動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)

1、會計學(xué)1動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù) v分類： 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)有限細(xì)胞系有限細(xì)胞系(infinited cell line)：不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株。無限細(xì)胞系無限細(xì)胞系(finited cell line)：能夠連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株，能夠連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株，也稱無限系。也稱無限系。無限系細(xì)胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的無限系細(xì)胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞?？赡芤殉蔀閻盒约?xì)胞。細(xì)胞株、細(xì)胞系的命名：細(xì)胞株、細(xì)胞系的命名：l以組織來源定名，如以組織來源定名，如BHK(BHK(幼地鼠腎細(xì)胞幼地鼠腎細(xì)胞) )l以人名定名，

2、如以人名定名，如HeLaHeLa細(xì)胞細(xì)胞l以時間地點來定名，如以時間地點來定名，如S7811S7811細(xì)胞系細(xì)胞系l以臨床疾病類型定名，如以臨床疾病類型定名，如BALL-1BALL-1細(xì)胞系細(xì)胞系( (來自來自B B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞) ) )用于生產(chǎn)的用于生產(chǎn)的動物細(xì)胞株動物細(xì)胞株原代細(xì)胞原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞融合細(xì)胞融合細(xì)胞基因工程細(xì)胞基因工程細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞常用細(xì)胞株：常用細(xì)胞株：CHO細(xì)胞、細(xì)胞、Vero細(xì)胞、細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、細(xì)胞、WI-38細(xì)胞細(xì)胞平滑肌細(xì)胞平滑肌細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞血紅細(xì)胞血紅細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為形態(tài)上表現(xiàn)為多種多

3、樣，如多種多樣，如圓形、橢圓形圓形、橢圓形、正方形、柱、正方形、柱形、扁平形、形、扁平形、梭形、星形和梭形、星形和多邊形等多邊形等v維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為準(zhǔn)溫度為36.50.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。響，甚至死亡。 培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，溫度上升不超過培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，溫度上升不超過39時，細(xì)時，細(xì)胞代謝與溫度成正比；胞代謝與溫度成正比；v人體細(xì)胞在人體細(xì)胞在39-401小時，即能受到一定

4、損傷，但仍有可能恢復(fù)；小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；v在在40-411小時，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；小時，細(xì)胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；v41-421小時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個別細(xì)胞仍有恢小時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；復(fù)可能；v當(dāng)溫度在當(dāng)溫度在43以上以上1小時，細(xì)胞全部死亡。小時，細(xì)胞全部死亡。低溫下會使細(xì)胞代謝速率降低溫下會使細(xì)胞代謝速率降低低（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 （二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點（二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點（三）（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖

5、過程非貼壁依賴型非貼壁依賴型成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式及類型 于懸浮狀態(tài)下于懸浮狀態(tài)下即可生長即可生長 貼附于支持物表面貼附于支持物表面才能生長的細(xì)胞才能生長的細(xì)胞 人的成纖維細(xì)胞人的成纖維細(xì)胞小鼠的成纖維細(xì)胞小鼠的成纖維細(xì)胞人骨髓間充質(zhì)細(xì)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（胞（MSCMSC）大鼠血管平滑肌細(xì)胞大鼠血管平滑肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型單層扁平上皮細(xì)胞單層扁平上皮細(xì)胞人口腔皮樣癌細(xì)胞人口腔皮樣癌細(xì)胞人宮頸癌上皮細(xì)胞（人宮頸癌上皮細(xì)胞（HelaHela）成骨肉瘤細(xì)胞成骨肉瘤細(xì)胞(多角形多角形

6、)上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型奶牛腎臟上皮細(xì)胞奶牛腎臟上皮細(xì)胞(上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型)不常見，具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。不常見，具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞本型細(xì)胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，速度快且不規(guī)則。速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。如

7、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)如單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。單 核 巨 噬 細(xì) 胞1、游走型細(xì)胞在支持物上分散生長，一般不連接成、游走型細(xì)胞在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落；片、形成群落；2、細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。、細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。3、生長位置不固定，呈游走和變形運(yùn)動，速度快、生長位置不固定，呈游走和變形運(yùn)動，速度快、方向不規(guī)則。方向不規(guī)則。4、細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。、細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。單核巨噬細(xì)胞（未刺激狀態(tài)）單核巨噬細(xì)胞（未刺激狀態(tài)）游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型單核巨

