GFP成像研究植物細(xì)胞區(qū)室化的方法與應(yīng)用

1、GFP成像：研究植物細(xì)胞區(qū)室化的方法與應(yīng)用摘要水母gfp（綠色熒光蛋白）基因的克隆，以及它在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞定位表達(dá)的改進(jìn)，已經(jīng)給細(xì)胞內(nèi)組織學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析帶來(lái)新的觀念。 GFP與已知或非已知的完整蛋白的融合體顯示出這些蛋白的定位，以及它們是否從一個(gè)區(qū)室轉(zhuǎn)移到另一個(gè)中去。 研究者審慎地將GFP與其具有不同光譜性質(zhì)的變異體定于不同的區(qū)室中，分析它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中或是響應(yīng)環(huán)境變化時(shí)大小、形狀、流動(dòng)性及動(dòng)態(tài)的變化。 GFP變異體間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能夠辨別蛋白與蛋白之間是否結(jié)合。 GFP還被用作傳感蛋白，去檢測(cè)鈣離子、pH、電壓、金屬離子及酶活性的變化或區(qū)分。GFP的光漂白、光激活，與

2、熒光相關(guān)光譜學(xué)的結(jié)合能測(cè)量GFP在區(qū)室內(nèi)或區(qū)室間的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)的快慢。 這份評(píng)論涵蓋了過(guò)去這些方法的應(yīng)用，以及GFP成像在理解植物細(xì)胞的功能結(jié)構(gòu)上的潛力發(fā)展。關(guān)鍵詞綠色熒光蛋白 顯微（鏡檢）術(shù) 細(xì)胞器 定位 光漂白 質(zhì)體小管 共聚焦顯微術(shù)介紹綠色熒光蛋白基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù)誕生，使十年前不敢想象的很多實(shí)驗(yàn)變成了現(xiàn)實(shí)。 在很多應(yīng)用中，人們可以有了新的探究途徑去了解細(xì)胞活動(dòng)的組織結(jié)構(gòu)。 這份評(píng)論將著重于GFP表達(dá)和成像方法，它們?cè)诶斫庵参锛?xì)胞內(nèi)的區(qū)室化上已經(jīng)并將繼續(xù)提供前沿動(dòng)力，而那些關(guān)于如何使用特別的熒光，共聚焦激光掃描及多光子顯微術(shù)去觀察GFP衍生的熒光蛋白，則不在此累贅了。 不過(guò)可以在后面一

3、些引用文獻(xiàn)中找到，我將簡(jiǎn)要地介紹一下現(xiàn)有GFP成像新應(yīng)用的研究，而闡明可行的實(shí)驗(yàn)。 目前而言，GFP成像在動(dòng)物和真菌細(xì)胞中的成功運(yùn)用要多于植物細(xì)胞，部分是因?yàn)樵缙诖嬖谟谌绾卧谥参镏惺褂盟窯FP的問(wèn)題。 這個(gè)初始的動(dòng)物基因含有在植物中會(huì)被錯(cuò)誤識(shí)別為內(nèi)含子的序列，導(dǎo)致了很低的表達(dá)水平。 當(dāng)出現(xiàn)修飾型的、熱穩(wěn)定的、高亮度熒光的GFP之后，其產(chǎn)量與分布已經(jīng)帶動(dòng)了許多植物系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)對(duì)表達(dá)與哺乳動(dòng)物及其它生物體的GFP進(jìn)行重新編碼，可以得到適用于維管植物的新基因。 但是密碼子的改變經(jīng)常會(huì)破壞隱秘剪接位點(diǎn)，因而只是有些，而并非全部帶有改變了的光譜特性的新GFP變種可以不經(jīng)進(jìn)一步修正就可以在植物中發(fā)揮

