Western blot

1、Western blot一、Western blot歷史及原理蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，簡稱WB。1975年，繼Edwin Southern發(fā)明的“Southern Blot”，1977年George Stark及其同事發(fā)明的“Northern Blot”技術(shù)之后，受以上兩個(gè)“轉(zhuǎn)印”技術(shù)的啟示，1981年“Western Blot”這一技術(shù)正式問世?？贵w技術(shù)的發(fā)展，電泳及轉(zhuǎn)膜技術(shù)的改進(jìn)使得Western Blot操作日益簡單；分析方法及工具多樣化、成像技術(shù)的革新、高靈敏度示標(biāo)信號(hào)的出現(xiàn)使得Western Blot的檢測范圍得到擴(kuò)

2、展，定量/半定量成為可能。目前Western Blot設(shè)備不斷更新、技術(shù)不斷發(fā)展，WB仍將在較長時(shí)間和應(yīng)用領(lǐng)域內(nèi)得到更加廣泛的應(yīng)用，其檢測靈敏度也將不斷提高。其基本原理與ELISA相似：通過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離混合蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)印到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜、尼龍膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)。以轉(zhuǎn)印到固相載體上的蛋白質(zhì)（多肽）作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體（又稱一抗）特異性結(jié)合，特異性抗體再與酶、熒光素或同位素標(biāo)記的抗一抗抗體（又稱二抗）起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測樣品中特異性蛋白（見圖1）。一抗的質(zhì)量是WB成功的關(guān)鍵，現(xiàn)在市面上抗體公司很多，一般選擇大公司大品牌

3、的抗體對(duì)于實(shí)驗(yàn)的成功很有保證。但是由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的限制只能選擇小公司或國產(chǎn)二線品牌的抗體，這個(gè)時(shí)候需要使用者盡可能多考究：完整的質(zhì)檢數(shù)據(jù)；售后承諾；技術(shù)人員對(duì)產(chǎn)品的熟悉程度。對(duì)于二抗來說，選擇就更需謹(jǐn)慎，雖然二抗看似簡單，其質(zhì)量卻千差萬別，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響也尤為重要。福因德科技（Frdbio）專注于免疫檢測產(chǎn)品的開發(fā)和工藝研究，只做精品；如果客戶購買的產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)不到標(biāo)明的水平，無條件退貨。對(duì)于WB的底物是根據(jù)二抗的標(biāo)記酶來確定的，有大家較為熟悉的辣根過氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，）和堿性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外還有比較少見的葡

4、萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、半乳糖苷酶-Galactosidase，不同的酶對(duì)應(yīng)的底物當(dāng)然也不同，并且底物被催化后應(yīng)該是不擴(kuò)散不溶解的圖1.Western blot 原理示意圖Western blot的主要流程如下：樣品制備 總蛋白質(zhì)的定量 SDS-PAGE電泳 轉(zhuǎn)膜 封閉 一抗孵育 二抗孵育 加底物，顯色/顯影，定影/化學(xué)發(fā)光，下面將對(duì)這些步驟詳細(xì)介紹。二、Western blot操作流程在熟悉原理之后實(shí)驗(yàn)人員可以根據(jù)操作流程輕松開展實(shí)驗(yàn)，下面主要介紹關(guān)于Western blot的主要操作流程。 樣品制備： 動(dòng)物細(xì)胞總蛋白的提取：細(xì)胞都含有一個(gè)保護(hù)細(xì)胞不受外界環(huán)境干擾的細(xì)胞

5、質(zhì)膜，細(xì)胞質(zhì)膜主要由磷-脂雙分子層組成。兩性的脂質(zhì)形成的等離子體膜在具有親水基團(tuán)的同時(shí)也含有疏水性基團(tuán)，從而自發(fā)的形成一個(gè)封閉的雙分子層壁。膜蛋白嵌入在脂質(zhì)雙分子層,橫跨疏水區(qū)，也就是說細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，但其各成分的比例則是隨細(xì)胞類型及生物種屬的不同而對(duì)應(yīng)變化。實(shí)驗(yàn)中提取細(xì)胞蛋白用到的裂解液中含有的表面活性劑如Triton-100、NP-40、SDS等，能夠插入并破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而達(dá)到細(xì)胞裂解的目的。這一類裂解液商品化的有很多，比如福因德科技研制的Western及IP細(xì)胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.W

