抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體ANCA的檢測(cè)及臨床意義

1、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體 (ANCA) 檢測(cè)及臨床意義間接熒光免疫 (IIF) 方法(歐盟)一、 ANCA 概念及分類 抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體是一種以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成份為靶抗原 的自身抗體，對(duì)系統(tǒng)性血管炎炎癥性腸病等多種疾病的診斷和鑒別診斷具有重要 的意義，已成為自身免疫性疾病的一項(xiàng)非常重要的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。目前，已經(jīng)有十余種中性粒細(xì)胞胞漿成分被證實(shí)為 ANCA 的靶抗原，蛋白酶 3(PR3)，髓過(guò)氧化物酶(MPO)，人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)，乳鐵蛋白(LF)，組織 蛋白酶G(Cath G),殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2), 溶菌素(LYS),天

2、青殺素，防御素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶。根據(jù)乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)片中，可以區(qū)分兩種不同的熒光模型：一種胞漿型(c-ANCA)，是均勻分布在整個(gè)中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒型熒光， 細(xì)胞核無(wú)熒光。在乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片中，其熒光模型表現(xiàn)相同。其 主要的靶抗原是蛋白酶 3(PR3)。另一種是核周型(p-ANCA)，是圍繞中性粒細(xì)胞細(xì)胞核周圍的平滑帶狀熒光。 由多種抗原引起，主要靶抗原是髓過(guò)氧化物酶(MPO)，人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)， 乳鐵蛋白(LF)，組織蛋白酶G(Cath G)，殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān) 膜蛋白2 (H-LAMP2)，溶菌素(LYS)等。不同抗體在

3、乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞 片中，其熒光模型表現(xiàn)有所不同。抗MPO抗體產(chǎn)生的p-ANCA因耐甲醛，其熒光 模型與在乙醇固定的中性粒細(xì)胞中出現(xiàn)的 c-ANCA 類似故叫甲醛抗性的 p-ANCA。 而其他非 MPO 抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞反應(yīng)， 無(wú)熒光表現(xiàn)， 這種類型又稱 為甲醛敏感的p-ANCA。故根據(jù)乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片表現(xiàn)，可初步判 定ANCA的靶抗原PR3, MPO,非MPO三類。二、ANCA的檢測(cè)間接熒光免疫方法是檢測(cè) ANCA 的參考方法或者標(biāo)準(zhǔn)方法，至今也是最常用 的經(jīng)典方法。IIF是區(qū)分c-ANCA和p-ANCA的基礎(chǔ)，有較高敏感性，可半定量， 但I(xiàn)IF測(cè)定的是總AN

4、CA，不能準(zhǔn)確區(qū)分靶抗原，需特異性的檢測(cè)方法作為補(bǔ)充。由于多種免疫性疾病患者存在 ANA，用IIF法檢測(cè)ANCA時(shí)，會(huì)產(chǎn)生干擾實(shí)驗(yàn)結(jié) 果的判斷。為避免干擾現(xiàn)象，采用了四基質(zhì)聯(lián)合的檢測(cè)即：乙醇固定的粒細(xì)胞； 甲醛固定的粒細(xì)胞；Hep-2 （人喉癌細(xì)胞）細(xì)胞；猴肝細(xì)胞?；|(zhì)片各細(xì)胞分布及 意義如表一所述。ANCA熒光模型及表現(xiàn)如表二所述。表一：四聯(lián)基質(zhì)片分布及意義區(qū)分ANA的干擾：Hep-2細(xì)胞有典型熒光表現(xiàn)，Hep-2細(xì)胞甲醛固定 粒細(xì)胞1判斷c-ANCA ,2:區(qū)分 p-ANCA對(duì)甲 醛敏感還是耐受甲醛抗性p-ANCA :抗MPO抗體 耐甲醛，其熒光與在乙醇固定的 中性粒細(xì)胞中的 c-ANCA