4、功能。 許多不同的GFP變異體在一系列評(píng)論和文章中討論過(guò)，就不在這里重復(fù)了。無(wú)論怎樣，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，如何選擇一個(gè)帶有正確特性的植物表達(dá)GFP變異體，很明顯是一個(gè)關(guān)鍵的抉擇。 GFP作為一個(gè)熒光探針，最主要的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要外源的共激活因子。 GFP可以在整個(gè)組織中表達(dá)，并且在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中都不受引入外界試劑的干擾。 由于許多對(duì)動(dòng)物細(xì)胞所采納的染色和染料不能滲透入植物細(xì)胞，GFP技術(shù)可能最終成為植物細(xì)胞生物學(xué)而非動(dòng)物的重要推動(dòng)力。研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位為了理解植物細(xì)胞是如何有功能地組織起來(lái)，就有必要知道在發(fā)育過(guò)程中，和受到特定環(huán)境條件的影響下，特定時(shí)間下，特定植物細(xì)胞內(nèi)，酶和調(diào)節(jié)蛋白在何處定位。

5、一個(gè)特定酶的定位對(duì)于理解細(xì)胞內(nèi)新陳代謝的區(qū)室化是個(gè)關(guān)鍵的信號(hào)。 區(qū)室阻止特定蛋白、離子和復(fù)合物的進(jìn)入，以杜絕不需要的反應(yīng)，同時(shí)匯集酶反應(yīng)過(guò)程中的參與物以易化細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)。 一系列已知的例子驗(yàn)證了，在一個(gè)特定反應(yīng)中酶與底物共處一個(gè)區(qū)室，而其產(chǎn)物又在另一個(gè)區(qū)室中被使用。 這就提出了問(wèn)題，產(chǎn)物與底物是如何從一個(gè)區(qū)室運(yùn)輸?shù)搅硪粋€(gè)來(lái)完成一個(gè)代謝途徑。 植物細(xì)胞也包含有許多亞細(xì)胞定位還未知的酶，進(jìn)一步地說(shuō)，通過(guò)基因組“蠻干”的測(cè)序，而得到的參與酶反應(yīng)的未知酶，如果不能知道它的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室定位，則可能不能被很好地理解。 通過(guò)目前計(jì)算機(jī)的方法從DNA序列中預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)定位，雖然又用，但不是結(jié)論性的。另外，一些

6、植物蛋白也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)定位于超過(guò)一處的地方。 細(xì)胞器的分離及蛋白的純化，在闡明細(xì)胞內(nèi)定位上常存在技術(shù)上的難關(guān)。而在組織切片中去免疫檢測(cè)一個(gè)蛋白，其抗體的制備又費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而，將GFP的編碼序列融合到未知定位基因地編碼序列，對(duì)于決定在植物細(xì)胞內(nèi)一個(gè)蛋白，同時(shí)也是一個(gè)生化的、調(diào)節(jié)過(guò)程的位置，已經(jīng)成為一種及其有用的方法。 GFP編碼序列可以融合道目的基因的編碼序列的5端或3端，翻譯形成N端或C端的融合GFP。 這種融合基因已經(jīng)被摻入到穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因植物，或是導(dǎo)入植物細(xì)胞用于瞬間表達(dá)。穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物的獲得，可以檢測(cè)多種不同的表達(dá)GFP融合蛋白的細(xì)胞種類。這種優(yōu)勢(shì)的體現(xiàn)，在于技術(shù)上并非所有的細(xì)胞種類

7、都適用于瞬間表達(dá)。 另外，由于DNA摻入常常引起損傷，基因引入數(shù)量以及GFP在瞬間表達(dá)中轉(zhuǎn)錄都有不確定性，因此，有時(shí)候分析健康的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體比起由于DNA摻入而受到影響的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，要更有說(shuō)服力。 當(dāng)然，瞬間表達(dá)由于快速簡(jiǎn)單，是一種非常有用的工具，尤其是在投入時(shí)間去獲得轉(zhuǎn)化體之前。 洋蔥表皮，有著極其例外的清晰細(xì)胞質(zhì)，及單層活細(xì)胞，是瞬間實(shí)驗(yàn)中非常有用的材料。 通過(guò)各種構(gòu)建體的粒子轟擊，細(xì)胞壁、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、核以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)都可以被不同瞬間表達(dá)GFP融合體標(biāo)記。 由于GFP體積小，可以進(jìn)入核孔，因此沒有融合其它多肽時(shí)，GFP在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核中都有發(fā)現(xiàn)（圖1A）。 由于融合一些植物基