6、BR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0104）等。在蛋白提取過程中盡量冰上操作以防止蛋白降解，也可適量加入蛋白酶抑制劑PMSF，福因德科技(Frdbio)可提供效果較好的蛋白酶抑制劑（Frdbio,Cat No.WBR0114）。對(duì)于加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除收集貼壁細(xì)胞外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。 細(xì)菌及植物組織總蛋白的提取：對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞來說質(zhì)膜是其唯一的保護(hù)屏障，但是在植物細(xì)胞和細(xì)菌的質(zhì)膜外還有一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁存在。細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，由n-乙酰葡萄糖胺和n-乙酰胞酸兩種氨基糖經(jīng)-1.4糖苷鍵連接間隔

7、排列形成的多糖支架。而溶菌酶可以水解這一糖苷鍵從而達(dá)到裂解細(xì)胞的目的。對(duì)于細(xì)菌的裂解可以用含有一定濃度溶菌酶的PBS緩沖液（TE,pH8.0）即可。而植物細(xì)胞壁主要由纖維素和果膠組成的，這為植物細(xì)胞賦予了細(xì)胞形狀和剛度。對(duì)于植物組織蛋白的提取目前多用機(jī)械破壞法如液氮研磨或化學(xué)法如三氯醋酸-丙酮沉淀法或TCA丙酮沉淀法； 對(duì)于需要提取特殊亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的蛋白如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白、細(xì)胞膜蛋白等，由于操作比較麻煩，可以選用商業(yè)化的試劑盒，例如福因德科技(Frdbio)研制的核蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0106）與線粒體蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.W

8、BR0109）、細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0108）。 總蛋白質(zhì)的定量：提取樣品的總蛋白后需要對(duì)提取的蛋白作定量分析，以便于電泳時(shí)上樣量的把握。目前蛋白定量主要有Lowry法、BCA法（Frdbio,Cat No.WBR0202）、沉淀法、Bradford法（Frdbio,Cat No.WBR0204）等，任何定量都需要選一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為定量依據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用的且方便可靠的就是BSA（牛血清蛋白）。 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一般選用BSA來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為定量標(biāo)準(zhǔn)用的BSA（Frdbio,Cat No.WBR0205），其純度和理化性質(zhì)必須相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。配制一定濃度的B

9、SA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按需求進(jìn)行梯度稀釋，然后根據(jù)各種定量方法測定器數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。福因德科技（Frdbio）有作為定量專用的BSA溶液提供（Frdbio, CatNo.WBE0205），商業(yè)化的蛋白定量測定試劑盒中都有標(biāo)準(zhǔn)BSA配置。 蛋白含量的測定蛋白含量測定的方法有多種，例如Lowry法、BCA法、沉淀法、Bradford法，但目前相對(duì)于另外兩個(gè)來說BCA法和Bradford法使用較多。在裂解細(xì)胞時(shí)使用的裂解液若是Western及IP細(xì)胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）、RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0103）、NP-40裂解液（Frdbio,Cat

10、No.WBR0104）等，則可選用福因德科技（Frdbio）的BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）（Frdbio,Cat No.WBR0202）、BCA蛋白定量試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）或Bradford蛋白濃度測定試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0204）搭配使用，但不同的試劑盒測定精確度不同，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，客戶可根據(jù)實(shí)際需要登陸我們網(wǎng)站查詢相關(guān)產(chǎn)品說明書。SDS-PAGE電泳 制樣上樣總體積一般不超過15l，上樣前將樣品與上樣緩沖液按要求混合后沸水中煮5 min使蛋白變性后立即冰浴。一般使用的是5×上樣緩沖液和2×上樣緩沖液，

