GFP成像研究植物細胞區(qū)室化的方法與應用

1、GFP成像：研究植物細胞區(qū)室化的方法與應用摘要水母gfp（綠色熒光蛋白）基因的克隆，以及它在轉(zhuǎn)基因植物細胞內(nèi)亞細胞定位表達的改進，已經(jīng)給細胞內(nèi)組織學和動力學分析帶來新的觀念。 GFP與已知或非已知的完整蛋白的融合體顯示出這些蛋白的定位，以及它們是否從一個區(qū)室轉(zhuǎn)移到另一個中去。 研究者審慎地將GFP與其具有不同光譜性質(zhì)的變異體定于不同的區(qū)室中，分析它們在發(fā)育過程中或是響應環(huán)境變化時大小、形狀、流動性及動態(tài)的變化。 GFP變異體間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能夠辨別蛋白與蛋白之間是否結(jié)合。 GFP還被用作傳感蛋白，去檢測鈣離子、pH、電壓、金屬離子及酶活性的變化或區(qū)分。GFP的光漂白、光激活，與

2、熒光相關(guān)光譜學的結(jié)合能測量GFP在區(qū)室內(nèi)或區(qū)室間的擴散和運動的快慢。 這份評論涵蓋了過去這些方法的應用，以及GFP成像在理解植物細胞的功能結(jié)構(gòu)上的潛力發(fā)展。關(guān)鍵詞綠色熒光蛋白 顯微（鏡檢）術(shù) 細胞器 定位 光漂白 質(zhì)體小管 共聚焦顯微術(shù)介紹綠色熒光蛋白基因在細胞內(nèi)表達的技術(shù)誕生，使十年前不敢想象的很多實驗變成了現(xiàn)實。 在很多應用中，人們可以有了新的探究途徑去了解細胞活動的組織結(jié)構(gòu)。 這份評論將著重于GFP表達和成像方法，它們在理解植物細胞內(nèi)的區(qū)室化上已經(jīng)并將繼續(xù)提供前沿動力，而那些關(guān)于如何使用特別的熒光，共聚焦激光掃描及多光子顯微術(shù)去觀察GFP衍生的熒光蛋白，則不在此累贅了。 不過可以在后面一

3、些引用文獻中找到，我將簡要地介紹一下現(xiàn)有GFP成像新應用的研究，而闡明可行的實驗。 目前而言，GFP成像在動物和真菌細胞中的成功運用要多于植物細胞，部分是因為早期存在于如何在植物中使用水母GFP的問題。 這個初始的動物基因含有在植物中會被錯誤識別為內(nèi)含子的序列，導致了很低的表達水平。 當出現(xiàn)修飾型的、熱穩(wěn)定的、高亮度熒光的GFP之后，其產(chǎn)量與分布已經(jīng)帶動了許多植物系統(tǒng)的實驗。通過對表達與哺乳動物及其它生物體的GFP進行重新編碼，可以得到適用于維管植物的新基因。 但是密碼子的改變經(jīng)常會破壞隱秘剪接位點，因而只是有些，而并非全部帶有改變了的光譜特性的新GFP變種可以不經(jīng)進一步修正就可以在植物中發(fā)揮

4、功能。 許多不同的GFP變異體在一系列評論和文章中討論過，就不在這里重復了。無論怎樣，在實驗設(shè)計中，如何選擇一個帶有正確特性的植物表達GFP變異體，很明顯是一個關(guān)鍵的抉擇。 GFP作為一個熒光探針，最主要的一個優(yōu)點是不需要外源的共激活因子。 GFP可以在整個組織中表達，并且在整個檢測過程中都不受引入外界試劑的干擾。 由于許多對動物細胞所采納的染色和染料不能滲透入植物細胞，GFP技術(shù)可能最終成為植物細胞生物學而非動物的重要推動力。研究蛋白在細胞內(nèi)的定位為了理解植物細胞是如何有功能地組織起來，就有必要知道在發(fā)育過程中，和受到特定環(huán)境條件的影響下，特定時間下，特定植物細胞內(nèi)，酶和調(diào)節(jié)蛋白在何處定位。