8、因序列后發(fā)現(xiàn)僅在核內(nèi)有GFP熒光，可以得出結(jié)論，融合的那些序列編碼核定位蛋白。 在定位于核內(nèi)的GFP-植物蛋白融合體中，有cryptochrome CRY2，一種藍(lán)光光感受器，以及ROOT HAIRLESS 1基因，它對(duì)初生根根毛的形成及幼苗的生存有作用。 GFP和一種geminivirus運(yùn)動(dòng)蛋白的融合揭示了它是一種核穿梭蛋白。 融合其它未知定位的蛋白，已經(jīng)揭示了它們?cè)谫|(zhì)體、線粒體或是細(xì)胞液的區(qū)室分布。 一種具有香葉基香葉基雙磷酸合成酶活性的蛋白，及一種NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶，被顯示定位于線粒體中。 噬菌體形RNA多聚酶類似物基因的融合體顯示一個(gè)是定位于線粒體，而另一個(gè)被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體。

9、 通過(guò)融合可能的定位信號(hào)到GFP上，三個(gè)核內(nèi)編碼的RNA多聚酶因子都顯示定位于質(zhì)體中。 擬南芥中三個(gè)不同編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆基于GFP融合蛋白定位，被定位于三個(gè)不同的區(qū)室細(xì)胞液、葉綠體和線粒體。 GFP融合體也驗(yàn)證兩個(gè)正式被發(fā)現(xiàn)于葉綠體中的蛋白：擬南芥PALE CRESS核基因產(chǎn)物，用于正常的葉綠體發(fā)育，和AST82，一種硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。 GFP融合在判斷未知cDNA編碼蛋白亞細(xì)胞定位的成功，引發(fā)了一種命名為“基序羅網(wǎng)”方法的發(fā)展。先將隨意的DNA片段融合到gfp，然后分離各種在不同亞細(xì)胞區(qū)室表達(dá)GFP的細(xì)胞，最后用RT-PCR克隆出表達(dá)的DNA片段。 GFP融合體還可以被用于發(fā)現(xiàn)植

10、物細(xì)胞在環(huán)境刺激下或是發(fā)育途徑中，一個(gè)蛋白是不是從一個(gè)定位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)定位。 phyA和phyB是光感受器的光敏色素家族成員。 GFP被融合到其編碼序列上，通過(guò)激發(fā)紅光，phyA和phyB被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；紅外線處理，能抑制紅光造成的光形態(tài)應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)phyB而非phyA，由紅光引發(fā)的運(yùn)動(dòng)被抑制了。 類似的，通過(guò)與GFP融合，歐芹bZIP轉(zhuǎn)錄因子CPRF2的運(yùn)動(dòng)也顯示受到光敏色素的調(diào)控。 GFP還被用于研究植物中核輸出途徑及胞間連絲間蛋白的穿梭。 GFP融合在判斷一個(gè)蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位上并不是一種完全正確無(wú)誤的方法。 由于GFP與酶的融合常常不會(huì)抑制酶的活性，因而GFP普遍被認(rèn)為是無(wú)害的標(biāo)記。 然而，