11、5×上樣緩沖液的配置方法是：250mM Tris-HCl(pH6.8)、10%(W/V)SDS、0.5%(W/V)、0.5%(W/V)溴酚藍(lán)、50%(V/V)甘油、5%(W/V)-巰基乙醇。2×上樣緩沖液的則在5×的基礎(chǔ)上各含量減半。為節(jié)約科研工作者的時(shí)間和精力，可選擇福因德科技（Frdbio）的商品化上樣緩沖液，可選擇5×的蛋白上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304A）和2×的上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304B）。 制膠聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）是由丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(

12、簡稱Bis)在催化劑過硫酸銨(APS)，N，N，N，N- 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交聯(lián)形成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式，一種是非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）,沒有加變性劑如SDS，電泳過程中蛋白質(zhì)保持完整的天然狀態(tài)，蛋白在其中依三種因素進(jìn)行分離：蛋白大小，結(jié)構(gòu)和電荷；另外一種是變性聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）,在樣品和凝膠中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，加入的SDS與蛋白結(jié)合后使得蛋白帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，最終蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小和凝膠分子孔

13、徑排阻效應(yīng)。對(duì)于待檢蛋白活性有較高要求的實(shí)驗(yàn)中，一般選用Native-PAGE，因?yàn)榉亲冃阅z在分離蛋白后對(duì)蛋白的活性并沒有明顯的影響，例如EMSA。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)，要用低pH凝膠系統(tǒng)，蛋白帶正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高pH（8.8）凝膠系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷向陽極移動(dòng)，SDS -PAGE一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，由濃縮膠（上層膠）和分離膠（下層膠）組成，當(dāng)電泳開始后，電泳開始時(shí)緩沖液中的氯離子泳動(dòng)最快,甘氨酸根離子最慢，因此在中間形成低電導(dǎo)區(qū)，使蛋白聚集在移動(dòng)界面附近,濃縮成一個(gè)狹窄的區(qū)帶。在進(jìn)入

14、分離膠后蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動(dòng)，從而達(dá)到分離蛋白的目的。蛋白分子量不同，所適用生物SDS-PAGE濃度也會(huì)對(duì)應(yīng)不同，下表是聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）和對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分離范圍（kD）聚丙烯酰胺凝膠濃度（%）有效分離范圍（kD）65015083090102080121260151040配制的凝膠質(zhì)量對(duì)電泳條帶的清晰度以及背景有著密切的影響，灌膠前玻璃板一定要洗干凈并且用吸水紙擦干；灌膠時(shí)不能有氣泡；凝膠要徹底才能點(diǎn)樣電泳。另外制膠的藥品丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N，N一亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)在溶解后有毒，因此在制膠過程中一定要小心，注意安全?，F(xiàn)在為方便科研工

15、作者，已經(jīng)有商業(yè)化的SDS-PAGE凝膠試劑盒，例如福因德科技（Frdbio）的SDS-PAGE凝膠試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0401）。 電泳當(dāng)樣品處在濃縮膠中時(shí)電壓不宜過高，可將電壓調(diào)在80V，在電泳大概30min左右，蛋白進(jìn)入分離膠中，此時(shí)可稍微調(diào)高電壓至120V。電泳過程中由于系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)熱，為得到較好的結(jié)果電壓不宜過高，但是為節(jié)約時(shí)間也不能太低，以上是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的較好的電壓選擇。為方便觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果以及判斷蛋白分子量大小，最好使用彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。蛋白遷移不僅與蛋白自身性質(zhì)以及PAGE凝膠有關(guān)，與電泳液也有

16、一定的關(guān)系。電泳液的離子強(qiáng)度，pH等都會(huì)影響蛋白的遷移。電泳液可以選擇使用福因德科技（Frdbio）生產(chǎn)的SDS-PAGE電泳液（Frdbio,Cat No.WBR0301）。 轉(zhuǎn)膜將凝膠分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，目前方法有很多，比如溶移印相法、毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、熱對(duì)流轉(zhuǎn)移法、真空印跡轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法等，電轉(zhuǎn)移法由于其快速性及高效性一直備受科研工作者的青睞。轉(zhuǎn)膜的原理與電泳相同，蛋白與SDS結(jié)合形成復(fù)合體帶負(fù)電，在正負(fù)電場作用下，蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)印到膜上。由于膜對(duì)蛋白的吸附作用很強(qiáng)，同時(shí)由于甲醇的固定作用，所以轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白也不會(huì)輕易穿透膜“跑出去”，但是對(duì)于小分子量的蛋白質(zhì)還是很容易透過膜的孔

