煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定

1、煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究報告項目組2012年7月煙草及煙草制品 西柏烷二萜醇的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法1概 述煙葉的吃味品質(zhì)主要受化學(xué)成分、物理性狀等因素影響，其中化學(xué)成分作為物質(zhì)基礎(chǔ)是決定性因素。多年來，煙草化學(xué)家試圖從煙草化學(xué)成分含量及其相互關(guān)系得到評價煙草品質(zhì)的客觀指標(biāo)，如還原糖、總糖、煙堿、總氮、淀粉、石油醚提取物等常規(guī)指標(biāo)。人們對煙葉香味成分和致香前體物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)化學(xué)成分相比，煙草表面物質(zhì)包括二萜、糖酯等組分的含量對煙草香味品質(zhì)具有更重要作用。洗滌去除煙葉表面物質(zhì)后煙葉香味和吃味明顯減弱，同時增加了苦澀味。而將煙葉表面物質(zhì)加回洗滌后的煙

2、葉上，煙葉的香味和吃味即可恢復(fù)。西柏烷二萜醇是煙草表面物質(zhì)的主要成分，文獻報道鮮煙葉中西柏烷二萜醇含量占葉面總脂類物質(zhì)的50%，可占葉鮮重的0.7%。煙草表面含量較高的西柏烷二萜醇的結(jié)構(gòu)如圖1所示，化學(xué)名分別為()-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇()-cembrenediol，() CBD)。CBD和CBD為差向異構(gòu)體，CBD的絕對構(gòu)型為(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇，CBD的絕對構(gòu)型為(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇。圖1 (1)-2, 7, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇 (2)-2, 1

3、7, 11-西柏烷三烯-4, 6-二醇西柏烷二萜醇在調(diào)制、陳化以及燃燒過程中容易發(fā)生氧化和降解，產(chǎn)生多種降解產(chǎn)物，如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而這些降解產(chǎn)物被認為是非常重要的煙草香味成分。西柏烷二萜醇的含量和煙草的品質(zhì)被普遍認為成正相關(guān)關(guān)系。添加有西柏烷二萜醇的卷煙與對照樣相比具有可可香味，余味干凈，吃味豐滿，較高含量的添加可產(chǎn)生輕微的花香韻，較低含量的添加則產(chǎn)生淡薄的粉香韻。鑒于西柏烷二萜醇等煙葉表面化合物的重要性，一些分析方法被開發(fā)出來用于煙葉表面化合物的檢測。其中，氣相色譜應(yīng)用最為廣泛。采用的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）和質(zhì)譜檢測器(MS)。但是-CBD和-CBD是差向異構(gòu)體，需要經(jīng)

4、過衍生化之后才能在色譜柱上分離開，否則，兩種異構(gòu)體會于同一保留時間流出，因此用氣相色譜分離-CBD和-CBD通常需要衍生化處理。目前報道的衍生化方法主要有兩種：第一種是以N,O-bis(trimethyl)trifluoroacetamide (BSTFA)為衍生化試劑，二萜上的活潑氫被三甲基硅取代。第二種是利用丁基硼酸和吡啶于100°C加熱15min衍生化-CBD和-CBD，硼酸的兩個羥基與這兩種西柏烷二萜的兩個羥基脫水反應(yīng)。2004年，結(jié)合國家局科技項目煙草表面重要二萜類物質(zhì)與煙草品質(zhì)特征關(guān)系的研究，鄭州煙草研究院通過三年的研究工作，對煙草表面化合物進行了全面系統(tǒng)的分析，在國內(nèi)首

5、次提取了煙草表面二萜類化合物的純品并采用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進行了鑒定；建立了煙草主要表面化合物的定量分析方法，并對煙草表面物質(zhì)與煙草品質(zhì)特征的關(guān)系進行了研究。在該項目中建立了一種利用GC/MS技術(shù)應(yīng)用于煙草中兩種西柏烷二萜（-CBD和-CBD）分析的BSTFA衍生化分析方法。在該項目研究基礎(chǔ)上，本項目組對分析方法進行進一步優(yōu)化、驗證，建立了一種測定煙葉表面主要致香物質(zhì)前體西柏烷二萜醇的可靠方法。2.實驗2.1.儀器與試劑HP6890/5973 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱： DB-5 MS柱，規(guī)格為30m×0.25mm×0.25µm；二氯甲烷（分析純）；二