11、一些證據(jù)表明在特定區(qū)域的高表達(dá)有損于細(xì)胞。 例如，Haseloff等發(fā)現(xiàn)，除非GFP被隔留在ER中，否則很難拿到高熒光轉(zhuǎn)基因植物株系。 雖然絕大多數(shù)在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)GFP的報(bào)道說(shuō)明GFP表達(dá)沒有毒性，但有害性有時(shí)仍然被發(fā)現(xiàn)。此外，在特定情況下，GFP/蛋白的融合蛋白與野生型蛋白在亞細(xì)胞定位仍有可能有區(qū)別。 GFP的存在可能會(huì)掩蓋住融合蛋白上穿梭序列編碼的潛在定位信號(hào)。 盡管大多數(shù)真菌與植物的線粒體研究表明，含有定位于線粒體的穿梭序列的信號(hào)蛋白有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到目的細(xì)胞器， 但錯(cuò)例仍有時(shí)發(fā)生。 相反，如果GFP融合造成融合蛋白的構(gòu)型發(fā)生變化，原本在沒有GFP時(shí)或是缺乏某些內(nèi)源配基時(shí)應(yīng)該被掩蓋住的定位信

12、號(hào)，會(huì)被激活。 另一個(gè)問(wèn)題是，融合目的基因序列與gfp可能導(dǎo)致不正常折疊或是編碼的融合GFP不穩(wěn)定，因而很難檢測(cè)到熒光。在正規(guī)文獻(xiàn)中這種陰性結(jié)果很少提起，但私底下一些研究者碰到過(guò)獲取不到高亮度熒光蛋白的問(wèn)題。融合蛋白N端的正確折疊被顯示會(huì)影響GFP的C端的折疊水平。例如，麥芽糖結(jié)合蛋白的信號(hào)序列與GFP的融合在大腸桿菌中非正常折疊，而且缺失熒光。GFP標(biāo)記區(qū)室 GFP與穿梭序列或是完整蛋白的融合體不僅可以判斷特殊分子的定位，還可以用于商討標(biāo)記精細(xì)的區(qū)室。這些實(shí)驗(yàn)的目的可能是為了研究關(guān)于一個(gè)或多個(gè)區(qū)室的數(shù)量、大小、形狀、運(yùn)動(dòng)性、與其它細(xì)胞器的結(jié)合，以及觀察在發(fā)育過(guò)程中或是環(huán)境應(yīng)答的情況下動(dòng)態(tài)的變

13、化。GFP定位已經(jīng)幫助人們觀察到以前不可能觀察到的植物細(xì)胞內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)（圖1、2）。 一些研究者有意地去標(biāo)記核來(lái)研究區(qū)室。 Chytilova等人設(shè)計(jì)了含有一個(gè)NLS的GFP/GUS融合體的融合基因，用于獲得有標(biāo)記的核的轉(zhuǎn)基因植物，后者可以用于研究在細(xì)胞周期中核的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)。 通過(guò)融合GUS，增大了GFP蛋白的大小，造成了GFP在核的滯留。 從SV40中獲得的核定位信號(hào)（NLS）融合于GFP上， 可以獲得綠色熒光核的轉(zhuǎn)基因植物（圖1B），但這種較小的GFP融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中仍然可以觀測(cè)得到。在植物細(xì)胞中，其它的區(qū)室也已經(jīng)被標(biāo)記，液泡, 過(guò)氧化物酶體, 高爾基體，線粒體（圖1C，2D），質(zhì)體（圖

14、2A，3），細(xì)胞骨架，質(zhì)膜，細(xì)胞壁和ER（圖1D，2C）。 用GFP融合體去標(biāo)記確定某些細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如核和細(xì)胞壁，能通過(guò)和細(xì)胞的光顯微圖像比較而得到確定。而其它熒光顯現(xiàn)出的細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)的確定則并不總是很明顯，當(dāng)然，需要實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。一個(gè)常用的方法是，用一種特殊的化學(xué)染料標(biāo)記一種容易標(biāo)記的細(xì)胞種類，再用標(biāo)記后的圖像與綠色熒光的圖像進(jìn)行比較。 舉例來(lái)說(shuō)，用線粒體特殊的熒光染料可以驗(yàn)證線粒體的特殊標(biāo)記，GFP和葉綠素自發(fā)熒光的紅色信號(hào)的共定位可以確定葉綠素的定位。 GFP標(biāo)記的另一種細(xì)胞內(nèi)的“區(qū)室”則是植物病毒。激發(fā)熒光的病毒穿越胞間連絲，從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，這種觀察對(duì)理解病毒的增殖與傳播提供了