17、徑“穿透”出去。所以對(duì)于小分子量的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印時(shí)間不宜太長。轉(zhuǎn)膜儀的紅色代表正極，黑色代表負(fù)極，組裝時(shí)先把濕潤的海綿和濾紙依次鋪在負(fù)極上，再鋪上凝膠，隨后是膜，接著是濾紙和海綿，形成“三明治”結(jié)構(gòu)（見圖2）。注意在鋪凝膠和膜的時(shí)候一定要注意不能有氣泡，盡量用玻璃棒除掉所有氣泡。圖2.濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)半干轉(zhuǎn)的原理與濕轉(zhuǎn)是一樣的，是將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷。在電轉(zhuǎn)儀上鋪3層濕潤的濾紙，再將膜鋪在先鋪濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些轉(zhuǎn)移緩沖液到膜上；小心的將凝膠覆在

18、膠上，并做上記號(hào)；再在凝膠上鋪3層濾紙，注意的是此過程中要保證所有的夾層都是濕潤的，半干轉(zhuǎn)膜的夾層示意圖如下（圖2）。圖2. 半干轉(zhuǎn)膜的夾層示意圖電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜有可分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)：濕轉(zhuǎn)是一種比較傳統(tǒng)的方法，一般使用4預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，并且在4條件下進(jìn)行。濕轉(zhuǎn)電流一般選擇在200400mA，時(shí)間為3090min，也可以1520mA轉(zhuǎn)膜過夜。片段>50kD的可以選用350mA，小片段的可以用250mA，具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽，因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法比較快。但是，半干轉(zhuǎn)移

19、法中濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路；另外半干轉(zhuǎn)過程中會(huì)大量產(chǎn)熱但是不好降溫，容易將膜烘干；且半干轉(zhuǎn)的效果不如濕轉(zhuǎn)的好，因此還是推薦大家使用濕轉(zhuǎn)的方式。轉(zhuǎn)膜的效率不僅跟蛋白在特定條件下與膜的結(jié)合能力也有關(guān)，另外還取決于凝膠的成分、凝膠與膜的接觸是否徹底、轉(zhuǎn)膜的時(shí)間，蛋白大小、蛋白組成以及電泳液。WB實(shí)驗(yàn)中常用的膜有PVDF和NC膜，PVDF膜是疏水性的，膜孔徑有大有小，隨著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固；PVDF膜使用是需要甲醇預(yù)處理的，用目的是活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電的蛋白結(jié)合。而NC膜的使用也很簡便，不需要預(yù)處理，只

20、要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了。不過NC膜比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途；而PVDF膜具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，是印跡法中的理想固相支持物材料。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可以用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）或者氨基黑10B或印度墨水檢測轉(zhuǎn)膜效果，麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色不會(huì)干擾后續(xù)對(duì)膜的處理；也可以考染轉(zhuǎn)膜后的PAGE凝膠，檢查蛋白是否有殘留。 封閉從凝膠上轉(zhuǎn)印的蛋白不能把膜表面全部占據(jù)，因此需要封閉膜上剩余的位點(diǎn)防止抗體非特異性吸附，這就是封閉。最常用的封閉物質(zhì)是一些非相關(guān)蛋白，常見的有BSA、脫脂奶粉、各種動(dòng)物血清、酪