8、噬細(xì)胞（活化劑刺激單核巨噬細(xì)胞（活化劑刺激6h后）：向四周伸展偽足后）：向四周伸展偽足需要注意的是：在實際細(xì)胞培養(yǎng)中，可能同時存在需要注意的是：在實際細(xì)胞培養(yǎng)中，可能同時存在2 2種及其以上種及其以上細(xì)胞形態(tài)；其影響因素包括（細(xì)胞形態(tài)；其影響因素包括（1 1）不同來源細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)）不同來源細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不同；（不同；（2 2）不同培養(yǎng)條件下同一細(xì)胞表現(xiàn)不同形態(tài)；如血清成）不同培養(yǎng)條件下同一細(xì)胞表現(xiàn)不同形態(tài)；如血清成分，培養(yǎng)基，溫氣環(huán)境等分，培養(yǎng)基，溫氣環(huán)境等神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)細(xì)胞（DAB顯色）顯色）多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞大鼠大鼠 海馬神經(jīng)細(xì)胞海馬神經(jīng)細(xì)胞(二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長

9、特點二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點貼附和伸展貼附和伸展接觸抑制接觸抑制密度抑制密度抑制貼附過程：促細(xì)胞附著因子吸附于底物上貼附過程：促細(xì)胞附著因子吸附于底物上 懸浮的圓形細(xì)胞與底物附著懸浮的圓形細(xì)胞與底物附著 細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)細(xì)胞將伸展成其原來的形態(tài)。貼附過程貼附過程 體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的過程可分為三個階段體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的過程可分為三個階段 原代培養(yǎng)期原代培養(yǎng)期 傳代期傳代期 衰退期衰退期 2、細(xì)胞系的生長過程：細(xì)胞系的生長過程： 結(jié)果：細(xì)胞群體中具有迅結(jié)果：細(xì)胞群體中具有迅速增殖能力的細(xì)胞將漸占速增殖能力的細(xì)胞將漸占優(yōu)勢而非增殖的或增殖緩優(yōu)勢而非增殖的或增殖緩慢的細(xì)胞將被減弱。慢的細(xì)胞將被減

10、弱。 3、每代細(xì)胞的生長過程、每代細(xì)胞的生長過程在細(xì)胞的生長過程中，繁殖到一定密度后，將之分在細(xì)胞的生長過程中，繁殖到一定密度后，將之分開而移至新的培養(yǎng)皿中稱為接種。開而移至新的培養(yǎng)皿中稱為接種。 細(xì)胞細(xì)胞”一代一代”：僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一：僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。段時間。潛伏期潛伏期每代細(xì)胞的生長階段每代細(xì)胞的生長階段：指數(shù)生長期指數(shù)生長期 停止期停止期一、體外培養(yǎng)的一般過程一、體外培養(yǎng)的一般過程二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 四、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例四、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 五、動物細(xì)胞體外

11、培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望五、動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望動物胚胎或幼齡動動物胚胎或幼齡動物的組織、器官物的組織、器官細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液胰蛋白酶胰蛋白酶1代細(xì)胞代細(xì)胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)50代細(xì)胞代細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)無限傳代無限傳代單個細(xì)胞單個細(xì)胞加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液動物組織細(xì)胞間隙中動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織定彈性和韌性的組織和器官。和器官。（分解彈性纖維）（分解彈性纖維） 動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程過程過程 組織組織取材取材 組織細(xì)胞的分離分離 培養(yǎng)培養(yǎng) 機(jī)械法機(jī)械法 消化法消

12、化法 機(jī)機(jī)械械法法分分離離胚胚胎胎 （一）取材（一）取材 基本步驟：無菌取出目的組織基本步驟：無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成用利刀無菌切割成1 12mm2mm小塊小塊 以以HanksHanks液漂洗干凈液漂洗干凈, ,低速離心，棄上清低速離心，棄上清 移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)1801800 0，置，置15153030分，使其貼壁分，使其貼壁 培養(yǎng)瓶翻回，置于培養(yǎng)瓶翻回，置于3737培養(yǎng)培養(yǎng)（1）組織塊培養(yǎng)）組織塊培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法 a：取材修剪沖洗：取材修剪沖洗b：剪切成：剪切成1mm3左右的小塊左右的小塊c：移入培養(yǎng)瓶