6、甲基甲酰胺(DMF，分析純）；正十七烷醇，N,O-雙三甲基三氟乙酰胺(BSTFA) (美國Acros Organics 公司，純度98%)、-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，純度97%)、-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，純度95%)。2.2溶液配制2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制準確稱取約250mg 正十七烷醇到50mL的容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，該溶液為內(nèi)標(biāo)溶液。2.2.2 -CBD和-CBD標(biāo)準溶液的配制 分別準確稱量約30mg -CBD和10mg的-CBD置于10mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，該溶液為儲備液。分別準確移取40L、100L 、20

7、0L、400L、800L、1600L的儲備液至10mL棕色容量瓶中，再準確加入200L內(nèi)標(biāo)儲備液，稀釋至刻度，此六個標(biāo)準溶液為系列標(biāo)準溶液。2.2.3 提取溶液配制準確移取2.00mL內(nèi)標(biāo)儲備溶液至1000mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋至刻度，得到提取溶液。2.3 樣品處理和分析2.3.1樣品處理準確稱取0.5g 煙末(精確至0.001g)，置于100mL錐形瓶中，加入50mL提取溶液，超聲振蕩10min后，用裝有5g無水硫酸鈉的濾紙濾去煙末。取10mL濾液至濃縮瓶中，在500mba，40的條件下濃縮去除溶劑。加入1000L 1:1 (v/v) BSTFA:DMF，洗滌濃縮瓶器壁，將所得溶液轉(zhuǎn)入

8、色譜瓶。在75水浴中進行衍生化反應(yīng)60min，得到GC/MS分析樣品溶液。2.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件進樣口溫度：250；電離方式：EI；離子源溫度：230；傳輸線溫度：280；進樣量：1µL；分流進樣，分流比：10:1；載氣：氦氣，恒流模式，流量1mL/min；程序升溫：初始溫度150，以20/ min的速率升溫至215，再以0.5/ min的速率升至220，最后以10/ min的速率升至290，在290后運行 20min。掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）；選擇離子：內(nèi)標(biāo)離子m/z=313；萜醇和萜醇離子m/z=169。每個離子的監(jiān)測時間為50ms。3. 結(jié)果與討論3.1 煙草中

9、主要二萜和蔗糖酯的定性由于標(biāo)準質(zhì)譜庫中沒有衍生后的-CBD和-CBD的標(biāo)準譜圖，通過與純品的保留時間和MS譜圖比較對煙草樣品中-CBD和-CBD進行定性確認。圖1 -CBD和-CBD衍生后的總離子流圖（1. -CBD 2. -CBD）圖2 煙草樣品的總離子流圖圖1為-CBD和-CBD標(biāo)準樣品衍生后的總離子流色譜圖，在10.69和11.81min兩處的色譜峰分別是-CBD和-CBD。圖2為煙草樣品的總離子流色譜圖，可以看出煙草樣品在10.69和11.81min處也存在兩個典型的色譜峰。圖3 -CBD標(biāo)準品(衍生化)質(zhì)譜圖圖4煙草樣品10.7 min處的質(zhì)譜圖圖5 -CBD標(biāo)準品(衍生化)質(zhì)譜圖圖

10、6 煙草樣品11.8min處的質(zhì)譜圖圖3為-CBD標(biāo)準品衍生化后的質(zhì)譜圖，圖4為煙草樣品相同保留時間（10.7min）色譜峰的質(zhì)譜圖。由質(zhì)譜圖可以看出，二者的主要碎片離子和相對豐度高度一致，可以認為煙草樣品色譜圖中10.7min處的色譜峰為-CBD的衍生物。同樣，圖5為-CBD標(biāo)準品衍生化后的質(zhì)譜圖，圖6為煙草樣品相同保留時間（10.8 min）色譜峰的質(zhì)譜圖，二者的主要碎片離子和相對豐度高度一致，可以認為煙草樣品色譜圖中11.8min處的色譜峰為-CBD的衍生物。3.2樣品處理條件優(yōu)化3.2.1 衍生化條件的選擇3.2.1.1衍生化介質(zhì)的選擇 衍生化介質(zhì)是衍生化反應(yīng)的的外部環(huán)境，衍生化介質(zhì)必

