煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定

1、煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究報告項目組2012年7月煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法1概 述煙葉的吃味品質(zhì)主要受化學成分、物理性狀等因素影響，其中化學成分作為物質(zhì)基礎(chǔ)是決定性因素。多年來，煙草化學家試圖從煙草化學成分含量及其相互關(guān)系得到評價煙草品質(zhì)的客觀指標，如還原糖、總糖、煙堿、總氮、淀粉、石油醚提取物等常規(guī)指標。人們對煙葉香味成分和致香前體物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)化學成分相比，煙草表面物質(zhì)包括二萜、糖酯等組分的含量對煙草香味品質(zhì)具有更重要作用。洗滌去除煙葉表面物質(zhì)后煙葉香味和吃味明顯減弱，同時增加了苦澀味。而將煙葉表面物質(zhì)加回洗滌后的煙

2、葉上，煙葉的香味和吃味即可恢復。西柏烷二萜醇是煙草表面物質(zhì)的主要成分，文獻報道鮮煙葉中西柏烷二萜醇含量占葉面總脂類物質(zhì)的50%，可占葉鮮重的0.7%。煙草表面含量較高的西柏烷二萜醇的結(jié)構(gòu)如圖1所示，化學名分別為()-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇()-cembrenediol，() CBD)。CBD和CBD為差向異構(gòu)體，CBD的絕對構(gòu)型為(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇，CBD的絕對構(gòu)型為(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇。圖1 (1)-2, 7, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇 (2)-2, 1

3、7, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇西柏烷二萜醇在調(diào)制、陳化以及燃燒過程中容易發(fā)生氧化和降解，產(chǎn)生多種降解產(chǎn)物，如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而這些降解產(chǎn)物被認為是非常重要的煙草香味成分。西柏烷二萜醇的含量和煙草的品質(zhì)被普遍認為成正相關(guān)關(guān)系。添加有西柏烷二萜醇的卷煙與對照樣相比具有可可香味，余味干凈，吃味豐滿，較高含量的添加可產(chǎn)生輕微的花香韻，較低含量的添加則產(chǎn)生淡薄的粉香韻。鑒于西柏烷二萜醇等煙葉表面化合物的重要性，一些分析方法被開發(fā)出來用于煙葉表面化合物的檢測。其中，氣相色譜應(yīng)用最為廣泛。采用的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）和質(zhì)譜檢測器(MS)。但是-CBD和-CBD是差向異構(gòu)體，需要經(jīng)

4、過衍生化之后才能在色譜柱上分離開，否則，兩種異構(gòu)體會于同一保留時間流出，因此用氣相色譜分離-CBD和-CBD通常需要衍生化處理。目前報道的衍生化方法主要有兩種：第一種是以N,O-bis(trimethyl)trifluoroacetamide (BSTFA)為衍生化試劑，二萜上的活潑氫被三甲基硅取代。第二種是利用丁基硼酸和吡啶于100°C加熱15min衍生化-CBD和-CBD，硼酸的兩個羥基與這兩種西柏烷二萜的兩個羥基脫水反應(yīng)。2004年，結(jié)合國家局科技項目煙草表面重要二萜類物質(zhì)與煙草品質(zhì)特征關(guān)系的研究，鄭州煙草研究院通過三年的研究工作，對煙草表面化合物進行了全面系統(tǒng)的分析，在國內(nèi)首

5、次提取了煙草表面二萜類化合物的純品并采用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定；建立了煙草主要表面化合物的定量分析方法，并對煙草表面物質(zhì)與煙草品質(zhì)特征的關(guān)系進行了研究。在該項目中建立了一種利用GC/MS技術(shù)應(yīng)用于煙草中兩種西柏烷二萜（-CBD和-CBD）分析的BSTFA衍生化分析方法。在該項目研究基礎(chǔ)上，本項目組對分析方法進行進一步優(yōu)化、驗證，建立了一種測定煙葉表面主要致香物質(zhì)前體西柏烷二萜醇的可靠方法。2.實驗2.1.儀器與試劑HP6890/5973 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱： DB-5 MS柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25µm；二氯甲烷（分析純）；二

