基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法

1、基因擴(kuò)增檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)測定臨床標(biāo)本中的病原體核酸成分，是一種高度敏感，且最為直接的檢測手段。由于臨床標(biāo)本中含有蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)，可干擾PCR反應(yīng)，故在做PCR反應(yīng)前必須進(jìn)行核酸提取。第1頁/共68頁經(jīng)典的核酸提取方法通常是加去污劑（SDS等）裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。第2頁/共68頁由于樣本的處理及保存對DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此在核酸測定時標(biāo)本的處理及適當(dāng)保存對測定結(jié)果的準(zhǔn)確有效非常重要。第3頁/共68頁臨床常見的標(biāo)本有血清（漿）、全血、分泌物、棉拭子、膿液、體液、新鮮組織、石蠟切片等，這些臨

2、床標(biāo)本的處理和保存方法各有不同。第4頁/共68頁臨床標(biāo)本的處理第5頁/共68頁血清（漿）標(biāo)本 一些病原體，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等的PCR檢測常采用血清或血漿標(biāo)本。第6頁/共68頁HBV：標(biāo)本通常由醫(yī)護(hù)人員采集，應(yīng)注意避免溶血，如為血漿標(biāo)本注意抗凝劑的選 擇，一般用EDTA-Na2或枸櫞酸納，不可使用肝素。標(biāo)本為全血時，及時分離出血漿，提取病毒DNA進(jìn)行檢測。第7頁/共68頁HCV：檢測RNA病毒。由于RNA極易降解，標(biāo)本的制備和保存方式往往可以影響測定結(jié)果。若用血漿標(biāo)本，應(yīng)使用EDTA抗凝。嚴(yán)禁使用肝素，因其對PCR擴(kuò)增有抑制作用, 且無法在核酸

3、提取過程中去除。抗凝后6小時內(nèi)分離血漿。如用血清標(biāo)本，則應(yīng)盡快（2小時內(nèi)）分離血清 進(jìn)行檢測，或-20oC保存。第8頁/共68頁 全血標(biāo)本通常用來提取外周血單個核細(xì)胞核酸：如基因組DNA、線粒體DNA、總RNA等?？鼓齽阂话闶褂肊DTA-Na2、枸櫞酸納，不使用肝素。第9頁/共68頁前處理： 1）加適量的紅細(xì)胞裂解液（破膜液），裂解全血中的紅細(xì)胞。 2）再加適量的細(xì)胞核裂液（破核液），裂解白細(xì)胞中的細(xì)胞核，使核內(nèi)DNA 釋放出來。 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸鈉）等去污劑，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。 第10頁/共68頁SDS可與蛋白 質(zhì)結(jié)成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性沉淀，但SDS在以后的核酸提取

4、過 程中必須除去。第11頁/共68頁 痰標(biāo)本痰屬于分泌物，臨床上常用作結(jié)核桿菌DNA測定樣本，由于痰標(biāo)本中含大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時，一定要對標(biāo)本進(jìn)行前處理，即用4%NaOH液化，去除粘蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等經(jīng)典法提取DNA。第12頁/共68頁具體方法：具體方法： 用無菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml， 加入4倍體積4%NaOH，搖勻，室溫下放置30分鐘左右液化取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室溫放10分鐘第13頁/共68頁12000 rpm，離心15分鐘棄上清，加無菌生理鹽水1 ml ，混勻，12000rpm離心5分鐘棄上

5、清，沉淀物用于 DNA提取第14頁/共68頁棉拭子 用PCR方法檢測性病病原體時（衣原體、支原體、淋球菌、梅毒螺旋體、人乳頭狀瘤病毒等），臨床標(biāo)本一般為棉拭子。標(biāo)本取材是關(guān)鍵，衣原體等病原體感染上皮細(xì)胞，因此取材一定要取到細(xì)胞。第15頁/共68頁具體方法：具體方法： 加1ml無菌生理鹽水，充分震蕩混勻，12000rpm ，離心5分鐘 用棉拭子取尿道分泌物或?qū)m頸分泌物（由醫(yī)護(hù)人員采集），置無菌試管或EP管內(nèi)棄上清，沉淀加無菌生理鹽水1ml，打勻，12000rpm，離心5分鐘第16頁/共68頁 同上，重復(fù)洗滌一次 棄上清，沉淀即可用于DNA提取第17頁/共68頁5體液體液標(biāo)本，包括胸水、腹水、腦脊