11、須要對衍生化試劑和被衍生化物質(zhì)具有良好的溶解性，因此衍生化介質(zhì)的選擇直接關(guān)系到衍生化反應(yīng)的進行。結(jié)合文獻報道，選用二甲基甲酰胺、三氯甲烷和甲苯3種衍生化介質(zhì)進行比較，結(jié)果如表1： 表1 不同衍生化介質(zhì)對衍生化反應(yīng)的影響a目標(biāo)物三氯甲烷二甲基甲酰胺甲苯-CBD1.031 1.892 0.238 -CBD0.066 0.566 0.062 注：a表中數(shù)據(jù)為目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，下同。表1結(jié)果表明，不同的衍生化介質(zhì)對衍生化效果影響較大。在選擇的三種介質(zhì)中，二甲基甲酰胺的衍生化效果要明顯好于三氯甲烷和甲苯。因此，本實驗選二甲基甲酰胺作為衍生化的介質(zhì)。3.2.1.2 衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例的選

12、擇 一般情況下，加入的衍生化試劑的量越大衍生化效果越好。固定衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的總體積為1000L，改變兩者的量得到不同衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的比例?？疾炝?5:15、30:20、25:25和20:30(v/v)對衍生化反應(yīng)的影響，結(jié)果如表2：表2 不同衍生化介質(zhì)與衍生化試劑的比例(v/v)對衍生化反應(yīng)的影響目標(biāo)物35:1530:2025:2520:30-CBD1.472 1.490 1.792 1.788 -CBD0.417 0.428 0.526 0.515 由表2可以看出，隨著衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例的減小，衍生化的效果逐漸變好。綜合考慮兩種目標(biāo)物的衍生化效果，當(dāng)兩者的比例為25:

13、25時，衍生化效果最好。因此，本實驗選衍生化介質(zhì)與衍生化試劑比例為25:25。3.2.1.3 衍生化溫度的選擇衍生化溫度是影響衍生化反應(yīng)的一個重要因素。衍生化溫度過低，衍生化反應(yīng)速率太慢，反應(yīng)時間過長。衍生化溫度過高，可能會引起衍生化試劑或被衍生化物質(zhì)的分解。分別選45、55、65、75、85、95衍生化溫度進行比較，結(jié)果如表3：表3 不同衍生化溫度對衍生化反應(yīng)的影響目標(biāo)物455565758595-CBD1.284 1.538 1.7921.821 1.694 1.668 -CBD0.160 0.330 0.5260.540 0.555 0.493 由表3可以看出，隨著衍生化溫度的升高，衍生化

14、效果逐漸變好，當(dāng)溫度達到75時，衍生化效果最佳。因此本實驗選衍生化溫度定為75。3.2.1.4 衍生化時間的選擇一般情況下，衍生化時間越長衍生化進行越完全，衍生化效果也就越好。選15min、30min、45min、60min和75min衍生化時間進行比較，結(jié)果如表4：表4 不同衍生化時間對反應(yīng)的影響b目標(biāo)物15min 30min45min60min75min-CBD1.676 1.765 1.890 1.892 1.890 -CBD0.508 0.539 0.574 0.566 0.567 由表4可以看出，衍生化時間對衍生化反應(yīng)影響并不顯著。隨著衍生化時間的增加，衍生化效率緩慢升高。衍生化時間

15、大于60min時，衍生化效果好且趨于穩(wěn)定。因此，本實驗選衍生化時間為60min。3.2.2 前處理條件的選擇3.2.2.1 提取溶劑的選擇選擇二氯甲烷、三氯甲烷和乙腈3種提取溶劑進行煙草樣品二萜醇提取效率比較，結(jié)果如表5：表5 不同提取溶劑的影響目標(biāo)物乙腈二氯甲烷三氯甲烷-CBD1.016 1.880 1.876 -CBD0.291 0.557 0.390 由表5可以看出，在所選用的3種提取溶劑中，二氯甲烷的提取效果要好于其他2種溶劑。因此，本實驗選擇二氯甲烷作為提取溶劑。3.2.2.2提取溶劑體積的選擇選用20mL、30mL、40mL、50mL和60mL二氯甲烷進行提取效率比較，結(jié)果如表6：

