現(xiàn)場---氯乙烯

1、現(xiàn)場氯乙烯一 胞質(zhì)阻滯微核實驗1.2.3胞質(zhì)阻滯微核試驗（CBMN）主要材料與儀器RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco）、青霉素和鏈霉素 (Hyclone)、胎牛血清 (Gibco)、細胞松弛素B（Sigma）、植物凝集素PHA(國產(chǎn))、甲醇（分析純）、冰醋酸（分析純）、氯化鉀（分析純）、Giemsa染液（Sigma）、二甲基亞砜DMSO(Sigma)、載玻片（經(jīng)玻璃清洗液清洗后、泡酸24小時、蒸餾水沖洗至少6遍，置于4蒸餾水中備用）、CO2恒溫培養(yǎng)箱 (Thermo)、離心機 (Thermo)、六孔板、15ml離心管（corning）、顯微鏡。試劑配制1）完全164

2、0培養(yǎng)基：10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100和/mlm鏈霉素，1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分裝，4保存?zhèn)溆谩?）細胞松弛素B應(yīng)用液(細胞松弛素B C29H37NO3 是從真菌類Helminthosporium demariodeum中分離得到的代謝產(chǎn)物。是以希臘語的cytos（細胞）和chalasis（松弛）組合而命名的。在許多動植物細胞的細胞運動中，特別是可逆地抑制同微絲系有關(guān)的現(xiàn)象。例如在0.51.0微克/毫升濃度下作用24小時，會使鼠的培養(yǎng)纖維芽細胞只進行核分裂，而細胞質(zhì)的分裂受到抑制，從而成為多核細胞。)用DMSO將粉末狀細胞松弛素B（Cytochalasins B, Cyto-B）

3、溶解，用無菌生理鹽水稀釋，配成存儲液；用無菌生理鹽水稀釋至151.5ug/ml，配制成應(yīng)用液，-20，避光保存，備用。3）植物凝集素PHA每支PHA粉末用2ml無菌生理鹽水溶解，每4ml培養(yǎng)基加入0.2mlPHA溶液，混勻。4）0.075mmol/L氯化鉀低滲液1.1175mg氯化鉀，加200ml雙蒸水混勻，37預(yù)熱，備用。5）固定液甲醇（預(yù)冷）：冰醋酸(v:v)=3:1，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，4預(yù)冷備用。6）10%Giemsa染液Giemsa原液:PBS(v:v)=1:9,混勻，過濾備用 實驗方法經(jīng)過研究對象的知情同意，在采集血樣做血常規(guī)、血生化等項目的同時，采取外周靜脈血1ml，置

4、于肝素抗凝管內(nèi)，常溫保存，4小時內(nèi)運至實驗室。1）鋪6孔板：每孔加入0.5ml 新鮮肝素抗凝全血和4.5ml含PHA的1640完全培養(yǎng)基，混勻后置于37，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)44h。2)加細胞松弛素B：每孔加入200ul應(yīng)用液，輕柔地吹打混勻，終濃度為6ug/ml。3）繼續(xù)培養(yǎng)至72h，收獲細胞。4）培養(yǎng)細胞收獲收集細胞至15ml離心管，800rpm，離心10min，棄上清；加入37預(yù)熱的低滲液4ml,輕柔混勻，37水浴4min，加入固定液4ml,立即混勻，固定5min，800 rpm，離心10min，棄上清；再加入固定液5ml,立即混勻，固定10min，800 rpm，離心10min，棄上