21、蛋白；封閉緩沖液的對(duì)后續(xù)蛋白檢測的靈敏度、背景、信號(hào)強(qiáng)弱都有很大的影響。不同的抗原/抗體會(huì)適應(yīng)不同的封閉緩沖液，所以對(duì)于檢測效果不怎么理想的蛋白需要開展預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)其封閉緩沖液配方進(jìn)行優(yōu)化。福因德科技（Frdbio）所用封閉液為含5%脫脂奶粉的TBST(24.22g Tris、87.66g NaCl,加鹽酸調(diào)pH8.0，0.05%的Tween-20)。 洗滌同其他免疫檢測技術(shù)一樣，WB每一步的試劑孵育之后都要有一步洗滌，洗去游離的未結(jié)合的試劑、抗體，洗滌不充分會(huì)造成背景高，產(chǎn)生噪音信號(hào)，洗滌過度又會(huì)導(dǎo)致靈敏度降低，因此對(duì)于洗滌液的配方及洗滌時(shí)間的控制都需要優(yōu)化。通常用的洗滌液是含有Tris的TBS

22、或含有磷酸鹽的PBS緩沖液，為降低非特異性結(jié)合，一般會(huì)在洗滌液中加入終濃度0.05%的Tween-20。需要注意的是WB中使用的有些試劑如NP-40、Tween-20容易滋生微生物及真菌，而這些污染會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，因此在實(shí)驗(yàn)過程中所用到的試劑都要新鮮配制，過濾除菌，4存放，一定要保證所用到的試劑都是無菌高純度的。福因德科技使用的洗滌液是TBST(0.05% Tween-20)。 一抗孵育WB主要是由一抗特異性識(shí)別膜上的目的蛋白或抗原決定簇，一抗的選擇主要依據(jù)于待檢抗原，需要注意的是并不是所有的一抗都適合于Western檢測的使用。一抗的稀釋度通常需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索條件，可以根據(jù)說明書上建議

23、的WB稀釋度附近做23個(gè)梯度，如果是用化學(xué)發(fā)光法檢測，由于其靈敏度高因此建議將稀釋度再降低25倍，甚至10倍。 二抗孵育二抗的選擇主要有三個(gè)原則：效價(jià)高；高效價(jià)的二抗對(duì)WB的結(jié)果很重要；效價(jià)高的二抗在使用時(shí)由于稀釋倍數(shù)高，自然非特異性吸附就低得多，背景也就低了。二抗效價(jià)高不但是二抗效價(jià)高，同時(shí)HRP標(biāo)記的效率也要高。背景低，抗體的純度一定要高，高純度的抗體產(chǎn)生的非特異性背景較少。；質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)量穩(wěn)定是比較難以把握但是又必須保證的，這就需要在制備抗體抗體過程中所有操作都是可重復(fù)的，每一步都有嚴(yán)格的質(zhì)控，同時(shí)在穩(wěn)定劑和配方工藝上優(yōu)化，福因德科技（Frdbio）就是按此要求來工作的，研發(fā)出的抗體都是

24、高質(zhì)量且穩(wěn)定的抗體。在Western檢測過程中一抗對(duì)于靶蛋白的識(shí)別并不是通過直接的方法進(jìn)行檢測的，一般標(biāo)記的二抗才是檢測的直接對(duì)象。二抗的作用是放大信號(hào)，它是根據(jù)一抗而決定的，比如一抗來源于未免疫的小鼠，那么二抗必須是來源于小鼠之外的抗鼠IgG。另外，二抗的標(biāo)記也要根據(jù)檢測方法選擇合適的標(biāo)記，也就是二抗的標(biāo)記與顯色方法是配套使用的。目前商品化的二抗種類很多，標(biāo)記種類也有多樣供大家選用。比如HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記、AP（堿性磷酸酶）標(biāo)記、Biotin（生物素）標(biāo)記、等標(biāo)記的二抗，其中福因德科技（Frdbio）已經(jīng)研究出70余種標(biāo)記二抗。對(duì)于抗體的稀釋度從1:1001：500,000不等，母