16、表6 不同提取溶劑體積的影響目標(biāo)物20mL30mL40mL50mL60mL-CBD1.179 1.531 1.562 1.800 1.743 -CBD0.364 0.467 0.482 0.557 0.530 由表6可以看出，隨著提取溶劑增加，提取出的目標(biāo)物量逐漸增加。提取溶劑超過50mL時達到穩(wěn)定，因此提取溶劑體積確定為50mL。3.2.2.3 提取方式的選擇選用機械振蕩和超聲振蕩兩種提取方式，進行提取效率比較，結(jié)果如表7：表7 不同提取方式的影響目標(biāo)物機械振蕩超聲振蕩-CBD1.222 1.880 -CBD0.358 0.557 由表7可以看出，超聲振蕩的提取效果要高于機械振蕩。因此，本實

17、驗采用超聲振蕩提取方式。3.2.2.4 提取時間的選擇選用4min、6min、8min、10min和12min進行提取效率比較，結(jié)果如表8： 表8 不同提取時間的影響目標(biāo)物4min6min8min10min12min-CBD1.4771.6031.8571.8801.893-CBD0.4360.4720.5210.5570.566由表8可以看出，提取時間對大部分目標(biāo)物提取效率影響不顯著，可能由于二萜醇為煙葉表面物質(zhì)，容易被溶劑提取。綜合考慮各目標(biāo)物的提取效率，本實驗選擇的提取時間為10min。3.3儲備溶液放置穩(wěn)定性表9 儲備溶液放置穩(wěn)定性（g/mL）目標(biāo)物0個月1個月2個月3個月-CBD34

18、0.4340.9340.3340.5-CBD39.640.539.340.8為考察儲備溶液的放置穩(wěn)定性，將儲備溶液放置在-20環(huán)境中。每月進行測試，連續(xù)測試3個月，結(jié)果如表9所示。儲備溶液在-20環(huán)境中放置3個月內(nèi)，測試結(jié)果沒有顯著差異。3.4方法評價3.4.1工作曲線與檢測限將系列標(biāo)準溶液衍生后，進行GC-MS分析。目標(biāo)化合物定量離子色譜峰的面積與內(nèi)標(biāo)面積比值與化合物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比值進行線性回歸分析，得到回歸方程及其相關(guān)參數(shù)。將最低濃度的標(biāo)準溶液平行測定5次，以所得測定結(jié)果標(biāo)準偏差的3倍為方法的檢測限，以所得測定結(jié)果標(biāo)準偏差的10倍為方法的定量限（表10）。結(jié)果表明，在測試范圍內(nèi)，質(zhì)譜檢測

19、器響應(yīng)與目標(biāo)物的濃度呈良好線性關(guān)系，且檢測限遠低于煙草中目標(biāo)物的實際含量。表10 分析方法的線性范圍和檢測限化合物濃度范圍（g/mL）回歸方程相關(guān)系數(shù)檢測限(g/g)定量限（g/g）萜醇13.6544.6Y=0.1890x-0.00630.99980.401.34萜醇4.11162.6Y=0.1566x-0.00120.99980.270.903.4.2 方法的重復(fù)性 分別采用烤煙、香料煙、白肋煙三種煙葉樣品進行方法的重復(fù)性測試，每個樣品測試5次，計算方法相對標(biāo)準偏差。結(jié)果如表11-表13所示，測定結(jié)果的相對標(biāo)準偏差在2.0-5.6之間，具有較好的重復(fù)性。表11烤煙樣品重復(fù)性測試次數(shù)萜醇（g/

20、g）萜醇（g/g）1630.93 189.65 2604.66 170.533 586.44 166.01 4599.65 168.13 5604.30 168.72 平均值605.19172.61 相對標(biāo)準偏差2.67% 5.6% 表12香料煙樣品重復(fù)性測試次數(shù)萜醇（g/g）萜醇（g/g）1474.0513164.49 2488.2906155.11 3 449.7544151.67 4436.9021147.18 5463.2035158.23 平均值454.654158.44 相對標(biāo)準偏差3.14% 4.22% 表13白肋煙樣品重復(fù)性測試次數(shù)萜醇（g/g）萜醇（g/g）11122.60