15、新的途徑。進(jìn)一步而言，GFP可以用于標(biāo)記病毒蛋白，如運(yùn)動(dòng)蛋白，觀察病毒編碼的蛋白如何與細(xì)胞內(nèi)的組織結(jié)合。這一方面的更多內(nèi)容可以在近期的文章中找到。 然而，絕大多數(shù)亞細(xì)胞區(qū)室的標(biāo)記必須通過(guò)引入融合gfp基因至核內(nèi)，并須經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)移至所需的場(chǎng)所。由于一些物種的質(zhì)體染色體可以轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)了一種可行的選擇方法。 GFP編碼區(qū)通過(guò)分子轟擊引入煙草或馬鈴薯的葉綠體，或通過(guò)原生質(zhì)體DNA吸收，而得到含有高亮度熒光質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因植物（圖3）。 Khan和Maliga將GFP編碼區(qū)融合一種抗生素抗性選擇標(biāo)記到一種葉綠體DNA轉(zhuǎn)化載體，報(bào)道說(shuō)得到有熒光質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因植物。GFP也可以通過(guò)分子轟擊或是葉綠體微注射在葉綠體中

16、瞬間表達(dá)。 除了辨別正常植物細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的特征，區(qū)室的標(biāo)記在分析由于突變或是病理攻擊而造成的細(xì)胞功能損傷時(shí)非常有用。 例如，帶有GFP標(biāo)記ER的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，可以用于觀察ER在遭受煙草鑲嵌病毒或是豇豆鑲嵌病毒的感染后引起的變化。質(zhì)體的GFP標(biāo)記在細(xì)查葉綠素缺失的突變體植物中應(yīng)該是相當(dāng)有幫助，因?yàn)橛霉鈱W(xué)顯微鏡是很難觀察不正常的質(zhì)體。 在植物系統(tǒng)中，區(qū)室標(biāo)記需要進(jìn)一步研究的另一應(yīng)用是，標(biāo)記區(qū)室以利于它們的分離。Galbraith等證明了GFP標(biāo)記的核可以用流動(dòng)分類的方法從細(xì)胞沉淀物中得到分離。 用GFP熒光作為一種分子標(biāo)記來(lái)分離GFP標(biāo)記，而用傳統(tǒng)方法又無(wú)法輕易分離的細(xì)胞器和區(qū)室，也將是一件可能的

17、事。多個(gè)區(qū)室的熒光標(biāo)記 許多生物合成及代謝過(guò)程需要不同的細(xì)胞器或是區(qū)室共同作用。 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的排列位置可以影響擴(kuò)散效率，因而，在發(fā)育過(guò)程或是環(huán)境應(yīng)答中區(qū)室間距離與聯(lián)系發(fā)生了改變，可能會(huì)對(duì)功能發(fā)生很大的影響。 觀察區(qū)室位置與運(yùn)動(dòng)的變化，可以用信號(hào)互不相同的熒光探針去標(biāo)記。 一些植物區(qū)室和結(jié)構(gòu)在自然狀態(tài)下存在自發(fā)熒光，其波長(zhǎng)不同于GFP的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)，從而可以同時(shí)觀察到GFP標(biāo)記結(jié)構(gòu)與自發(fā)熒光物體。 至今，自發(fā)熒光與GFP的結(jié)合使用已被主要地用于觀察紅色熒光的葉綠體與GFP標(biāo)記的線粒體、核或ER。（圖1） 關(guān)于用GFP變異體雙標(biāo)記細(xì)胞，只有一些報(bào)道，但接下來(lái)的幾年，這種方法的成功應(yīng)用會(huì)增加得很快