5、一個特定酶的定位對于理解細胞內(nèi)新陳代謝的區(qū)室化是個關(guān)鍵的信號。 區(qū)室阻止特定蛋白、離子和復合物的進入，以杜絕不需要的反應，同時匯集酶反應過程中的參與物以易化細胞內(nèi)的生理活動。 一系列已知的例子驗證了，在一個特定反應中酶與底物共處一個區(qū)室，而其產(chǎn)物又在另一個區(qū)室中被使用。 這就提出了問題，產(chǎn)物與底物是如何從一個區(qū)室運輸?shù)搅硪粋€來完成一個代謝途徑。 植物細胞也包含有許多亞細胞定位還未知的酶，進一步地說，通過基因組“蠻干”的測序，而得到的參與酶反應的未知酶，如果不能知道它的細胞內(nèi)區(qū)室定位，則可能不能被很好地理解。 通過目前計算機的方法從DNA序列中預測細胞內(nèi)定位，雖然又用，但不是結(jié)論性的。另外，一些

6、植物蛋白也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)定位于超過一處的地方。 細胞器的分離及蛋白的純化，在闡明細胞內(nèi)定位上常存在技術(shù)上的難關(guān)。而在組織切片中去免疫檢測一個蛋白，其抗體的制備又費時費力。因而，將GFP的編碼序列融合到未知定位基因地編碼序列，對于決定在植物細胞內(nèi)一個蛋白，同時也是一個生化的、調(diào)節(jié)過程的位置，已經(jīng)成為一種及其有用的方法。 GFP編碼序列可以融合道目的基因的編碼序列的5端或3端，翻譯形成N端或C端的融合GFP。 這種融合基因已經(jīng)被摻入到穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因植物，或是導入植物細胞用于瞬間表達。穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物的獲得，可以檢測多種不同的表達GFP融合蛋白的細胞種類。這種優(yōu)勢的體現(xiàn)，在于技術(shù)上并非所有的細胞種類

7、都適用于瞬間表達。 另外，由于DNA摻入常常引起損傷，基因引入數(shù)量以及GFP在瞬間表達中轉(zhuǎn)錄都有不確定性，因此，有時候分析健康的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體比起由于DNA摻入而受到影響的細胞來說，要更有說服力。 當然，瞬間表達由于快速簡單，是一種非常有用的工具，尤其是在投入時間去獲得轉(zhuǎn)化體之前。 洋蔥表皮，有著極其例外的清晰細胞質(zhì)，及單層活細胞，是瞬間實驗中非常有用的材料。 通過各種構(gòu)建體的粒子轟擊，細胞壁、葉綠體、細胞質(zhì)、核以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)都可以被不同瞬間表達GFP融合體標記。 由于GFP體積小，可以進入核孔，因此沒有融合其它多肽時，GFP在植物、動物和酵母細胞的細胞質(zhì)和核中都有發(fā)現(xiàn)（圖1A）。 由于融合一些植物基

8、因序列后發(fā)現(xiàn)僅在核內(nèi)有GFP熒光，可以得出結(jié)論，融合的那些序列編碼核定位蛋白。 在定位于核內(nèi)的GFP-植物蛋白融合體中，有cryptochrome CRY2，一種藍光光感受器，以及ROOT HAIRLESS 1基因，它對初生根根毛的形成及幼苗的生存有作用。 GFP和一種geminivirus運動蛋白的融合揭示了它是一種核穿梭蛋白。 融合其它未知定位的蛋白，已經(jīng)揭示了它們在質(zhì)體、線粒體或是細胞液的區(qū)室分布。 一種具有香葉基香葉基雙磷酸合成酶活性的蛋白，及一種NADP依賴型異檸檬酸脫氫酶，被顯示定位于線粒體中。 噬菌體形RNA多聚酶類似物基因的融合體顯示一個是定位于線粒體，而另一個被轉(zhuǎn)運到葉綠體。