25、液濃度一般為1mg/ml。不同的檢測系統(tǒng)對(duì)抗體的稀釋也會(huì)有不同的需求，當(dāng)然檢測靈敏度越高則抗體稀釋度越高，反之亦反。但是抗體的濃度最好不要太高，爭取有限的抗體可以得出漂亮的檢測結(jié)果，因?yàn)榈蜐舛鹊目贵w因?yàn)樵鰪?qiáng)了親和的特異性而有利于降低背景。 底物顯色目前在WB檢測中最常用的酶是AP和HRP，鑒于HRP的物美價(jià)廉，高性能的卓越表現(xiàn)，使AP漸漸退出歷史舞臺(tái)。AP對(duì)應(yīng)的底物為BCIP/NBT，您可以選擇商品化的BCIP/NBT試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0601）。HRP對(duì)應(yīng)的底物很多，DAB、TMB、ECL等。與其他酶相比AP有一個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢是在高靈敏度時(shí)可較長時(shí)間顯色，但長時(shí)間顯色必

26、然帶來背景高的后果。以上所說的是通過酶化底物產(chǎn)物不溶性沉淀物來顯示信號(hào)并記錄信號(hào)的，被稱為WB第一代信號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)；為了提高其靈敏度，科研工作者將魯米諾（ECL）作為HRP的底物，催化其發(fā)光，通過底片曝光、顯影、定影記錄信號(hào)，稱為WB第二代信號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)，第二代信號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)仍然是手工操作，需要暗房沖洗底片，人為控制影響因素很多，隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了WB第三代信號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)：第三代信號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)的底物和第二代相同，只不過其是通過儀器記錄信號(hào)的，其儀器核心元件為冷光CCD。第三代技術(shù)通過電子技術(shù)可以很容易控制曝光時(shí)間，得到效果較好的圖片，但是儀器成本太高，最便宜的價(jià)格都在10萬元以上?，F(xiàn)如今第一代信

27、號(hào)呈現(xiàn)技術(shù)已經(jīng)基本被淘汰，第二、三代呈現(xiàn)技術(shù)核心是魯米諾（ECL）化學(xué)發(fā)光底物，Pierce公司的Super-Signal系列化學(xué)發(fā)光液穩(wěn)定性好但是價(jià)格昂貴，福因德科技（Frdbio）在化學(xué)底物領(lǐng)域已掌握核心技術(shù)，其生產(chǎn)的ECL化學(xué)發(fā)光底物（Frdbio,Cat No.WBR0107）品質(zhì)與Pierce系列產(chǎn)品媲美。三、Western blot1.蛋白樣品提?。?）細(xì)胞總蛋白的提取：1、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液。2、每瓶細(xì)胞加3 ml ，4 預(yù)冷的Western及IP細(xì)胞裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105）或RIPA裂解液（Frdbio,Cat No.

28、WBR0103）。平放輕輕搖動(dòng)1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將裂解液棄凈，把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1 ml裂解液加10l PMSF (100 mM)（Frdbio,Cat No.WBR0114），搖勻置于冰上。4、每瓶細(xì)胞加400l含PMSF裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。(整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行)6、于4 下12000 rpm離心5 min。7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于-20 保存

29、。（2）組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊用干凈的剪刀盡量剪碎，并置于12 ml勻漿器球狀部位。2、加400l裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3、重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30min后，可用移液器將裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）移至1.5 ml離心管中，然后在4 下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于-20 保存。（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按(一)操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?#160;1

30、、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。2、棄上清，加入4 mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3、用槍吸干上清后，加100l裂解液（Frdbio,Cat No.WBR0105、Cat No.WBR0103）(含PMSF)冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4 、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20 保存。2.蛋白含量的測定用BCA蛋白定量試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0201）測定蛋白含量，如下

31、表：試劑管號(hào)12345空白管測定管蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液L (1 mg/mL)2040608010000ddH2O (L)8060402001000待測樣品 (L)000000100BCA工作液 (mL)2222222混勻，37 保溫30 min，用562 nm比色，測定吸光值測定結(jié)果3.SDSPAGE電泳 清洗玻璃板： 制樣點(diǎn)樣量一般為10l，根據(jù)樣品的濃度選擇合適的上樣緩沖液：若蛋白濃度較高，選擇2×的上樣緩沖液（Frdbio,Cat No.WBR0304B），將蛋白與上樣緩沖液按11的體積比混勻后，100煮樣5min；若蛋白濃度不是特別高則可選用5×的蛋白上樣緩沖液（Frdbi