13、：移入培養(yǎng)瓶d：分布組織小塊間距：分布組織小塊間距5mme：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37靜止靜止1-2hf：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)g：原代細(xì)胞生長：原代細(xì)胞生長 取材分離和組織消化取材分離和組織消化 無菌取出目的組織無菌取出目的組織 用利刀無菌切割成細(xì)塊用利刀無菌切割成細(xì)塊 胰蛋白酶液消化胰蛋白酶液消化 Hanks Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清液漂洗兩次，低速離心棄上清 吸管吹打分散細(xì)胞吸管吹打分散細(xì)胞 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)(2)組織消化培養(yǎng)組織消化培養(yǎng) 加入加入30-50倍體積倍體積0.25%濃度胰蛋白酶溶液濃度胰蛋白酶溶液3737消

14、化消化30-60min30-60min，每，每5-10min5-10min搖動一次搖動一次相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點選擇使用特點選擇使用基本步驟：基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混和液混和液 (以能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)）以能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn)） 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計數(shù)吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計數(shù) 重新接種重新接種

15、于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)1）貼壁生長細(xì)胞傳代）貼壁生長細(xì)胞傳代 培養(yǎng)培養(yǎng)2）懸浮生長細(xì)胞傳代）懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代離心法傳代 直接傳代法直接傳代法 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分-800g）去）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除將上清培養(yǎng)液去除l2一一23，然后用，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于傳統(tǒng)方法：冷存管置于410分鐘分鐘 -2030分鐘分鐘 -801618小時小時(或

16、隔夜或隔夜)液氮槽長期儲存。液氮槽長期儲存。-20不可超過不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1-3/分鐘分鐘之速度由室溫降至之速度由室溫降至(-80以下以下)-120，再放在液氮長期儲存。，再放在液氮長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。之保存。 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶滾動培養(yǎng)瓶滾動培養(yǎng)瓶6、克隆培養(yǎng)法、克隆培養(yǎng)法就是將

17、細(xì)胞懸液中獲得的單個細(xì)胞用于培養(yǎng)就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)技術(shù) 過程過程:制細(xì)胞懸液制細(xì)胞懸液連續(xù)稀釋獲得單細(xì)胞連續(xù)稀釋獲得單細(xì)胞單細(xì)胞接種單細(xì)胞接種培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞株細(xì)胞株 :由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。 固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)2 2、懸浮培養(yǎng)技術(shù)、懸浮培養(yǎng)技術(shù)適于少數(shù)懸浮生長型細(xì)胞適于少數(shù)懸浮生長型細(xì)胞微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟 p110選擇合適的微載體類型選擇合適的微載體類型浸泡水化及消毒浸泡水

18、化及消毒接種接種培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計數(shù)培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計數(shù)消化消化分離細(xì)胞分離細(xì)胞傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)交聯(lián)葡萄糖交聯(lián)葡萄糖DEAE-DEAE-纖維素纖維素蛋白質(zhì)：變性膠原蛋白質(zhì)：變性膠原高分子材料：硅膠、聚丙烯酰高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯胺、聚苯乙烯無機(jī)玻璃基質(zhì)無機(jī)玻璃基質(zhì)常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 n多孔載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點：易固定化、比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長，免受機(jī)械損傷；可優(yōu)點：易固定化、比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長，免受機(jī)械損傷；可以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞固定化連以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。適用于

19、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。多孔載體材料要求：生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性多孔載體材料要求：生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性（三）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式（三）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 1.分批式操作分批式操作 2.流加式操作流加式操作 3.半連續(xù)式操作半連續(xù)式操作 4.連續(xù)式操作連續(xù)式操作 5.灌流式操作灌流式操作 優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險小。優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險小。缺點：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大缺點：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低.優(yōu)點：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下優(yōu)點：