6、甲基甲酰胺(DMF，分析純）；正十七烷醇，N,O-雙三甲基三氟乙酰胺(BSTFA) (美國Acros Organics 公司，純度98%)、-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，純度97%)、-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，純度95%)。2.2溶液配制2.2.1 內(nèi)標溶液的配制準確稱取約250mg 正十七烷醇到50mL的容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，該溶液為內(nèi)標溶液。2.2.2 -CBD和-CBD標準溶液的配制 分別準確稱量約30mg -CBD和10mg的-CBD置于10mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，該溶液為儲備液。分別準確移取40L、100L 、20

7、0L、400L、800L、1600L的儲備液至10mL棕色容量瓶中，再準確加入200L內(nèi)標儲備液，稀釋至刻度，此六個標準溶液為系列標準溶液。2.2.3 提取溶液配制準確移取2.00mL內(nèi)標儲備溶液至1000mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，得到提取溶液。2.3 樣品處理和分析2.3.1樣品處理準確稱取0.5g 煙末(精確至0.001g)，置于100mL錐形瓶中，加入50mL提取溶液，超聲振蕩10min后，用裝有5g無水硫酸鈉的濾紙濾去煙末。取10mL濾液至濃縮瓶中，在500mba，40的條件下濃縮去除溶劑。加入1000L 1:1 (v/v) BSTFA:DMF，洗滌濃縮瓶器壁，將所得溶液轉(zhuǎn)入

8、色譜瓶。在75水浴中進行衍生化反應(yīng)60min，得到GC/MS分析樣品溶液。2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件進樣口溫度：250；電離方式：EI；離子源溫度：230；傳輸線溫度：280；進樣量：1µL；分流進樣，分流比：10:1；載氣：氦氣，恒流模式，流量1mL/min；程序升溫：初始溫度150，以20/ min的速率升溫至215，再以0.5/ min的速率升至220，最后以10/ min的速率升至290，在290后運行 20min。掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）；選擇離子：內(nèi)標離子m/z=313；萜醇和萜醇離子m/z=169。每個離子的監(jiān)測時間為50ms。3. 結(jié)果與討論3.1 煙草中

9、主要二萜和蔗糖酯的定性由于標準質(zhì)譜庫中沒有衍生后的-CBD和-CBD的標準譜圖，通過與純品的保留時間和MS譜圖比較對煙草樣品中-CBD和-CBD進行定性確認。圖1 -CBD和-CBD衍生后的總離子流圖（1. -CBD 2. -CBD）圖2 煙草樣品的總離子流圖圖1為-CBD和-CBD標準樣品衍生后的總離子流色譜圖，在10.69和11.81min兩處的色譜峰分別是-CBD和-CBD。圖2為煙草樣品的總離子流色譜圖，可以看出煙草樣品在10.69和11.81min處也存在兩個典型的色譜峰。圖3 -CBD標準品(衍生化)質(zhì)譜圖圖4煙草樣品10.7 min處的質(zhì)譜圖圖5 -CBD標準品(衍生化)質(zhì)譜圖圖

10、6 煙草樣品11.8min處的質(zhì)譜圖圖3為-CBD標準品衍生化后的質(zhì)譜圖，圖4為煙草樣品相同保留時間（10.7min）色譜峰的質(zhì)譜圖。由質(zhì)譜圖可以看出，二者的主要碎片離子和相對豐度高度一致，可以認為煙草樣品色譜圖中10.7min處的色譜峰為-CBD的衍生物。同樣，圖5為-CBD標準品衍生化后的質(zhì)譜圖，圖6為煙草樣品相同保留時間（10.8 min）色譜峰的質(zhì)譜圖，二者的主要碎片離子和相對豐度高度一致，可以認為煙草樣品色譜圖中11.8min處的色譜峰為-CBD的衍生物。3.2樣品處理條件優(yōu)化3.2.1 衍生化條件的選擇3.2.1.1衍生化介質(zhì)的選擇 衍生化介質(zhì)是衍生化反應(yīng)的的外部環(huán)境，衍生化介質(zhì)必