32、o,Cat No.WBR0304A），將蛋白與上樣緩沖液按41的體積比混勻后，100煮樣5min即可。煮樣結(jié)束后立即取出冰浴，等待點(diǎn)樣。 制膠注意：一定要帶手套，因?yàn)槠渲械谋０窞樯窠?jīng)性致毒劑，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有損傷作用；加入各成分后一定要混勻，否則可能會(huì)有局部凝固的現(xiàn)象；操作一定要快，防止提前凝固；下表是配制濃縮膠和對(duì)應(yīng)濃度的分離膠各成分的含量分離膠：（10ml） 不同濃度凝膠各成分體積 （ml）各組分名稱6%8%10%12%15%H2O5.34.64.03.32.330% Acrylamide2.02.73.34.05.01.0M Tris-HCl（pH8.8）2.52.52.52.52.51

33、0% SDS0.10.10.10.10.110%AP(過硫酸銨)0.10.10.10.10.1TENED0.0080.0060.0040.0040.004總體積1010101010濃縮膠：（5ml）各組分名稱體積(ml)H2O3.430% Acrylamide0.831.0M Tris-HCl（pH6.8）0.6310% SDS0.0510%AP(過硫酸銨)0.05TENED0.005為了方便客戶，減少客戶在配制丙烯酰胺凝膠過程中對(duì)人體傷害，福因德科技（Frdbio）推出了凝膠配制試劑盒（Frdbio,Cat No.WBR0401），為了更方便科研工作者，福因德科技（Frdbio）還推出了預(yù)制

34、膠供客戶選用。 上樣注意：點(diǎn)樣前需離心，取上清點(diǎn)樣；所有孔都點(diǎn)樣，所點(diǎn)樣品體積和量都差不多，重要樣品點(diǎn)中間一點(diǎn)，最兩邊不要點(diǎn)重要樣品；為了便于標(biāo)識(shí)分子量，WB建議使用彩色預(yù)染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 電泳80 V電壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)至濃縮膠和分離膠分界處時(shí)，改電壓為120V繼續(xù)電泳，溴酚藍(lán)至膠底部1 cm左右時(shí)停止電泳，耗時(shí)大約90min。4.轉(zhuǎn)膜（以濕轉(zhuǎn)為例）（1）根據(jù)膠的尺寸準(zhǔn)備相同大小的濾紙6張和PVDF或NC膜1張(一定要戴手套)。PVDF膜使用前需要用甲醇活化，NC膜使用時(shí)轉(zhuǎn)膜液中需要加20 %甲醇（轉(zhuǎn)膜液/甲醇體積比41）。（2）將夾子打開使

35、黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊三層濾紙，趕去其中的氣泡。（3）分離膠蓋于濾紙上與濾紙對(duì)齊，趕去氣泡。將膜蓋于膠上，在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一張海綿墊，合起夾子。（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾的黑面對(duì)槽的黑面（電源負(fù)極），白面對(duì)槽的紅面（電源正極）。根據(jù)目的蛋白分子量確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電流。濕轉(zhuǎn)一般推薦設(shè)定電流為300400mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為4060min。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大電流值300

36、mA，延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。另外，轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱比較厲害，最好是放在冰浴中進(jìn)行。（6）轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考馬斯亮藍(lán)染PAGE膠，檢測轉(zhuǎn)膜效率。5.抗體孵育（1）標(biāo)記轉(zhuǎn)印面后將膜移至含有封閉液（5%的脫脂奶粉溶解在TBST緩沖液中）的容器中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。（2）封閉完之后，用TBST洗滌12次，將一抗中用TBST按照說明書推薦比例進(jìn)行稀釋，制備成一抗工作液，一般在12002000；將膜放入一抗工作液中，室溫下孵育12 h或4孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS

37、洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀釋1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀釋度都在13000以上；用TBS-T在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將ECL發(fā)光試劑盒的A液（配方：1.722g魯米諾用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）兩種試劑等體積混合，配成ECL化學(xué)發(fā)光工作液；將膜的轉(zhuǎn)印面與此混合液充分接觸；15 min后，吸盡殘液，覆膜，放入膠片夾中。（2）在暗室中，將顯影液和定影液分別倒入顯影定影缸中；在紅燈下取出膠片，剪裁適

