA雙雙鏈鏈 解解螺螺旋旋酶酶DnaB (dnaB) 辨辨認(rèn)認(rèn)起起始始點點 DnaA (dnaA) 蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)（基基因因）通通用用名名功功能能 原原核核生生物物復(fù)復(fù)制制起起始始的的相相關(guān)關(guān)蛋蛋白白質(zhì)質(zhì) E. Coli 基因圖基因圖 目目 錄錄 解螺旋酶解螺旋酶(helicase) 利用利用ATP供能，作用于氫鍵，使供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈雙鏈 解開成為兩條單鏈解開成為兩條單鏈 引物酶引物酶(primase) 復(fù)制起始時催化生成復(fù)制起始時催化生成RNA引物的酶引物的酶 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(singl

25、e stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單 鏈的完整鏈的完整 l解螺旋酶解螺旋酶 （unwinding enzyme） ，又稱，又稱 解鏈酶或解鏈酶或rep蛋白，蛋白， 是用于解開是用于解開DNA雙雙 鏈的酶蛋白，每解鏈的酶蛋白，每解 開一對堿基，需消開一對堿基，需消 耗兩分子耗兩分子ATP。目。目 前發(fā)現(xiàn)存在至少存前發(fā)現(xiàn)存在至少存 在兩種解螺旋酶。在兩種解螺旋酶。 l引發(fā)體引發(fā)體(primosome)(primosome)由引發(fā)前體與引物酶由引發(fā)前體與引物酶 （primaseprimase

26、）組裝而成。）組裝而成。 l引物酶本質(zhì)上是一種依賴引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶 （DDRPDDRP），該酶以），該酶以DNADNA為模板，聚合一段為模板，聚合一段RNARNA短鏈引短鏈引 物物(primer)(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH3-OH，使子代，使子代DNADNA鏈能鏈能 夠開始聚合。夠開始聚合。 1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后 2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA topoisomerase) 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 目目 錄錄 拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點 既能水解既能水解 、又能

27、連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 分分 類類 拓?fù)洚愅負(fù)洚?構(gòu)酶構(gòu)酶 切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA 解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封 閉切口，閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。 反應(yīng)反應(yīng)不需不需ATP。 拓?fù)洚愅負(fù)洚?構(gòu)酶構(gòu)酶 切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過 切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能供能，連接斷端，連接斷端， DNA 分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。 作用機制作用機制 目目 錄錄 （五）（五）DNA連接酶連接酶 連接連接

28、DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P 末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相 鄰的鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。 DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式作用方式 P O O- O- O HO5 P O O- O- O 3 3 5 DNA連接酶連接酶 ATP ADP 53 53 DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。 在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一

29、。 功能功能 三、三、DNA生物合成過程生物合成過程 The Process of DNA Replication 1 1、復(fù)制的起始、復(fù)制的起始 需要解決兩個問題：需要解決兩個問題： 1） DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。 2）合成引物，提供）合成引物，提供3 -OH末端。末端。 （一）原核生物的（一）原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli復(fù)制起始點復(fù)制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTG

30、GATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列 5 3 5 3 a. DNA解鏈解鏈 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 引物引物 酶酶 SSB 3 5 3 5 b. 引發(fā)體和引物引發(fā)體和引物 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA 復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分

31、子。分子。 引物引物 3 HO 5 引物引物 酶酶 復(fù)制的起始 DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。 預(yù)引發(fā)： 1解旋解鏈，形成復(fù)制叉： n 由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單 鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）結(jié)合在兩條單 鏈DNA上，形成復(fù)制叉。 n DNA復(fù)制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這 種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。 2引發(fā)體組裝： n由蛋白因子（如dnaB等）識別復(fù)制起始 點，并與其他蛋白因子以及引物酶一起 組裝形成引發(fā)體。 引發(fā)： n在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成 一段短的RNA片段，從而獲得3端自由羥 基（3-OH

32、）。 2 2、復(fù)制的延長、復(fù)制的延長 復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以 dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上， 其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 聚合子代DNA： n由DNA聚合酶催化，以35方向的親代DNA鏈 為模板，從53方向聚合子代DNA鏈。在原 核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶； 而在真核生物中，是DNA聚合酶(延長隨從鏈) 和（延長領(lǐng)頭鏈）。 引發(fā)體移動： n引發(fā)體向前移動，解開新的局部雙螺旋， 形成新的復(fù)制叉，隨從鏈重新合成RNA引 物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。