9、 通過融合可能的定位信號到GFP上，三個核內(nèi)編碼的RNA多聚酶因子都顯示定位于質(zhì)體中。 擬南芥中三個不同編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆基于GFP融合蛋白定位，被定位于三個不同的區(qū)室細胞液、葉綠體和線粒體。 GFP融合體也驗證兩個正式被發(fā)現(xiàn)于葉綠體中的蛋白：擬南芥PALE CRESS核基因產(chǎn)物，用于正常的葉綠體發(fā)育，和AST82，一種硫酸轉(zhuǎn)運體。 GFP融合在判斷未知cDNA編碼蛋白亞細胞定位的成功，引發(fā)了一種命名為“基序羅網(wǎng)”方法的發(fā)展。先將隨意的DNA片段融合到gfp，然后分離各種在不同亞細胞區(qū)室表達GFP的細胞，最后用RT-PCR克隆出表達的DNA片段。 GFP融合體還可以被用于發(fā)現(xiàn)植

10、物細胞在環(huán)境刺激下或是發(fā)育途徑中，一個蛋白是不是從一個定位轉(zhuǎn)移到另一個定位。 phyA和phyB是光感受器的光敏色素家族成員。 GFP被融合到其編碼序列上，通過激發(fā)紅光，phyA和phyB被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；紅外線處理，能抑制紅光造成的光形態(tài)應答，發(fā)現(xiàn)phyB而非phyA，由紅光引發(fā)的運動被抑制了。 類似的，通過與GFP融合，歐芹bZIP轉(zhuǎn)錄因子CPRF2的運動也顯示受到光敏色素的調(diào)控。 GFP還被用于研究植物中核輸出途徑及胞間連絲間蛋白的穿梭。 GFP融合在判斷一個蛋白的細胞內(nèi)定位上并不是一種完全正確無誤的方法。 由于GFP與酶的融合常常不會抑制酶的活性，因而GFP普遍被認為是無害的標記。 然而，

11、一些證據(jù)表明在特定區(qū)域的高表達有損于細胞。 例如，Haseloff等發(fā)現(xiàn)，除非GFP被隔留在ER中，否則很難拿到高熒光轉(zhuǎn)基因植物株系。 雖然絕大多數(shù)在動物細胞中表達GFP的報道說明GFP表達沒有毒性，但有害性有時仍然被發(fā)現(xiàn)。此外，在特定情況下，GFP/蛋白的融合蛋白與野生型蛋白在亞細胞定位仍有可能有區(qū)別。 GFP的存在可能會掩蓋住融合蛋白上穿梭序列編碼的潛在定位信號。 盡管大多數(shù)真菌與植物的線粒體研究表明，含有定位于線粒體的穿梭序列的信號蛋白有效地轉(zhuǎn)運到目的細胞器， 但錯例仍有時發(fā)生。 相反，如果GFP融合造成融合蛋白的構(gòu)型發(fā)生變化，原本在沒有GFP時或是缺乏某些內(nèi)源配基時應該被掩蓋住的定位信

12、號，會被激活。 另一個問題是，融合目的基因序列與gfp可能導致不正常折疊或是編碼的融合GFP不穩(wěn)定，因而很難檢測到熒光。在正規(guī)文獻中這種陰性結(jié)果很少提起，但私底下一些研究者碰到過獲取不到高亮度熒光蛋白的問題。融合蛋白N端的正確折疊被顯示會影響GFP的C端的折疊水平。例如，麥芽糖結(jié)合蛋白的信號序列與GFP的融合在大腸桿菌中非正常折疊，而且缺失熒光。GFP標記區(qū)室 GFP與穿梭序列或是完整蛋白的融合體不僅可以判斷特殊分子的定位，還可以用于商討標記精細的區(qū)室。這些實驗的目的可能是為了研究關(guān)于一個或多個區(qū)室的數(shù)量、大小、形狀、運動性、與其它細胞器的結(jié)合，以及觀察在發(fā)育過程中或是環(huán)境應答的情況下動態(tài)的變