18、。藍(lán)綠色和黃色熒光蛋白在激發(fā)波長(zhǎng)上不同，能在一個(gè)細(xì)胞的不同區(qū)室中表達(dá)，進(jìn)而觀測(cè)到多個(gè)結(jié)構(gòu)。 具有不同光譜特性的GFP類似物，紅色和黃色熒光蛋白，已經(jīng)被分離，在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中很有前景。 在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體與核，或是線粒體與ER可以被同時(shí)地顯現(xiàn)，染色質(zhì)與核膜被同時(shí)標(biāo)記，用于分析在細(xì)胞分裂時(shí)的事件。 目前，多個(gè)熒光化學(xué)探針可以成像出區(qū)別于GFP標(biāo)記的區(qū)室（例如線粒體或是細(xì)胞壁）。另一種發(fā)展方向可能是結(jié)合其它熒光蛋白和GFP變異體。 光敏色素可以改變?yōu)闊晒鈽?biāo)記分子用， 它們的紅色熒光可以輕易地與GFP的綠色熒光分開。這些所謂的“phytofluros”有其自身的缺陷，就是必須加入外源的共因子，這使其不

19、能像GFP那樣用途廣闊。 另一種多肽標(biāo)簽需要一種共因子，一種結(jié)合到熒光素衍生物的多肽，也可能在植物細(xì)胞中最終找到與GFP結(jié)合的應(yīng)用。 顯微技術(shù)與光譜學(xué)技術(shù)的進(jìn)步同樣會(huì)促進(jìn)GFP變異體信號(hào)的分離。熒光壽命成像顯微鏡技術(shù)(FLIM)已經(jīng)成功地分離到一些光譜類似的GFP變異體，因?yàn)樗鼈兊臒晒鈮勖梢员粎^(qū)分。FLIM也可以與FRET結(jié)合使用，特別是用于檢測(cè)熒光信號(hào)的供體與受體的關(guān)系。GFP用于測(cè)量區(qū)室內(nèi)的參數(shù) 細(xì)胞器分離已顯示區(qū)室之間在分子濃度上有所區(qū)別。一些分子探針，可以辨別體內(nèi)不同區(qū)室間特定參數(shù)的梯度與動(dòng)態(tài)變化。 GFP變異體可以提供新的方法，去測(cè)量和比較不同區(qū)室的容量。 修飾過(guò)的GFP已經(jīng)合成用

20、作pH、膜電壓、蛋白酶、金屬離子或是鈣離子的指示劑。 具有pH依賴型吸收與熒光發(fā)射的GFP變異體已經(jīng)得到。 通過(guò)引入這種GFP， 在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞液、核以及線粒體基質(zhì)中的pH可以被測(cè)量。 GFP與一種電壓敏感的K通道的融合體可以在動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)量電壓的變化。為了觀察蛋白酶活性，一種藍(lán)色熒光的GFP變異體（BFP）和一種GFP變異體通過(guò)一個(gè)蛋白酶結(jié)構(gòu)域鏈接在一個(gè)雜合蛋白中。BFP作為供體而GFP作為受體, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)便可以發(fā)生。一旦蛋白酶酶切發(fā)生，則供體與受體GFP就被分開。 金屬離子可以被金屬結(jié)合GFP變異體化驗(yàn)，其技術(shù)是基于金屬離子接近發(fā)色團(tuán)而造成熒光的湮滅，或是通過(guò)具有

