茶樹在冷馴化過程中的全基因表達(dá)譜

1、茶樹在冷馴化過程中的全基因表達(dá)譜摘要：茶樹需要進(jìn)行冷馴化過程來增強(qiáng)其在冬季的抗寒性。我們對(duì)于茶樹在低溫下分子 水平方面的改變知之甚少。為了闡明冷馴化的分子機(jī)制，我們采用RNA測(cè)序和數(shù)字基因表達(dá)技術(shù)（DGE）來研究在茶樹冷馴化過程中的全基因組表達(dá)譜。使用Illumina公司測(cè)序平臺(tái)，我們獲得了約5735萬(wàn)的RNA序列讀取。這些讀取組合成216831轉(zhuǎn)錄譜，平均長(zhǎng)度為365bp , N50的平均長(zhǎng)度為529bp?？偟膩碚f，1770個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄被確定，其中1168個(gè)上調(diào)表達(dá)和602個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些包括一組冷傳感器或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，冷反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因， 等離子體膜穩(wěn)定相關(guān)基因，化學(xué)反應(yīng)應(yīng)答基因和解毒

2、酶基因。DGE和定量RT-PC的析進(jìn)一步證實(shí)RNA序列分析結(jié)果，通路分析表明在茶樹冷脅迫的反應(yīng)中碳水化合物的代謝途徑和鈣信號(hào)通路”可能發(fā)揮重要作用。針對(duì)茶樹對(duì)于低溫，非結(jié)冰溫度的反應(yīng)我們的研究提出了轉(zhuǎn) 錄譜的全面調(diào)查和茶樹在寒冷馴化過程分子機(jī)制在產(chǎn)量的見解的全面調(diào)查。它也可以作為耐冷性相關(guān)研究的寶貴資源，有助于提高對(duì)于冷相關(guān)基因耐低溫和植物與環(huán)境的相互作用的理 解。關(guān)鍵詞：茶樹；冷馴化；RNA序列；全基因組表達(dá)譜 1.緒論低溫是溫帶植物在其生命周期必須應(yīng)對(duì)的最重要的環(huán)境因素之一。有些植物在暴露于低溫但不結(jié)冰的溫度下生存一段時(shí)間之后可以提高他們的抗凍性，這個(gè)過程被稱為冷馴化 （CA）1。CA是一

3、個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到細(xì)胞、生理、代謝和分子修飾。當(dāng)植物感知寒冷溫度的 時(shí)候，一系列的保護(hù)機(jī)制被引發(fā)2-4。這些包括重置蜂窩框架、等離子體的結(jié)構(gòu)和功能的交替組成、合成抗凍劑的分子如可溶性糖，糖醇和低分子量的含氮化合物、降低自由水含量的比值、提高活性氧（ROS的清除作用、并引入抗凍蛋白。這些變化幫助植物在低溫下維持 物質(zhì)和能量的代謝平衡。對(duì)于上述的變化報(bào)道了一組冷相關(guān)基因2-7 o此外，在大范圍植物物種冷馴化中基因表達(dá)的改變已經(jīng)被證明了，數(shù)百的冷誘導(dǎo)基因也已經(jīng)確定了8。茶是世界上最流行的非酒精性飲料，而且茶樹是中國(guó)，印度， 斯里蘭卡，肯尼亞等其他國(guó)家最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一 9。作為一種常綠木本植物，

4、茶樹可以在熱帶和亞熱帶氣候生 長(zhǎng)。由于氣候變化， 茶樹必須應(yīng)對(duì)冬季的低溫。低溫是一個(gè)最關(guān)鍵的環(huán)境因素，可以限制其 增長(zhǎng)，生存和地理分布10。因此，尋求提高植物對(duì)低溫抗性的方法是很重要的。像其他多 年生常綠木本作物，在冷馴化過程中，茶樹的抗寒性隨著溫度的降低而增強(qiáng)，隨著溫度的增加而減小。先前的研究表明，當(dāng)平均氣溫下降到7。C左右，茶樹經(jīng)過 CA進(jìn)程，并在平均氣溫增加超過9。C,茶樹啟動(dòng)馴化過程11。在茶樹冷馴化過程中很少有集中于細(xì)胞，生理和代謝變化的研究。當(dāng)茶樹經(jīng)過CA過程，增加?xùn)艡诮M織厚度和增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。此外，胞漿和束縛水比的濃度， 細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸和總蛋白量，葉片可溶性蛋白的含量