38、當(dāng)大??；把膠片放在膜上，關(guān)上膠片夾；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間；曝光完成后，取出膠片，浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把膠片浸入定影液中，定影時(shí)間以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。（顯影液配方：750ml溫水（3045）、3.5g米吐爾、45g無水亞硫酸鈉、12g幾奴尼、45g無水碳酸鈣、2g溴化鉀，加冷水定容至1L；定影液配方：600ml 50的水、240g硫代硫酸鈉、15g無水亞硫酸鈉、48ml 28%的醋酸、7.5g硼酸、15g明礬加水定容至1L）福因德科技（Frdbio）有高品質(zhì)的顯/定影液可供客戶選用（Frdbio,Cat

39、No.WBR0801）。7.凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值等。 上樣注意：點(diǎn)樣前需離心，取上清點(diǎn)樣；所有孔都點(diǎn)樣，所點(diǎn)樣品體積和量都差不多，重要樣品點(diǎn)中間一點(diǎn)，最兩邊不要點(diǎn)重要樣品；為了便于標(biāo)識(shí)分子量，WB建議使用彩色預(yù)染Marker（Frdbio,Cat No.WBR0501B）。 電泳80 V電壓進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)至濃縮膠和分離膠分界處時(shí)，改電壓為120V繼續(xù)電泳，溴酚藍(lán)至膠底部1 cm左右時(shí)停止電泳，耗時(shí)大約90min。4.轉(zhuǎn)膜（以濕轉(zhuǎn)為例）（1）根據(jù)膠的尺寸準(zhǔn)備相同大小的濾紙6張和PVDF或NC膜1張(一定要戴手套)。PVDF膜使用前

40、需要用甲醇活化，NC膜使用時(shí)轉(zhuǎn)膜液中需要加20 %甲醇（轉(zhuǎn)膜液/甲醇體積比41）。（2）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊三層濾紙，趕去其中的氣泡。（3）分離膠蓋于濾紙上與濾紙對(duì)齊，趕去氣泡。將膜蓋于膠上，在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一張海綿墊，合起夾子。（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，夾的黑面對(duì)槽的黑面（電源負(fù)極），白面對(duì)槽的紅面（電源正極）。根據(jù)目的蛋白分子量確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電流。濕轉(zhuǎn)一般推薦設(shè)定電流為300400mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間為4060min。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定。目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間

41、越短。一般分子量在60kD以下的250m,60min即可，分子量在60kD以上的需要增大電流值300mA，延長轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。另外，轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱比較厲害，最好是放在冰浴中進(jìn)行。（6）轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染液（Frdbio,Cat No.BHP0370）染膜或直接考馬斯亮藍(lán)染PAGE膠，檢測轉(zhuǎn)膜效率。5.抗體孵育（1）標(biāo)記轉(zhuǎn)印面后將膜移至含有封閉液（5%的脫脂奶粉溶解在TBST緩沖液中）的容器中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。（2）封閉完之后，用TBST洗滌12次，將一抗中用TBST按照說明書推薦比例進(jìn)行稀釋，制備成一抗工作液，一般在12002000；將膜放入一抗工作

42、液中，室溫下孵育12 h或4孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。（3）同上方法孵育二抗工作液，二抗一般稀釋1100010000福因德科技（Frdbio）二抗稀釋度都在13000以上；用TBS-T在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次8 min；再用TBS洗一次，8 min。6.化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將ECL發(fā)光試劑盒的A液（配方：1.722g魯米諾用0.1mol/L的NaOH溶解后用水定容至1L）和B液（0.1mol/L的Na2S2O8溶液）兩種試劑等體積混合，配成ECL化學(xué)發(fā)光工作液；將膜的轉(zhuǎn)印面與此混合液充分接觸；15 min后，吸盡殘液，覆膜，放入膠片夾中。（2）在暗室中，將顯影液和定影液分別倒入顯影定影缸中；在紅燈下取出膠片，剪