21、372.5421105.12 366.103 1158.05 379.3541164.63 383.2951091.36 366.72平均值1128.35 373.60相對標(biāo)準偏差2.85% 2.04% 3.4.3方法的回收率分別采用烤煙、香料煙和白肋煙為樣品，添加三個水平的萜醇標(biāo)樣，每個水平重復(fù)測定3次，計算方法的回收率，結(jié)果見表14。-CBD和-CBD回收率的結(jié)果在91.9%99.9%之間，因此該方法回收率較高。樣品萜醇萜醇添加量（g/g） 回收率添加量（g/g） 回收率204.25 96.1%50.8 91.9%烤煙408.5 97.0%101.6 95.7%817.01 99.7%20

22、3.2 98.0%136.17 99.2%40.64 98.2%香料煙272.34 96.5%81.28 96.1%544.67 96.3%162.56 97.1%白肋煙272.34 94.4%81.28 94.2%544.67 99.6%162.56 97.8%1089.34 99.9%325.12 98.2%3.10 樣品測定結(jié)果應(yīng)用該方法對6個樣品進行了測定，包括4個煙葉樣品：白肋煙1個、香料煙1個、烤煙2個，2個卷煙樣品：烤煙型煙絲樣品1個、混合型煙絲樣品1個。測定結(jié)果見表10：表10樣品測定結(jié)果 （g/g）萜醇萜醇烤煙型卷煙724.27211.45 混合型卷煙480.89137.80

23、 烤煙型煙葉1338.05 79.04 烤煙型煙葉2899.01 212.37 白肋煙煙葉1215.27 413.10 香料煙煙葉159.49 45.95 3.11 不同實驗室之間實驗結(jié)果比較為了驗證本方法在不同實驗室的應(yīng)用情況，本項目組織了6個實驗室采用該方法對不同類型的煙草和卷煙樣品進行了分析測定，每個樣品平行測定5次，樣品測定結(jié)果見表11。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用本標(biāo)準規(guī)定的方法，不同類型卷煙樣品同樣有良好的測試效果，不同實驗室得到了較為一致的分析結(jié)果。其中，A：白肋煙，B：香料煙，C：烤煙1，D：烤煙2，E：烤煙型煙絲樣品1，F(xiàn)：混合型煙絲樣品。表11 各實驗室測定結(jié)果 (g/支)樣品化合物

24、實驗室平均值SDRSD1#2#3#4#5#6#A-萜醇1215.27 1157.16 1308.98 1220.44 1207.84 1107.84 1202.92 67.63 5.62%-萜醇413.10 385.40 431.71 429.55 402.99 407.32 411.68 17.37 4.22%B-萜醇159.49 135.88 139.63 148.07 153.65 155.88 148.77 9.37 6.30%-萜醇45.95 44.57 46.62 42.32 44.96 43.55 44.66 1.57 3.51%C-萜醇338.05 312.88 317.85

25、319.11 339.08 298.72 320.95 15.45 4.81%-萜醇79.04 80.74 83.38 85.75 86.27 76.85 82.01 3.77 4.60%D-萜醇899.01 892.44 937.00 910.07 845.61 921.61 900.96 31.46 3.49%-萜醇212.37 202.59 222.37 226.17 206.01 220.63 215.02 9.51 4.42%E-萜醇688.27 744.27 676.94 722.57 742.29 716.94 715.21 27.66 3.87%-萜醇211.45 233.61

26、 206.37 216.35 232.62 214.24 219.11 11.36 5.18%F-萜醇480.89 490.83 481.67 450.56 443.49 423.40 461.81 26.60 5.76%-萜醇137.80 153.29 141.51 142.55 154.83 149.05 146.50 6.90 4.71%4. 結(jié)論本項目提出了一套規(guī)范準確的煙草及煙草制品中西柏烷二萜醇的分析方法，該方法設(shè)計合理、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、準確性和精確性高，可操作性強，易于推廣。附錄 西柏烷二萜醇的提取制備由于沒有商品化西柏烷二萜醇標(biāo)準品或純品銷售，項目組根據(jù)文獻方法，從煙葉中提取了西柏烷二萜醇。參考的文