DNA的酶切圖譜構(gòu)建與分析

1、 實驗七，八實驗七，八DNA限制酶酶切圖譜構(gòu)建與分析限制酶酶切圖譜構(gòu)建與分析1. 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵?學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶學(xué)習(xí)和掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法.掌握掌握運用限制性內(nèi)切酶構(gòu)建大片段運用限制性內(nèi)切酶構(gòu)建大片段DNA圖圖譜原理與技術(shù)并理解限制性內(nèi)切酶是譜原理與技術(shù)并理解限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方片段的有效方法。法。 2. 相關(guān)基礎(chǔ)知識相關(guān)基礎(chǔ)知識 限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈

2、鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水水解酶。是體外剪切基因片段的重要工解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重組中重要的工具，而且還可以用于基因組重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。酶切圖譜的鑒定。1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類型與基本特性核酸限制性內(nèi)切酶的類型與基本特性3) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶4) 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法核酸

3、限制性內(nèi)切酶的命名法5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段。 各各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙雙鏈的核酸內(nèi)切酶，鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成存在于自身細胞內(nèi)，但合成這種酶的細胞自這種酶的細胞自身的身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限進行了修飾，限制性酶對修飾

4、過的制性酶對修飾過的DNA不能起作用。不能起作用。這種現(xiàn)這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及以及切切斷核酸的情況不同，分為三類斷核酸的情況不同，分為三類： 型型 型型* 型型第一類（第一類（I I型）型）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識別專一的核苷酸順序，能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNADNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機

5、的。這類限制順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內(nèi)切酶在性內(nèi)切酶在DNADNA重組技術(shù)或基因工程中重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析用處不大，無法用于分析DNADNA結(jié)構(gòu)或克結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如隆基因。這類酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二類第二類(II(II型型) )限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識別專一的核能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是切酶是DNAD

6、NA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4 4個或個或6 6個核苷酸，少數(shù)也有識別個核苷酸，少數(shù)也有識別5 5個核苷酸以個核苷酸以及及7 7個、個、8 8個、個、9 9個、個、1010個和個和1111個核苷酸的。個核苷酸的。 II II 型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文型限制性內(nèi)切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向朝二個方向“讀讀”都完全相同。這種酶的切都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：割可以有兩種方式：粘性末端；是交

7、錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，粘性末端；是交錯切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。所以稱為粘性末端。如如EcoRIEcoRI的識別順序為：的識別順序為： 55 GAA|TT_C GAA|TT_C 33 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5 5垂直線表示中心對稱軸，從兩側(cè)垂直線表示中心對稱軸，從兩側(cè)“讀讀”核苷酸順序都是核苷酸順序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序（，這就是回文順序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在雙鏈上交錯

8、切割的位置，切割后生成表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成55G AATTCG AATTC33、33CTTAA GCTTAA G55二個二個DNADNA片段，各片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過鍵以及氫鍵可通過DNADNA連接酶的作用而連接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置上切型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoRVEcoRV 的識別的識別位置是：位置是： 55 GAT|ATC GAT|ATC 3 333 CTA|T

9、AG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成55 GAT GAT 和和 ATC ATC 3 3、 33 CTA CTA 和和 TAG TAG 5 5。這種末端同樣可以通過這種末端同樣可以通過DNADNA連接酶連接起來。連接酶連接起來。平頭末端：平頭末端：第三類（第三類（ IIIIII型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶也有專一也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序的識別順序，但不是對稱的回文順序, ,在識在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一

10、因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度定長度DNADNA片段，具有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。不能應(yīng)用于基因克隆。同裂酶：同裂酶：有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順有時兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)序和切割位置都相同，其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如例如HpaHpa和和MspMsp的識別順序都是的識別順序都是55CCG_GCCG_G33，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，則只有甲基胞嘧啶

11、，則只有MspMsp能夠切能夠切割。這些有相同切點的酶稱為割。這些有相同切點的酶稱為同裂酶同裂酶（同切酶或異源同工酶）（同切酶或異源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾同尾酶酶，可以通過，可以通過DNADNA連接酶將這類末端連接連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及Sty

12、lStyl切割的切割的DNADNA序列不同，序列不同，但均給出相同的但均給出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。這些粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的但卻產(chǎn)生了一個新的4 4核苷酸的酶切位點，核苷酸的酶切位點，即即 Bfa1Bfa1的酶切位點的酶切位點。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法v 用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母用屬名的頭一個字母和種名的頭兩個字母表示寄主菌的物種名稱，如表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜體字。示，所以用斜體字。v 用一個

13、字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一個字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用菌株用d，即，即Hind。v 如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如Hind, Hind，Hind等。等。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值

14、。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移?？梢韵蜿枠O遷移。影響影響DNA在瓊脂糖中遷移率的因素：在瓊脂糖中遷移率的因素：DNA分分子的大小、子的大小、DNA的構(gòu)象、電壓、電場方向、的構(gòu)象、電壓、電場方向、堿基組成、嵌入的染料以及電泳緩沖液的組堿基組成、嵌入的染料以及電泳緩沖液的組成。成。瓊脂