5、類似甲醛敏感p-ANCA :其他非MPO抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞 反應(yīng)，無(wú)熒光表現(xiàn)區(qū)分ANA與ANCA :借助猴肝細(xì) 胞和其中的肝血竇粒細(xì)胞。ANCA陽(yáng)性，只有肝血竇粒細(xì)胞出 現(xiàn)熒光，。如果兩者冋時(shí)陽(yáng)性，所 有肝細(xì)胞核都有熒光。猴肝 細(xì)胞乙醇固定 粒細(xì)胞疋標(biāo)準(zhǔn)頭驗(yàn)基質(zhì)。區(qū)分兩種熒光模型：c-ANCA ; p-ANCA。表二：ANCA熒光模型及表現(xiàn)熒光模型熒 光 表 現(xiàn)乙醇固定粒細(xì)胞甲醛固定粒細(xì)胞Hep-2細(xì)胞猴肝細(xì)胞ANA陰 性c-ANCA陽(yáng)性胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁(yè)核之間熒光增 強(qiáng)。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁(yè)核

6、之間熒光增 強(qiáng)。陰性肝細(xì)胞本身無(wú)熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn) yH-;、f/熒光。p-ANCA陽(yáng)性甲醛 耐受 p-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲 狀帶熒光。熒光陽(yáng)性 的胞質(zhì)主要集中在分 頁(yè)核周圍，形成環(huán)狀 或不規(guī)則的塊狀。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆 粒熒光，胞質(zhì)熒光清 晰勾勒出核的輪廓， 分頁(yè)核之間熒光增 強(qiáng)。陰性肝臟細(xì)胞本身無(wú)熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn)yH-;、f/熒光。甲醛 敏感p-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲 狀帶熒光。熒光陽(yáng)性 的胞質(zhì)主要集中在分 頁(yè)核周圍，形成環(huán)狀 或不規(guī)則的塊狀。陰性陰性肝臟細(xì)胞本身無(wú)熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞出現(xiàn)yH-;、f/熒光。ANAANCA陰性細(xì)胞核陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)陰性細(xì)胞核呈現(xiàn)

7、熒光表現(xiàn)，如ANA所述肝細(xì)胞核陽(yáng)性。 肝血竇粒細(xì)胞未見(jiàn)熒 光。陽(yáng) 性甲醛耐受p-ANCA陽(yáng)性細(xì)胞核陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)熒光表現(xiàn)如c-ANCA陽(yáng)性，乙醇，甲醛固 定粒細(xì)胞所述細(xì)胞核呈現(xiàn) 熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇粒細(xì)胞都有熒光。甲醛敏感p-ANCA陽(yáng)性細(xì)胞核陽(yáng)性，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)陰性細(xì)胞核呈現(xiàn) 熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇粒細(xì) 胞都有熒光。二、注意事項(xiàng)為提高對(duì)疾病診斷的特異性，檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意以下問(wèn)題1、檢測(cè)ANCA，般建議同時(shí)做IIF初篩和確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以提高 ANCA的臨床應(yīng)用 價(jià)值，不做單獨(dú)初篩或單獨(dú)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以免降低對(duì)疾病診斷的特異性。2、 不能僅檢測(cè)抗PR3和MPO兩種特異性抗

8、體，而不檢測(cè)，這樣容易限制 ANCA 對(duì)疾病診斷的特異性。3、 用IIF檢測(cè)時(shí)，僅使用乙醇固定的粒細(xì)胞片，這樣不能嚴(yán)格排除ANA的干擾， 容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。四、臨床意義(一) ANCA與原發(fā)性小血管炎韋格納肉芽腫(WG)，顯微多動(dòng)脈炎(MPA)，壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN) 和變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(CSS)等等原發(fā)性系統(tǒng)性小血管炎的發(fā)病與 ANCA密切 相關(guān)，臨床上已將上述疾病統(tǒng)稱為 ANCA相關(guān)小血管炎。ANCA,特異性PR3抗體 和抗MPO抗體的檢測(cè)已成為原發(fā)性小血管炎的敏感特異的血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。1、抗PR3抗體特異性PR3抗體為WG的標(biāo)志性抗體，抗PR3抗體熒光模型以c-ANCA為