13、化。GFP定位已經(jīng)幫助人們觀察到以前不可能觀察到的植物細胞內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)（圖1、2）。 一些研究者有意地去標記核來研究區(qū)室。 Chytilova等人設(shè)計了含有一個NLS的GFP/GUS融合體的融合基因，用于獲得有標記的核的轉(zhuǎn)基因植物，后者可以用于研究在細胞周期中核的形態(tài)及運動。 通過融合GUS，增大了GFP蛋白的大小，造成了GFP在核的滯留。 從SV40中獲得的核定位信號（NLS）融合于GFP上， 可以獲得綠色熒光核的轉(zhuǎn)基因植物（圖1B），但這種較小的GFP融合蛋白在細胞質(zhì)中仍然可以觀測得到。在植物細胞中，其它的區(qū)室也已經(jīng)被標記，液泡, 過氧化物酶體, 高爾基體，線粒體（圖1C，2D），質(zhì)體（圖

14、2A，3），細胞骨架，質(zhì)膜，細胞壁和ER（圖1D，2C）。 用GFP融合體去標記確定某些細胞結(jié)構(gòu)，如核和細胞壁，能通過和細胞的光顯微圖像比較而得到確定。而其它熒光顯現(xiàn)出的細胞器或結(jié)構(gòu)的確定則并不總是很明顯，當然，需要實驗的驗證。一個常用的方法是，用一種特殊的化學染料標記一種容易標記的細胞種類，再用標記后的圖像與綠色熒光的圖像進行比較。 舉例來說，用線粒體特殊的熒光染料可以驗證線粒體的特殊標記，GFP和葉綠素自發(fā)熒光的紅色信號的共定位可以確定葉綠素的定位。 GFP標記的另一種細胞內(nèi)的“區(qū)室”則是植物病毒。激發(fā)熒光的病毒穿越胞間連絲，從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞，這種觀察對理解病毒的增殖與傳播提供了

15、新的途徑。進一步而言，GFP可以用于標記病毒蛋白，如運動蛋白，觀察病毒編碼的蛋白如何與細胞內(nèi)的組織結(jié)合。這一方面的更多內(nèi)容可以在近期的文章中找到。 然而，絕大多數(shù)亞細胞區(qū)室的標記必須通過引入融合gfp基因至核內(nèi)，并須經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)移至所需的場所。由于一些物種的質(zhì)體染色體可以轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)了一種可行的選擇方法。 GFP編碼區(qū)通過分子轟擊引入煙草或馬鈴薯的葉綠體，或通過原生質(zhì)體DNA吸收，而得到含有高亮度熒光質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因植物（圖3）。 Khan和Maliga將GFP編碼區(qū)融合一種抗生素抗性選擇標記到一種葉綠體DNA轉(zhuǎn)化載體，報道說得到有熒光質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因植物。GFP也可以通過分子轟擊或是葉綠體微注射在葉綠體中

16、瞬間表達。 除了辨別正常植物細胞內(nèi)區(qū)室的特征，區(qū)室的標記在分析由于突變或是病理攻擊而造成的細胞功能損傷時非常有用。 例如，帶有GFP標記ER的轉(zhuǎn)基因植物細胞，可以用于觀察ER在遭受煙草鑲嵌病毒或是豇豆鑲嵌病毒的感染后引起的變化。質(zhì)體的GFP標記在細查葉綠素缺失的突變體植物中應該是相當有幫助，因為用光學顯微鏡是很難觀察不正常的質(zhì)體。 在植物系統(tǒng)中，區(qū)室標記需要進一步研究的另一應用是，標記區(qū)室以利于它們的分離。Galbraith等證明了GFP標記的核可以用流動分類的方法從細胞沉淀物中得到分離。 用GFP熒光作為一種分子標記來分離GFP標記，而用傳統(tǒng)方法又無法輕易分離的細胞器和區(qū)室，也將是一件可能的