15、糖凝膠的濃度影響給定大小的線狀瓊脂糖凝膠的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的膠可以分離不同大小范圍的DNA片段。片段。0.8%的瓊脂糖凝膠能很好地分辨的瓊脂糖凝膠能很好地分辨1-25kb的片段；的片段；0.5% 的瓊脂糖凝膠用于分辨的瓊脂糖凝膠用于分辨較大片段的較大片段的DNA (20-100kb）；對于小）；對于小片段的片段的DNA(0.2-2kb) 可用可用1.5%或更高或更高濃度的凝膠進行分離。不過，以上這些濃度的凝膠進行分離。不過，以上這些并不是絕對的，因為有時我們需要同時并不是絕對的，因為有時我們需要同時分

16、離多種分子量相差較大的片段，因此分離多種分子量相差較大的片段，因此所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。所用瓊脂糖凝膠的濃度要視情況而定。EBEB：即：即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲錠苯基菲錠溴鹽溴鹽, (, (EthidiumEthidium Bromide) Bromide)。它能夠插它能夠插入入DNADNA分子中的堿基對之間而與分子中的堿基對之間而與DNADNA結(jié)合。結(jié)合。由于由于EBEB分子分子的插入，在紫外光的照射下，的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的凝膠電泳中的DNADNA條帶呈現(xiàn)出條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測易于檢測。可以檢測

17、10ng 10ng 的的DNADNA。注意：注意：EBEB是一種誘變劑，操作時一是一種誘變劑，操作時一定要注意安全操作，必須戴塑料或定要注意安全操作，必須戴塑料或乳膠手套乳膠手套。3. 3. 實驗材料與儀器實驗材料與儀器 DNA 標(biāo)準分子量片段標(biāo)準分子量片段 marker marker EcoR,Hind, BamHEcoR,Hind, BamH and so on and so on 核酸內(nèi)核酸內(nèi)切酶（切酶（TakaraTakara） 瓊脂瓊脂糖糖 TBETBE或或TAETAE緩沖液緩沖液(10(10) ) 溴化乙啶染色液溴化乙啶染色液(10mg/ml)(10mg/ml) 上樣液上樣液(10

18、(10) )：0.25% 0.25% 溴酚蘭，溴酚蘭，4040(W/V)(W/V)蔗糖蔗糖 水溶液或水溶液或3030的甘油。的甘油。EcoR I 酶切位點：酶切位點：GAATT_CBamHI 酶切位點：酶切位點：GGATC_CHind 酶切位點酶切位點: AAGCT_T酶活性的定義：酶活性的定義：一個活性單位（一個活性單位（U)U)，是指在，是指在5050 l l反應(yīng)體系反應(yīng)體系中，中，3737o oC C的條件下，經(jīng)過的條件下，經(jīng)過1 1小時的反應(yīng)時間，小時的反應(yīng)時間，將將1 1 g g DNA DNA 完全酶解所需要的酶量。完全酶解所需要的酶量。因為不同的酶所要求的最適反應(yīng)條件不同，因為不

19、同的酶所要求的最適反應(yīng)條件不同，所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。所以一定要使用與酶相匹配的緩沖系統(tǒng)。一般按照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖一般按照銷售酶的公司所提供的相應(yīng)緩沖液。雙酶切或多酶切時要考慮相容性緩沖液。雙酶切或多酶切時要考慮相容性緩沖液問題，一般公司會給用戶提供這方面的液問題，一般公司會給用戶提供這方面的信息。信息。電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等凝膠成像儀，一次性塑料手套等4. 實驗方法和步驟實驗方法和步驟 置于置于3737水浴酶解水浴酶解2 2小時。酶解完成后，分別加小時。酶解完成后，分別加入入2 2 l l 10 10倍的

20、上樣緩沖液倍的上樣緩沖液, , 然后進行電泳分析。然后進行電泳分析。2) 瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠的制備瓊脂糖凝膠液的制備：稱取瓊脂糖凝膠液的制備：稱取0.8g瓊脂糖，瓊脂糖，置于三角瓶中，加入置于三角瓶中，加入100ml TBE或或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。3）膠板的制備）膠板的制備取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條條(寬約寬約1cm)，將有機玻璃內(nèi)槽置于一，將有機玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。水平位置模具上，放好梳子。 將冷卻至將冷

21、卻至65左右的瓊脂糖凝膠液，小左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速心地倒在有機玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內(nèi)槽放在含有璃內(nèi)槽放在含有0.5-1TAE（Tris-乙酸）乙酸） 或或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中硼酸）工作液的電泳槽中使用。使用。4）加樣）加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍加樣頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約品孔容量約1520 l。1 kb DNA ladder（共（共10條帶）條