9、主。 但以c-ANCA診斷WG特異性為90%，而以抗PR3抗體的特異性可超過(guò)95%。 抗PR3抗體在其他的原發(fā)性血管炎中業(yè)可以檢測(cè)出來(lái)，但陽(yáng)性率較低。抗PR3抗體敏感度與疾病的活動(dòng)性及病程有關(guān)， 在疾病的早期癥狀不明顯時(shí)， 就可出現(xiàn)陽(yáng)性。因而抗PR3抗體常作為WG的早期診斷、療效判斷、復(fù)發(fā)估計(jì)的指標(biāo)，對(duì)臨床治療有重要的參考價(jià)值。2、抗MPO抗體抗MPO抗體熒光模型以p-ANCA為主，主要與 MPA、NCGN、CSS相關(guān)。還可見(jiàn)于其他疾病，如節(jié)結(jié)性多動(dòng)脈炎，抗腎小球基底膜腎病， WG，SLE, RA， 藥物誘導(dǎo)的狼瘡，F(xiàn)elty綜合癥等?？贵w滴度與疾病活動(dòng)性相關(guān)，可用于早期診斷、 療效判斷、復(fù)發(fā)

10、估計(jì)的指標(biāo)，對(duì)臨床治療有重要的參考價(jià)值?？筂PO抗體陽(yáng)性高度提示壞死性血管炎或特發(fā)性 NCGN，對(duì)診斷原發(fā)性小血管炎的特異性達(dá)到99%。因而每一個(gè)不明原因的血管炎或腎小球腎炎的患者，都 應(yīng)該檢測(cè)ANCA。表三：ANCA與原發(fā)性小血管炎相關(guān)疾病熒光模型靶抗原（）韋格納肉芽腫（WG）C , P （少見(jiàn)）PR3 (85), MPO (10)顯微多動(dòng)脈炎（MPA）C , PPR3 (45) , MPO (45)壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）C , P （少見(jiàn)）PR3 (25) , MPO (65)變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（CSS）C , P （少見(jiàn)）PR3 (10) , MPO (60)結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈

11、炎（PAN）少見(jiàn)PR3 (5), MPO (15)抗腎小球基底膜?。?GBN）PMPO（二） ANCA與藥物誘導(dǎo)性血管炎近年來(lái)不斷有藥物治療引起的 ANCA陽(yáng)性的病例報(bào)道，如丙基硫氧嘧啶，肼 苯噠嗪，普魯卡因酰胺，青酶胺，美滿霉素，他巴唑/甲巰咪唑等。其中報(bào)道比較多的是長(zhǎng)期使用丙基硫氧嘧啶引起的 ANCA，其特點(diǎn)是滴度高，抗體譜廣（抗原 主要是MPO，也可同時(shí)伴有或單獨(dú)出現(xiàn)其他靶抗原，女口 PR3, LF , Cath G, BPI, LYS 等）。藥物誘導(dǎo)性血管炎患者臨床表現(xiàn)與原發(fā)性血管炎類似，停止丙基硫氧嘧啶用 藥后，臨床癥狀好轉(zhuǎn)， ANCA 可轉(zhuǎn)陰。因此，長(zhǎng)期使用丙基硫氧嘧啶治療過(guò)程中

12、， 應(yīng)定期檢測(cè) ANCA ，及早發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)性血管炎。（三） ANCA 與其他疾病除原發(fā)性血管炎外，其他一些疾病中也可出現(xiàn) ANCA ，主要為 p-ANCA ，其 靶抗原并非PR, MPO，而是LF , Cath G, BPI, LYS等1、慢性炎癥性腸病 （CIBD）CIBD是一種消化系統(tǒng)的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）,克羅恩病（CD）兩種。以往的CIBD診斷依賴X線檢查，內(nèi)窺鏡及組織學(xué)診斷，缺乏 有效的試驗(yàn)室指標(biāo)。 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn) UC 病人血清中 ANCA 陽(yáng)性率為 60-80，而 CD 患者的陽(yáng)性率為 10-20,多為 p-ANCA ,相關(guān)靶抗原有 BPI 等。滴度與疾病 的活動(dòng)度和病程無(wú)關(guān)。因?yàn)?p-ANCA 在 UC 陽(yáng)性率高, CD 陽(yáng)性率低,故可作為兩 者的鑒別診斷及 UC 早期診斷指標(biāo)。2、結(jié)締組織病在結(jié)締組織病中，ANCA陽(yáng)性主要見(jiàn)于SLE和RA，其他結(jié)締組織病中少見(jiàn)。 但文獻(xiàn)報(bào)道在 SLE 和 RA 陽(yáng)性率差異特別大（ 16-69）,這可能與使用方法,抗 原基質(zhì)片及工作人員水平有很大關(guān)系。SLE中ANCA陽(yáng)性可能與