17、事。多個區(qū)室的熒光標記 許多生物合成及代謝過程需要不同的細胞器或是區(qū)室共同作用。 亞細胞結(jié)構(gòu)的排列位置可以影響擴散效率，因而，在發(fā)育過程或是環(huán)境應答中區(qū)室間距離與聯(lián)系發(fā)生了改變，可能會對功能發(fā)生很大的影響。 觀察區(qū)室位置與運動的變化，可以用信號互不相同的熒光探針去標記。 一些植物區(qū)室和結(jié)構(gòu)在自然狀態(tài)下存在自發(fā)熒光，其波長不同于GFP的激發(fā)與發(fā)射波長，從而可以同時觀察到GFP標記結(jié)構(gòu)與自發(fā)熒光物體。 至今，自發(fā)熒光與GFP的結(jié)合使用已被主要地用于觀察紅色熒光的葉綠體與GFP標記的線粒體、核或ER。（圖1） 關(guān)于用GFP變異體雙標記細胞，只有一些報道，但接下來的幾年，這種方法的成功應用會增加得很快

18、。藍綠色和黃色熒光蛋白在激發(fā)波長上不同，能在一個細胞的不同區(qū)室中表達，進而觀測到多個結(jié)構(gòu)。 具有不同光譜特性的GFP類似物，紅色和黃色熒光蛋白，已經(jīng)被分離，在雙標記實驗中很有前景。 在動物細胞中，線粒體與核，或是線粒體與ER可以被同時地顯現(xiàn)，染色質(zhì)與核膜被同時標記，用于分析在細胞分裂時的事件。 目前，多個熒光化學探針可以成像出區(qū)別于GFP標記的區(qū)室（例如線粒體或是細胞壁）。另一種發(fā)展方向可能是結(jié)合其它熒光蛋白和GFP變異體。 光敏色素可以改變?yōu)闊晒鈽擞浄肿佑茫?它們的紅色熒光可以輕易地與GFP的綠色熒光分開。這些所謂的“phytofluros”有其自身的缺陷，就是必須加入外源的共因子，這使其不

19、能像GFP那樣用途廣闊。 另一種多肽標簽需要一種共因子，一種結(jié)合到熒光素衍生物的多肽，也可能在植物細胞中最終找到與GFP結(jié)合的應用。 顯微技術(shù)與光譜學技術(shù)的進步同樣會促進GFP變異體信號的分離。熒光壽命成像顯微鏡技術(shù)(FLIM)已經(jīng)成功地分離到一些光譜類似的GFP變異體，因為它們的熒光壽命可以被區(qū)分。FLIM也可以與FRET結(jié)合使用，特別是用于檢測熒光信號的供體與受體的關(guān)系。GFP用于測量區(qū)室內(nèi)的參數(shù) 細胞器分離已顯示區(qū)室之間在分子濃度上有所區(qū)別。一些分子探針，可以辨別體內(nèi)不同區(qū)室間特定參數(shù)的梯度與動態(tài)變化。 GFP變異體可以提供新的方法，去測量和比較不同區(qū)室的容量。 修飾過的GFP已經(jīng)合成用

20、作pH、膜電壓、蛋白酶、金屬離子或是鈣離子的指示劑。 具有pH依賴型吸收與熒光發(fā)射的GFP變異體已經(jīng)得到。 通過引入這種GFP， 在HeLa細胞的細胞液、核以及線粒體基質(zhì)中的pH可以被測量。 GFP與一種電壓敏感的K通道的融合體可以在動物細胞中測量電壓的變化。為了觀察蛋白酶活性，一種藍色熒光的GFP變異體（BFP）和一種GFP變異體通過一個蛋白酶結(jié)構(gòu)域鏈接在一個雜合蛋白中。BFP作為供體而GFP作為受體, 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)便可以發(fā)生。一旦蛋白酶酶切發(fā)生，則供體與受體GFP就被分開。 金屬離子可以被金屬結(jié)合GFP變異體化驗，其技術(shù)是基于金屬離子接近發(fā)色團而造成熒光的湮滅，或是通過具有