5、清； 復(fù)步驟；滴入少許新鮮固定液，重懸細胞，吹打混勻，細胞懸浮液呈均勻的半透明狀； 細胞懸液從10cm高度滴到冷水浸過的載玻片上，室溫干燥 Giemsa染液染色7min,自來水沖洗，晾干，待檢5）鏡檢低倍鏡下找到有細胞的視野，轉(zhuǎn)至高倍鏡觀察，計數(shù)1000個細胞膜完整、細胞核邊界清晰的雙核細胞，并計數(shù)出現(xiàn)微核的雙核細胞數(shù)。微核的判定標準73：細胞完整、邊界清晰可辨；雙核理想狀態(tài)下不能重疊，若兩核重疊，在核邊界能分辨清楚的情況下仍可計數(shù)為雙核細胞；微核直徑為主核的1/16-1/3；微核染色與主核一致，顏色可略淺，有較明顯的邊界，若不能判斷可換油鏡以確認；微核不能折光，以與染料顆粒區(qū)分。計數(shù)1000

6、個雙核淋巴細胞中含一個、兩個或多個微核的細胞數(shù)，算出雙核微核細胞率（）。圖2-1-2為正常的含有一個微核的雙核淋巴細胞（1000×）。二問卷三指標檢測mRNA和microRNA: 1.2 實驗材料和方法（所有操作均在超凈工作臺內(nèi)完成）1.2.1 試劑和儀器人外周血淋巴細胞分離液（購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司）裂解液MZ （購自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA提取分離試劑盒（DP501，離心柱型，購自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR201，購自天根生化科技（北京）有限公司）miRNA 熒光定量檢測試劑盒（FP401，購自天根生化

7、科技（北京）有限公司）氯仿（分析純）無水乙醇（分析純）離心機熒光定量96孔10ul 反應(yīng)板（Thermo）Real time PCR儀（PikoReal96, Thermo）Eppendorf 微量移液器1.2.2 樣品處理取新鮮肝素抗凝血1ml, 加滅菌生理鹽水1ml 混勻后，緩慢小心地加入2ml人外周血淋巴細胞分離液。400g 離心20min。離心管分4層，從上至下分別為血漿層、淋巴細胞層、分離液層和紅細胞層。用槍頭小心地吸取環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，置于1ml的裂解液MZ中混勻，-80低溫保存，備用。1.2.3 Total RNA的提取實驗步驟按照miRNA提取分離試劑盒說明書進行。取上述樣

8、品300ul 加600 ul裂解液MZ，振蕩器震蕩混勻。將混勻后的樣品在室溫放置5min，以使核酸蛋白復(fù)合物分離完全。 4 12，000 rpm 離心5min，取上清，轉(zhuǎn)入一個新的RNase-Free 的離心管。加入氯仿200ul, 蓋好管蓋，劇烈振蕩15sec，室溫放置5min。 4 12，000 rpm 離心15min，樣本共分3層，從上至下分別為黃色的有機相、中間層和無色的水相。因RNA主要在水相中，故將水相轉(zhuǎn)移到新管中。量取轉(zhuǎn)移液體積，約為400ul，緩慢加入其體積1.5倍的無水乙醇600ul，混勻。將溶液和所產(chǎn)生的沉淀一并轉(zhuǎn)入吸附柱miRspin中，室溫12,000 rpm 離心30

9、sec，棄掉流出液，保留吸附柱。向吸附柱miRspin加入500ul去蛋白液MRD (已加乙醇)，室溫靜置2min后，室溫 12,000 rpm 離心30sec，棄掉流出液，保留吸附柱。向吸附柱miRspin加入500ul漂洗液RW (已加乙醇)，室溫靜置2min后，室溫 12,000 rpm 離心30sec，棄掉流出液，保留吸附柱。重復(fù)操作。將吸附柱 miRspin放入2ml收集管中，室溫 12,000 rpm 離心1min，以去除殘余液體。離心后將柱子置于超凈工作臺上通風1min，充分去除漂洗液。將吸附柱 miRspin 轉(zhuǎn)入一個新的RNase-Free 的離心管中，加30ul RNase