33、 5 5 3 3 5 5 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 3 DNA-pol 領(lǐng)頭鏈的合成領(lǐng)頭鏈的合成 隨從鏈的合成隨從鏈的合成 階段一階段一階段二階段二 階段三階段三階段四階段四 復(fù)復(fù) 制制 過過 程程 簡簡 圖圖 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制，雙向復(fù)制的復(fù)制 片段在復(fù)制的終止點片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。處匯合。 ori ter E.coli 82 32 ori ter SV40 50 0 3 3、復(fù)制的終止、復(fù)制的終止 5 5 5 RNA酶酶 OHP 5 DNA-pol dNTP 5 5 P

34、 ATP ADP+Pi 5 5 DNA連接酶連接酶 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接 去除引物，填補缺口： n在原核生物中，由DNA聚合酶來水解 去除RNA引物，并由該酶催化延長引物 缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸 酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引 物的去除，由一種特殊的核酸酶來水 解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。 連接岡崎片段： n在DNA連接酶的催化下，形成最后一個磷 酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完 整的DNA長鏈。 哺乳動物的哺乳動物的 細(xì)胞周期細(xì)胞周期 DNA合成期合成期 G1 G2 S M （二）真核生物的（二）真核生物的DNA生物合成生物合成

35、 細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及期及M期這兩個關(guān)期這兩個關(guān) 鍵點。鍵點。G1S及及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活 性有關(guān)。性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而 實施調(diào)控作用。實施調(diào)控作用。 真核生物每個染色體有多個起始點，是多真核生物每個染色體有多個起始點，是多 復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時序性復(fù)制有時序性，即復(fù)制子以，即復(fù)制子以 分組方式激活而不是同步起動。分組方式激活而不是同步起動。 復(fù)制的起始需要復(fù)制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）（引物酶活性） 和和pol（解螺旋酶活性）參與。還

36、需拓?fù)涿福ń饴菪富钚裕﹨⑴c。還需拓?fù)涿?和復(fù)制因子和復(fù)制因子(replication factor, RF)。 1 1、復(fù)制的起始、復(fù)制的起始 3 5 5 3 領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈 3 5 3 5 親代親代DNA 隨從鏈隨從鏈 引物引物 核小體核小體 2 2、復(fù)制的延長、復(fù)制的延長 染色體染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。呈線狀，復(fù)制在末端停止。 復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。 染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，引物， 去除后留下空隙。去除后留下空隙。 3 3、復(fù)制的終止、復(fù)制的終止 5 3 3 5 5 3 3

37、5 + 5 3 3 3 3 5 5 切除引物的兩種機制切除引物的兩種機制 端粒端粒(telomere) 指真核生物染色體線性指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。分子末端的結(jié)構(gòu)。 功能功能 維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性 維持維持DNA復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性 結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)特點 由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。 末端末端DNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基堿基 的短的短 序列。序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG 端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒

38、酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 組成組成 端粒酶的催端粒酶的催 化延長作用化延長作用 爬爬 行行 模模 型型 DNADNA聚合酶復(fù)制子鏈聚合酶復(fù)制子鏈 進(jìn)一步加工進(jìn)一步加工 四、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式四、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)

39、逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶酶 （一）逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶 反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）：以RNA為模板，合 成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA 的方向相反。 1970年，Temin 和Baltimore分別從致癌RNA病毒（勞 氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒）中發(fā)現(xiàn)發(fā)反轉(zhuǎn)錄酶。 致癌RNA病毒是一大類能引起鳥類、哺乳類等動物白血 病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。這類病毒侵染細(xì)胞 后并不引起細(xì)胞死亡，卻可以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 經(jīng)過改造后可以作為基因治療的載體。 放線菌素D（抑制以DNA為模

40、板的反應(yīng)，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄） 能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，可見致癌RNA病毒的復(fù) 制過程必然涉及DNA。 Bader 用嘌呤霉素（puromycin）來抑制靜止細(xì)胞蛋白 質(zhì)的合成，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞仍能感染勞氏肉瘤病毒 （RSV），證實反轉(zhuǎn)錄酶是由反轉(zhuǎn)錄病毒帶入細(xì)胞的， 而不是感染后在宿主細(xì)胞中新合成的。 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 由一個亞基和一個亞基組成，含有Zn2+，具有三種酶活力。 （1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力（以RNA為模板，合成一條互 補的DNA，形成RNADNA雜種分子）。 （2）RNase H酶活力，水解RNADNA雜種分子中的RNA，可 沿35和53兩個方向起外切酶作用。 （3）DNA指導(dǎo)的