11、須要對衍生化試劑和被衍生化物質(zhì)具有良好的溶解性，因此衍生化介質(zhì)的選擇直接關(guān)系到衍生化反應(yīng)的進行。結(jié)合文獻報道，選用二甲基甲酰胺、三氯甲烷和甲苯3種衍生化介質(zhì)進行比較，結(jié)果如表1： 表1 不同衍生化介質(zhì)對衍生化反應(yīng)的影響a目標物三氯甲烷二甲基甲酰胺甲苯-CBD1.031 1.892 0.238 -CBD0.066 0.566 0.062 注：a表中數(shù)據(jù)為目標化合物與內(nèi)標峰面積之比，下同。表1結(jié)果表明，不同的衍生化介質(zhì)對衍生化效果影響較大。在選擇的三種介質(zhì)中，二甲基甲酰胺的衍生化效果要明顯好于三氯甲烷和甲苯。因此，本實驗選二甲基甲酰胺作為衍生化的介質(zhì)。3.2.1.2 衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例的選

12、擇 一般情況下，加入的衍生化試劑的量越大衍生化效果越好。固定衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的總體積為1000L，改變兩者的量得到不同衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的比例。考察了35:15、30:20、25:25和20:30(v/v)對衍生化反應(yīng)的影響，結(jié)果如表2：表2 不同衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的比例(v/v)對衍生化反應(yīng)的影響目標物35:1530:2025:2520:30-CBD1.472 1.490 1.792 1.788 -CBD0.417 0.428 0.526 0.515 由表2可以看出，隨著衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例的減小，衍生化的效果逐漸變好。綜合考慮兩種目標物的衍生化效果，當兩者的比例為25:

13、25時，衍生化效果最好。因此，本實驗選衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例為25:25。3.2.1.3 衍生化溫度的選擇衍生化溫度是影響衍生化反應(yīng)的一個重要因素。衍生化溫度過低，衍生化反應(yīng)速率太慢，反應(yīng)時間過長。衍生化溫度過高，可能會引起衍生化試劑或被衍生化物質(zhì)的分解。分別選45、55、65、75、85、95衍生化溫度進行比較，結(jié)果如表3：表3 不同衍生化溫度對衍生化反應(yīng)的影響目標物455565758595-CBD1.284 1.538 1.7921.821 1.694 1.668 -CBD0.160 0.330 0.5260.540 0.555 0.493 由表3可以看出，隨著衍生化溫度的升高，衍生化

14、效果逐漸變好，當溫度達到75時，衍生化效果最佳。因此本實驗選衍生化溫度定為75。3.2.1.4 衍生化時間的選擇一般情況下，衍生化時間越長衍生化進行越完全，衍生化效果也就越好。選15min、30min、45min、60min和75min衍生化時間進行比較，結(jié)果如表4：表4 不同衍生化時間對反應(yīng)的影響b目標物15min 30min45min60min75min-CBD1.676 1.765 1.890 1.892 1.890 -CBD0.508 0.539 0.574 0.566 0.567 由表4可以看出，衍生化時間對衍生化反應(yīng)影響并不顯著。隨著衍生化時間的增加，衍生化效率緩慢升高。衍生化時間

15、大于60min時，衍生化效果好且趨于穩(wěn)定。因此，本實驗選衍生化時間為60min。3.2.2 前處理條件的選擇3.2.2.1 提取溶劑的選擇選擇二氯甲烷、三氯甲烷和乙腈3種提取溶劑進行煙草樣品二萜醇提取效率比較，結(jié)果如表5：表5 不同提取溶劑的影響目標物乙腈二氯甲烷三氯甲烷-CBD1.016 1.880 1.876 -CBD0.291 0.557 0.390 由表5可以看出，在所選用的3種提取溶劑中，二氯甲烷的提取效果要好于其他2種溶劑。因此，本實驗選擇二氯甲烷作為提取溶劑。3.2.2.2提取溶劑體積的選擇選用20mL、30mL、40mL、50mL和60mL二氯甲烷進行提取效率比較，結(jié)果如表6：