6、液、尿液等，可直接離心，取沉淀物提取核酸。血性胸腹水，可使用紅細(xì)胞裂解液處理：第18頁/共68頁加等體積紅細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，置5-10分鐘10000rpm，離心5分鐘，棄上清可根據(jù)情況重復(fù)2-3次，沉淀物用于DNA提取第19頁/共68頁6膿液粘稠膿液：同痰標(biāo)本處理，先用4%NaOH液化，再離心取沉淀提取DNA。 水樣膿液：直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA提取。第20頁/共68頁7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸第21頁/共68頁石蠟切片用于核酸提取，需先用二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化

7、后進(jìn)行DNA提取。第22頁/共68頁標(biāo)本的保存第23頁/共68頁 血清（漿）HBV：分離出的血清（漿）如不立即提取核酸，保存于-20oC待檢。HCV：盡快分離血清(漿), 如不立即提取RNA， 保存于-20oC待檢。第24頁/共68頁長期保存：吸取200l血清，加20u RNasin（RNA酶抑制劑），保存于-70C。已發(fā)出結(jié)果報告的標(biāo)本應(yīng)及時轉(zhuǎn)移至冰箱保存，并由專人負(fù)責(zé)管理，保存1-2周（時間長短根據(jù)報告單上的承諾而定）。第25頁/共68頁全血標(biāo)本全血標(biāo)本如用于DNA提取，可4oC下短期保存（數(shù)天），時間長易降解，如用于RNA檢測，應(yīng)在取血后盡快提取RNA。最好將DNA或RNA提取后，置-7

8、0oC保存。第26頁/共68頁痰 液化的痰標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。處理后的棉拭子、體液、膿液如不立即用于核酸提取，可保存于-20oC。第27頁/共68頁組織新鮮組織最好保存于50%乙醇中，具體方法：先用生理鹽水將組織洗一次，切成小塊，加入適量生理鹽水，然后邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4oC可保存6年。第28頁/共68頁 總而言之，標(biāo)本的保存及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理對核酸模板的成功提取具有決定性作用。要強(qiáng)調(diào)的是，所有用于上述處理的容器如試管或離心管，均應(yīng)在使用前壓滅菌。第29頁/共68頁核酸的提取第30頁/共68頁核酸包括DNA、RNA兩種

9、分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主要步驟為：裂解細(xì)胞去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA，反之亦然。第31頁/共68頁沉淀核酸純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)第32頁/共68頁 (一)DNA提取的經(jīng)典方法 DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的酚-氯仿提取法。因?yàn)槭褂脙煞N不同的有機(jī)溶劑交替抽提更容易將蛋白除去，提取次序?yàn)榉?、?氯仿（1：1）、氯仿，這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好，缺點(diǎn)是較為繁瑣。第33頁/共68頁經(jīng)前處理的標(biāo)本加入蛋白酶K,搖勻56oC溫育1小時,或37 oC消化6小時以上/過夜

10、加入等體積飽和酚,充分混勻第34頁/共68頁12000rpm,離心5分鐘將上層水相移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積酚/氯仿(1:1)混合液，混勻第35頁/共68頁 12 000rpm，離心5分鐘 取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加等體積氯仿，混勻后12000rpm，離心5分鐘 取水相，移至一干凈離心管內(nèi)，加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，沉淀DNA 搖勻，可見白色絮狀DNA，置-20oC，30分鐘或過夜第36頁/共68頁 12000rpm，離心5分鐘 棄上清，用預(yù)冷70%乙醇洗兩次，室溫干燥5分鐘 加適量TE緩沖液或無菌去離子H2O溶解DNA，混勻 紫外分光光度儀測OD值，4oC備用第37頁/共68頁 說明：

11、 回收上層水相時，一定不要接觸兩相的界面，以免將蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸入新離心管。 沉淀DNA，無水乙醇是首選的有機(jī)溶劑。另：異丙醇、醋酸鈉等。第38頁/共68頁 70%乙醇漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因?yàn)镾DS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應(yīng)的影響。 TE緩沖液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8第39頁/共68頁RNA的提取 RNA提取條件較DNA要求嚴(yán)格，主要是因?yàn)榕R床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，存在大量對RNA有強(qiáng)烈降解作用RNase。RNase是一類生物活

12、性非常穩(wěn)定的酶類。這種酶耐酸、耐堿、耐高溫，如煮沸也不能使之完全失活。第40頁/共68頁蛋白質(zhì)變性劑可使之暫時失活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。除細(xì)胞內(nèi)RNase以外，環(huán)境中灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿和試劑、人體的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA時，關(guān)鍵要避免RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解。第41頁/共68頁1提取RNA所用器皿的處理及溶液的準(zhǔn)備 塑料制品：如試管、EP管、Tip頭，使用滅菌的一次性用品。第42頁/共68頁玻璃用品：如燒杯、試管和其他用品，常被RNase污染，使用前必須于180oC干燥8小時以上，或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯)浸泡處理