41、DNA聚合酶活力。 模板：模板：RNA或或DNA 以自身病毒類型的RNA為模板時，該酶的反轉(zhuǎn)錄活力最大，但是 帶有適當(dāng)引物的任何種類的RNA都能作為合成DNA的模板。 引物：引物：RNA或或DNA 底物：底物：dNTP 二價陽離子：二價陽離子：Mg2+或Mn2+ 真核mRNA3端有polyA，加入oligo dT后，可以作為反轉(zhuǎn)錄酶的 模板，合成cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象 RNA 模板模板 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA-RNA 雜化雙鏈雜化雙鏈 RNA酶酶 單鏈單鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 雙鏈雙鏈DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 A AA A T T T T A

42、AAA SISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶 堿水解堿水解 T T T T 分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆 轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法 稱為稱為cDNA法。法。 以以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn) 錄合成的與錄合成的與mRNA堿基序列互堿基序列互 補的補的DNA鏈。鏈。 試管內(nèi)合成試管內(nèi)合成cDNA cDNA complementary DNA （二）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義（二）逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中 的重大發(fā)現(xiàn)。的重大發(fā)

43、現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣同樣 兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。 對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意世紀(jì)初已注意 到的病毒致癌理論。到的病毒致癌理論。 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication) （三）滾環(huán)復(fù)制和（三）滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 是某些低等生物的復(fù)制形式，如是某些低等生物的復(fù)制形式，如 X174和和 M13噬菌體等。噬菌體等。 3 -OH 5 -P 5 5 5 3 3 3 3 5 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制 5 5 3 3 5 dNTP DNA-po

44、l D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制(D-loop replication) 是線粒體是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA) 的復(fù)制形式。的復(fù)制形式。 五、五、DNA損傷（突變）與修復(fù)損傷（突變）與修復(fù) DNA Damage (Mutation) and Repair 遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息 改變，均可稱為改變，均可稱為突變。突變。 在復(fù)制過程中發(fā)生的在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為突變稱為DNA 損傷損傷(DNA damage)。 一些物理化學(xué)因子如紫外線、電離輻射一些物理化學(xué)因子如紫外線、電離輻射 和化學(xué)誘變劑均可引起和化學(xué)誘變劑均可

45、引起DNA損傷，破壞其結(jié)損傷，破壞其結(jié) 構(gòu)與功能。然而在一定條件下，生物機體能構(gòu)與功能。然而在一定條件下，生物機體能 使這種損傷得到修復(fù)。使這種損傷得到修復(fù)。 從分子水平來看，突變就是從分子水平來看，突變就是DNA分子上分子上 堿基的改變。堿基的改變。 （一）突變的意義（一）突變的意義 1 1、突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)、突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ) 2 2、突變導(dǎo)致基因型改變、突變導(dǎo)致基因型改變 3 3、突變導(dǎo)致死亡、突變導(dǎo)致死亡 4 4、突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)、突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ) （二）引發(fā)突變的因素（二）引發(fā)突變的因素 物理因素物理因素 紫外線紫外線(ultra violet, U

46、V)、各種輻射、各種輻射 UV 化學(xué)因素化學(xué)因素 常見的化學(xué)誘變劑常見的化學(xué)誘變劑 化合物類別化合物類別作作 用用 點點分子改變分子改變 堿基類似物堿基類似物 如：如：5-BU A 5-BU G - A - - T - - G - - C - 羥胺類（羥胺類（NH2OH）T C - T - - A - - C - - G - 亞硝酸鹽（亞硝酸鹽（NO2）C U - G - - C - - A - - T - 烷化劑烷化劑 如：氮芥類，如：氮芥類，Nitromins G mG G mG DNA缺失缺失G （三）突變的分子改變類型（三）突變的分子改變類型 錯配錯配 (mismatch) 缺失缺失

47、(deletion) 插入插入 (insertion) 重排重排 (rearrangement) 框移框移 (frame-shift) DNA分子上的堿基錯配稱分子上的堿基錯配稱點突變點突變(point mutation)。 發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另 一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1）轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶發(fā)生在異型堿基之間，即嘌呤變嘧啶 或嘧啶變嘌呤?；蜞奏ぷ冟堰省?2)顛換顛換 1 1、錯配、錯配 鐮形紅細(xì)胞貧血病人鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) 亞基亞基 N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈肽鏈 CAC GTG 基因基因 正常成人正常成人Hb (HbA)亞基亞基 N-val his leu thr pro glu glu C 肽鏈肽鏈 CTC GAG 基因基因 2 2、缺失、缺失、插入插入和框移和框移 缺失：缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從一個堿基或一段核苷酸