16、表6 不同提取溶劑體積的影響目標物20mL30mL40mL50mL60mL-CBD1.179 1.531 1.562 1.800 1.743 -CBD0.364 0.467 0.482 0.557 0.530 由表6可以看出，隨著提取溶劑增加，提取出的目標物量逐漸增加。提取溶劑超過50mL時達到穩(wěn)定，因此提取溶劑體積確定為50mL。3.2.2.3 提取方式的選擇選用機械振蕩和超聲振蕩兩種提取方式，進行提取效率比較，結(jié)果如表7：表7 不同提取方式的影響目標物機械振蕩超聲振蕩-CBD1.222 1.880 -CBD0.358 0.557 由表7可以看出，超聲振蕩的提取效果要高于機械振蕩。因此，本實

17、驗采用超聲振蕩提取方式。3.2.2.4 提取時間的選擇選用4min、6min、8min、10min和12min進行提取效率比較，結(jié)果如表8： 表8 不同提取時間的影響目標物4min6min8min10min12min-CBD1.4771.6031.8571.8801.893-CBD0.4360.4720.5210.5570.566由表8可以看出，提取時間對大部分目標物提取效率影響不顯著，可能由于二萜醇為煙葉表面物質(zhì)，容易被溶劑提取。綜合考慮各目標物的提取效率，本實驗選擇的提取時間為10min。3.3儲備溶液放置穩(wěn)定性表9 儲備溶液放置穩(wěn)定性（g/mL）目標物0個月1個月2個月3個月-CBD34

18、0.4340.9340.3340.5-CBD39.640.539.340.8為考察儲備溶液的放置穩(wěn)定性，將儲備溶液放置在-20環(huán)境中。每月進行測試，連續(xù)測試3個月，結(jié)果如表9所示。儲備溶液在-20環(huán)境中放置3個月內(nèi)，測試結(jié)果沒有顯著差異。3.4方法評價3.4.1工作曲線與檢測限將系列標準溶液衍生后，進行GC-MS分析。目標化合物定量離子色譜峰的面積與內(nèi)標面積比值與化合物濃度與內(nèi)標濃度比值進行線性回歸分析，得到回歸方程及其相關(guān)參數(shù)。將最低濃度的標準溶液平行測定5次，以所得測定結(jié)果標準偏差的3倍為方法的檢測限，以所得測定結(jié)果標準偏差的10倍為方法的定量限（表10）。結(jié)果表明，在測試范圍內(nèi)，質(zhì)譜檢測

19、器響應(yīng)與目標物的濃度呈良好線性關(guān)系，且檢測限遠低于煙草中目標物的實際含量。表10 分析方法的線性范圍和檢測限化合物濃度范圍（g/mL）回歸方程相關(guān)系數(shù)檢測限(g/g)定量限（g/g）萜醇13.6544.6Y=0.1890x-0.00630.99980.401.34萜醇4.11162.6Y=0.1566x-0.00120.99980.270.903.4.2 方法的重復性 分別采用烤煙、香料煙、白肋煙三種煙葉樣品進行方法的重復性測試，每個樣品測試5次，計算方法相對標準偏差。結(jié)果如表11-表13所示，測定結(jié)果的相對標準偏差在2.0-5.6之間，具有較好的重復性。表11烤煙樣品重復性測試次數(shù)萜醇（g/

20、g）萜醇（g/g）1630.93 189.65 2604.66 170.533 586.44 166.01 4599.65 168.13 5604.30 168.72 平均值605.19172.61 相對標準偏差2.67% 5.6% 表12香料煙樣品重復性測試次數(shù)萜醇（g/g）萜醇（g/g）1474.0513164.49 2488.2906155.11 3 449.7544151.67 4436.9021147.18 5463.2035158.23 平均值454.654158.44 相對標準偏差3.14% 4.22% 表13白肋煙樣品重復性測試次數(shù)萜醇（g/g）萜醇（g/g）11122.60