10、-Free ddH2O，室溫放置2min，室溫 12,000 rpm 離心2min。1.2.4 miRNA cDNA第一鏈合成實驗步驟按照miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行。 實驗原理采用加尾反轉(zhuǎn)錄法。利用Poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上多聚Poly(A)尾，用在5端具有Universal Tag序列的Oligo-dT作為反轉(zhuǎn)錄的引物，獲得人為加長的miRNA cDNA第一鏈，最后利用與Universal Tag序列反向互補的引物進行SYBR Green I 的熒光定量PCR檢測。 miRNA 3末端加Poly(A)尾處理 在冰上預(yù)冷RNase

11、-Free的反應(yīng)管，按表3-1加入試劑，總體積為20ul。其中，E.coli Poly(A)Polymerase最后加入。表3-1 Poly(A)尾處理反應(yīng)體系試劑組分體積（ul）終濃度Total RNA5-E.coli Poly(A)Polymerase(5U/ul)0.42U10×Poly(A)Polymerase Buffer21×5×rATP Solution41×RNase-Free ddH2O8.6- 用移液器輕輕混勻上述配置的反應(yīng)液，短暫離心后在37反應(yīng)60min。所得反應(yīng)液直接進行逆轉(zhuǎn)錄處理。 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照表3-2配置反應(yīng)

12、體系，總體積為20ul。表3-2 miRNAs逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系試劑組分體積（ul）Poly(A)反應(yīng)液210×RT Primer210×RT Buffer2Super Pure dNTPs (2.5mM each)1Rnasin(40U/ul)1Quant RTase0.5RNase-Free ddH2O11.5 用移液器輕輕混勻上述配置的反應(yīng)液，短暫離心后在37反應(yīng)60min。將合成的cDNA反應(yīng)液分裝，一部分直接進行熒光定量檢測，另一部分置于-80低溫保存，備用。1.2.5 miRNA熒光定量檢測實驗步驟按照miRNA 熒光定量檢測試劑盒說明書進行，每個樣品做三個復(fù)孔。R

13、eal-time qPCR反應(yīng)體系及擴增條件（SYBR Green I染料法）在冰上，按照表配置PCR反應(yīng)體系，總體積為10ul。其中2其中l(wèi)，總體積為n ICR，使用前上下顛倒輕輕混合均勻，避免氣泡，并經(jīng)輕微離心后使用。表3-3 熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑組分體積（ul）終濃度2×miRNA Premix (含SYBR Green I)51×Forward Primer*0.2200 nMReverse Primer0.2200 nMmiRNA 第一鏈cDNA 1-ddH2O3.6-注*: 6種miRNA的引物見表3-4。表3-4 6 種miRNAs引物及芯片篩選結(jié)果mi

14、RNA名稱序列Tm值芯片結(jié)果chsa-let-7d-5paAGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU60上調(diào)hsa-let-7i-5paUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU60上調(diào)hsa-miR-24-3paUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG60上調(diào)hsa-miR-146a-5pbUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU60下調(diào)hsa-miR-222-3pbAGCUACAUCUGGCUACUGGGU60下調(diào)hsa-miR-151-5pbUCGAGGAGCUCACAGUCUAGU60下調(diào)注：a:染色體損傷組與非損傷組差異表達miRNA分子；b:不同VCM接觸量差異表達mi

15、RNA分子；c: 根據(jù)2013年同廠研究對象的miRNA芯片篩選結(jié)果，差異表達采用Deseq算法。封好96孔板，2500rpm離心1min后，置于Real time PCR儀中。設(shè)定反應(yīng)程序：94起始模板變性2min后，94變性20sec，60退火延伸34sec，40個循環(huán)。 該軟件自動設(shè)置基線，并報告出循環(huán)數(shù)Ct值（threshold cycle）。擴增反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線以檢測PCR擴增產(chǎn)物的特異性。miRNA的表達采用相對定量2-Ct法，Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參，內(nèi)參基因為5S。1.3靶基因預(yù)測和生物功能富集分析利用下列三種軟件預(yù)測miRNA分子可能發(fā)揮作用的靶基因：TargetScan(),PicTar ()和MicroCosm Targets(http:/ww