21、一個(gè)金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重排GFP進(jìn)行的FRET。 類似地，GFP/鈣調(diào)蛋白雜合蛋白(cameleons)也已經(jīng)被制備用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子。 對(duì)于cameleon，鈣離子濃度的提高導(dǎo)致能量在一種藍(lán)青色熒光蛋白和一種黃色熒光蛋白之間的轉(zhuǎn)移。 在這些GFP傳感器中，至今只有cameleon被報(bào)道運(yùn)用于植物中。它們被利用為檢測(cè)擬南芥防衛(wèi)細(xì)胞的鈣離子的變化。其它的基于GFP的傳感器今后會(huì)面世，因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)，很多GFP變異體通過(guò)重排編碼區(qū)，增加傳感結(jié)構(gòu)域，表達(dá)時(shí)仍然保留熒光。 FRET也可以被用于觀察在一個(gè)區(qū)室內(nèi)兩個(gè)蛋白之間的結(jié)合，或是檢測(cè)一個(gè)蛋白從一個(gè)區(qū)室到另一個(gè)的運(yùn)動(dòng)。雖然這種運(yùn)用還沒有在植物系統(tǒng)

22、中報(bào)道，但通過(guò)GFP-FRET已經(jīng)發(fā)現(xiàn)正在細(xì)胞程序死亡的哺乳動(dòng)物線粒體中兩個(gè)蛋白的結(jié)合。 關(guān)于在活體細(xì)胞中蛋白濃度及運(yùn)動(dòng)的信息，則可以通過(guò)精確的GFP變異體光漂白獲得。熒光分子例如GFP當(dāng)受到照射時(shí)會(huì)發(fā)生光損傷，后者是當(dāng)光損傷發(fā)生太快而來(lái)不及獲取影像時(shí)造成的現(xiàn)象。 目前使用的絕大多數(shù)GFP變異體被選擇用于慢速光漂白，這樣材料可以在充裕的時(shí)間段內(nèi)被顯微觀察。激光定點(diǎn)大劑量照射，可以用來(lái)光漂白一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的GFP分子。細(xì)胞的其它部分GFP運(yùn)動(dòng)到被照射的區(qū)域后就可以被觀測(cè)到。光漂白后熒光恢復(fù)（FRAP）的速率可以給出擴(kuò)散系數(shù)的預(yù)測(cè)以及運(yùn)動(dòng)的GFP的含量的指標(biāo)。 一個(gè)相關(guān)技術(shù)是GFP光激活，在一個(gè)很小的

23、區(qū)域內(nèi)，給予GFP一股藍(lán)光的脈沖，受照射的GFP分子激發(fā)紅光，這樣可以觀察到發(fā)射紅光分子的運(yùn)動(dòng)速率。 這些技術(shù)已被用于測(cè)量動(dòng)物線粒體內(nèi)及單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)GFP及GFP融合蛋白的擴(kuò)散，同樣，也應(yīng)該可以應(yīng)用于植物質(zhì)體、線粒體和核。 近期，由于應(yīng)用多光子激發(fā)，這種方法得到改進(jìn)，光漂白的電壓可以更為精細(xì)，利于計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)。 FRAP和另一種相關(guān)技術(shù)，光漂白熒光丟失（FLIP）可以揭示兩個(gè)區(qū)室間是否有流動(dòng)發(fā)生。 FRAP和FLIP在研究動(dòng)物細(xì)胞中高爾基體/ER的交流非常有用。 在植物中，F(xiàn)RAP和FLIP的第一次應(yīng)用是檢驗(yàn)質(zhì)體是否通過(guò)狹窄的連接結(jié)構(gòu)(stromules)交換蛋白分子，這種結(jié)構(gòu)是GFP定位于質(zhì)體基質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)的。激光照射兩個(gè)相連質(zhì)體中某個(gè)質(zhì)體內(nèi)的GFP，一開始造成被照射的質(zhì)體丟失熒光。 六秒后，被照射的質(zhì)體熒光增強(qiáng)而沒有照射的質(zhì)體熒光減弱。 在一個(gè)FLIP試驗(yàn)中，連接兩個(gè)相連質(zhì)體的通路被反復(fù)照射，因而穿越