21、372.5421105.12 366.103 1158.05 379.3541164.63 383.2951091.36 366.72平均值1128.35 373.60相對標準偏差2.85% 2.04% 3.4.3方法的回收率分別采用烤煙、香料煙和白肋煙為樣品，添加三個水平的萜醇標樣，每個水平重復測定3次，計算方法的回收率，結(jié)果見表14。-CBD和-CBD回收率的結(jié)果在91.9%99.9%之間，因此該方法回收率較高。樣品萜醇萜醇添加量（g/g） 回收率添加量（g/g） 回收率204.25 96.1%50.8 91.9%烤煙408.5 97.0%101.6 95.7%817.01 99.7%20

22、3.2 98.0%136.17 99.2%40.64 98.2%香料煙272.34 96.5%81.28 96.1%544.67 96.3%162.56 97.1%白肋煙272.34 94.4%81.28 94.2%544.67 99.6%162.56 97.8%1089.34 99.9%325.12 98.2%3.10 樣品測定結(jié)果應(yīng)用該方法對6個樣品進行了測定，包括4個煙葉樣品：白肋煙1個、香料煙1個、烤煙2個，2個卷煙樣品：烤煙型煙絲樣品1個、混合型煙絲樣品1個。測定結(jié)果見表10：表10樣品測定結(jié)果 （g/g）萜醇萜醇烤煙型卷煙724.27211.45 混合型卷煙480.89137.80

23、 烤煙型煙葉1338.05 79.04 烤煙型煙葉2899.01 212.37 白肋煙煙葉1215.27 413.10 香料煙煙葉159.49 45.95 3.11 不同實驗室之間實驗結(jié)果比較為了驗證本方法在不同實驗室的應(yīng)用情況，本項目組織了6個實驗室采用該方法對不同類型的煙草和卷煙樣品進行了分析測定，每個樣品平行測定5次，樣品測定結(jié)果見表11。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用本標準規(guī)定的方法，不同類型卷煙樣品同樣有良好的測試效果，不同實驗室得到了較為一致的分析結(jié)果。其中，A：白肋煙，B：香料煙，C：烤煙1，D：烤煙2，E：烤煙型煙絲樣品1，F(xiàn)：混合型煙絲樣品。表11 各實驗室測定結(jié)果 (g/支)樣品化合物

24、實驗室平均值SDRSD1#2#3#4#5#6#A-萜醇1215.27 1157.16 1308.98 1220.44 1207.84 1107.84 1202.92 67.63 5.62%-萜醇413.10 385.40 431.71 429.55 402.99 407.32 411.68 17.37 4.22%B-萜醇159.49 135.88 139.63 148.07 153.65 155.88 148.77 9.37 6.30%-萜醇45.95 44.57 46.62 42.32 44.96 43.55 44.66 1.57 3.51%C-萜醇338.05 312.88 317.85

25、319.11 339.08 298.72 320.95 15.45 4.81%-萜醇79.04 80.74 83.38 85.75 86.27 76.85 82.01 3.77 4.60%D-萜醇899.01 892.44 937.00 910.07 845.61 921.61 900.96 31.46 3.49%-萜醇212.37 202.59 222.37 226.17 206.01 220.63 215.02 9.51 4.42%E-萜醇688.27 744.27 676.94 722.57 742.29 716.94 715.21 27.66 3.87%-萜醇211.45 233.61

26、 206.37 216.35 232.62 214.24 219.11 11.36 5.18%F-萜醇480.89 490.83 481.67 450.56 443.49 423.40 461.81 26.60 5.76%-萜醇137.80 153.29 141.51 142.55 154.83 149.05 146.50 6.90 4.71%4. 結(jié)論本項目提出了一套規(guī)范準確的煙草及煙草制品中西柏烷二萜醇的分析方法，該方法設(shè)計合理、穩(wěn)定性和重復性好、準確性和精確性高，可操作性強，易于推廣。附錄 西柏烷二萜醇的提取制備由于沒有商品化西柏烷二萜醇標準品或純品銷售，項目組根據(jù)文獻方法，從煙葉中提取了西柏烷二萜醇。參考的文