21、一個金屬離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重排GFP進行的FRET。 類似地，GFP/鈣調(diào)蛋白雜合蛋白(cameleons)也已經(jīng)被制備用于檢測細胞內(nèi)的鈣離子。 對于cameleon，鈣離子濃度的提高導致能量在一種藍青色熒光蛋白和一種黃色熒光蛋白之間的轉(zhuǎn)移。 在這些GFP傳感器中，至今只有cameleon被報道運用于植物中。它們被利用為檢測擬南芥防衛(wèi)細胞的鈣離子的變化。其它的基于GFP的傳感器今后會面世，因為研究發(fā)現(xiàn)，很多GFP變異體通過重排編碼區(qū)，增加傳感結(jié)構(gòu)域，表達時仍然保留熒光。 FRET也可以被用于觀察在一個區(qū)室內(nèi)兩個蛋白之間的結(jié)合，或是檢測一個蛋白從一個區(qū)室到另一個的運動。雖然這種運用還沒有在植物系統(tǒng)

22、中報道，但通過GFP-FRET已經(jīng)發(fā)現(xiàn)正在細胞程序死亡的哺乳動物線粒體中兩個蛋白的結(jié)合。 關(guān)于在活體細胞中蛋白濃度及運動的信息，則可以通過精確的GFP變異體光漂白獲得。熒光分子例如GFP當受到照射時會發(fā)生光損傷，后者是當光損傷發(fā)生太快而來不及獲取影像時造成的現(xiàn)象。 目前使用的絕大多數(shù)GFP變異體被選擇用于慢速光漂白，這樣材料可以在充裕的時間段內(nèi)被顯微觀察。激光定點大劑量照射，可以用來光漂白一個細胞內(nèi)的GFP分子。細胞的其它部分GFP運動到被照射的區(qū)域后就可以被觀測到。光漂白后熒光恢復（FRAP）的速率可以給出擴散系數(shù)的預測以及運動的GFP的含量的指標。 一個相關(guān)技術(shù)是GFP光激活，在一個很小的

23、區(qū)域內(nèi)，給予GFP一股藍光的脈沖，受照射的GFP分子激發(fā)紅光，這樣可以觀察到發(fā)射紅光分子的運動速率。 這些技術(shù)已被用于測量動物線粒體內(nèi)及單個大腸桿菌細胞內(nèi)GFP及GFP融合蛋白的擴散，同樣，也應該可以應用于植物質(zhì)體、線粒體和核。 近期，由于應用多光子激發(fā)，這種方法得到改進，光漂白的電壓可以更為精細，利于計算擴散系數(shù)。 FRAP和另一種相關(guān)技術(shù)，光漂白熒光丟失（FLIP）可以揭示兩個區(qū)室間是否有流動發(fā)生。 FRAP和FLIP在研究動物細胞中高爾基體/ER的交流非常有用。 在植物中，F(xiàn)RAP和FLIP的第一次應用是檢驗質(zhì)體是否通過狹窄的連接結(jié)構(gòu)(stromules)交換蛋白分子，這種結(jié)構(gòu)是GFP定位于質(zhì)體基質(zhì)時發(fā)現(xiàn)的。激光照射兩個相連質(zhì)體中某個質(zhì)體內(nèi)的GFP，一開始造成被照射的質(zhì)體丟失熒光。 六秒后，被照射的質(zhì)體熒光增強而沒有照射的質(zhì)體熒光減弱。 在一個FLIP試驗中，連接兩個相連質(zhì)體的通路被反復照射，因而穿越