13、。第43頁/共68頁DEPC是RNase的強(qiáng)抑制劑，作用機(jī)制是通過與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。37oC浸泡2小時，然后用滅菌水漂洗數(shù)次，于100oC干烤15分鐘，去除器皿上殘余DEPC。第44頁/共68頁 所需溶液的配制：必須用高壓滅菌的水和RNA提取專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，把溶液裝入無RNase的玻璃器皿。第45頁/共68頁嚴(yán)格來說，所有溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37oC處理12小時以上，然后于100oC加熱15分鐘或高壓滅菌15分鐘，去除殘余DEPC。第46頁/共68頁2RNA提取中RNase污染的控制最主要的潛在污染源是操作人員的手，手直接觸摸之處毫無

14、疑問會留下RNase，另外，說話帶出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套和口罩。第47頁/共68頁實(shí)驗(yàn)中，如接觸了“臟的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。第48頁/共68頁 RN A提取方法下面以異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法介紹RNA的提取。異硫氰酸胍是一種強(qiáng)用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。第49頁/共68頁RNase雖可耐受多種處理，（如煮沸）而不失活，但卻會被4mol/L異硫氰酸胍和-巰基乙醇（破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵）等還原

15、劑所滅活，因而可從組織中分離出完整RNA分子。因此上述試劑是制備RNA的常規(guī)試劑。第50頁/共68頁200l血清（漿）加入200l 20%PEG60004oC，3小時，12000rpm，4oC離心15分鐘棄上清，加500l裂解液（含異硫氰酸胍、-巰基乙醇等），混勻第51頁/共68頁加50l NaAc，500l飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1），充分混勻，冰浴10分鐘4oC12000rpm，離心5分鐘小心吸取上層水相移至一新離心管中，避免吸取兩相之間的蛋白質(zhì)，用氯仿-異戊醇再抽提一次第52頁/共68頁 加2.5倍體積無水乙醇，冰浴30-60分鐘 4oC12000rpm，離心10分鐘 棄上清，

16、沉淀用70%乙醇洗二次，65oC烘干 用10l DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin -20oC保存?zhèn)溆玫?3頁/共68頁 （三）核酸提取的其他方法(簡單介紹): 胍鹽提取結(jié)合二氧化硅吸附法 二氧化硅具有特異吸附核酸的特性，異硫氰酸胍可使細(xì)胞裂解,因此在高濃度異硫氰酸胍存在下，從細(xì)胞(包括細(xì)菌)或病毒顆粒中釋放出來的核酸成分可以結(jié)合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。第54頁/共68頁2.TRIzol試劑提取RNA方法： TRIzol試劑盒是由GIBCO BRI公司推出的產(chǎn)品，其操作方法簡單方便，一小時內(nèi)即可完成。用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，再加入氯仿，離心后可見

17、三層，上層為透明的水相含有RNA，中間層含DNA，下層為紅色的有機(jī)相，含蛋白質(zhì)。第55頁/共68頁3.旋轉(zhuǎn)離心柱提取旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，屬于硅吸附方法的一種，市場上的離心柱雖各有特色，但在原理上通?？煞譃槿齻€部分：利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來。第56頁/共68頁 把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。 把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。第57頁/共68頁此法也可用于DNA測序前核酸的純化，又叫過柱純化

18、。 旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)具有廣泛的發(fā)展前景，該產(chǎn)品可應(yīng)用于生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)等各方面的基因分析。第58頁/共68頁第59頁/共68頁由于樣本的處理及保存對DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此在核酸測定時標(biāo)本的處理及適當(dāng)保存對測定結(jié)果的準(zhǔn)確有效非常重要。第60頁/共68頁6膿液粘稠膿液：同痰標(biāo)本處理，先用4%NaOH液化，再離心取沉淀提取DNA。 水樣膿液：直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后用于DNA提取。第61頁/共68頁7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸第62頁/共68頁7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸第63頁/共68頁7組織組織有新鮮組織和石蠟切片。新鮮組織的處理步驟：先用生理鹽水洗二次，然后將其搗碎或剪碎（用眼科剪），加蛋白酶K消化后提取核酸第64頁/共68頁核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，核酸提取的主