5、都增加了。同時(shí)，一些解毒酶的活性增加了，如過氧化氫酶（CAT）,超氧化物歧化酶（SOD）,過氧化物酶（POD）和酯酶（EST,而代謝活性降低11。茶樹中一些冷誘導(dǎo)基因 已被克隆13,14。作為一個(gè)復(fù)雜的生物現(xiàn)象，茶樹抵抗低溫的能力被一系列復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因調(diào)控15。使用組學(xué)”的研究策略去理解茶樹 CA機(jī)構(gòu)是提高茶葉產(chǎn)量和地理分布的關(guān)鍵。 RNA序列是最近開發(fā)的方法，它是使用大規(guī)模并行測(cè)序策略生成的轉(zhuǎn)錄譜。它已成為高通量序列測(cè)定的一種有效方法，能夠空前地提高效率和基因發(fā)現(xiàn)的速度16,17。數(shù)字基因表達(dá)（DGE）是一種基于標(biāo)簽根據(jù)短標(biāo)簽所產(chǎn)生的核酸內(nèi)切酶的測(cè)序方法?；蛟跇颖局械谋磉_(dá)水平是通過計(jì)算每

6、個(gè)轉(zhuǎn)錄組生成的標(biāo)簽數(shù)量而衡量的18。這項(xiàng)研究表明，使用RNA序列和DGE相結(jié)合的方式研究茶樹的轉(zhuǎn)錄譜的首次嘗試，從而獲得一個(gè)更深入的 CA的分子機(jī)制。從茶樹中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄譜不僅有助于深入了解參與冷馴化過程的基因，也提高了我們對(duì)植物與環(huán)境的相互作用的理解。.材料與方法耐低溫試驗(yàn)和 RNA的制備茶樹品種（L.） O.Kuntze CV,龍井43種在中國(guó)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)（CNGHTR杭州茶茶葉研究 所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院。2010年10月開始，到2011年3月被選定在每10-15天（當(dāng)平均溫度高于15。C）摘取完整的成熟的葉子。所有的樣品用去離子水沖洗并且分為兩個(gè)部分，一 部分采用液氮在？80。C存儲(chǔ)快速凍結(jié)，

7、另一部分使用電解液泄漏試驗(yàn)評(píng)價(jià)耐低溫。純植物 提取試劑盒被用來進(jìn)行總RNA提取，Agilent 2100生物分析儀被用來 RNA完整性測(cè)試其完整價(jià)值至少為8。低溫耐受性從葉子的樣品中測(cè)定了，葉子樣品電解液泄漏檢測(cè)與以前的研究類似。簡(jiǎn)而言之，葉子用去離子水沖洗。葉樣品（直徑 5 mm）用打孔機(jī)和葉的中脈中排除。葉子樣品 （0.5 g）被放置在封閉含有去離子水20毫升的小瓶，分別在 25 C在旋轉(zhuǎn)才床搖24 h。然后測(cè)定溶液的電導(dǎo)率（L1）。EL （相對(duì)電導(dǎo)率）白定義如下：EL （%） = （L1/L2X 100%）。文庫(kù)的制備與RNA序歹U對(duì)RNA序列的樣品的制備使用Illumina公司的試劑盒

8、并且遵循制造商的建議?？傊?，mRNA從總RNA純化20科g,用Oligo （dT）磁珠，其次是碎片，其mRNA被高溫下使用的二價(jià)陽(yáng)離子分割成小碎片。裂解的RNA片段被用來進(jìn)行合成 cDNA第一鏈，使用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物后通過使用 DNA聚合酶I和RNase H合成第二鏈cDNA。最后的修復(fù)過程和連接電 源適配器，產(chǎn)物通過 PCR被富集了，從而形成最終的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)從5和3端使用Illumina HiSeq（tm）2000平臺(tái)根據(jù)制造商的指示劑進(jìn)行測(cè) 序。熒光圖像處理，是由 Illumina數(shù)據(jù)管道1.4行處理基地呼叫和質(zhì)量值的計(jì)算，讀取其中 290 bp的配對(duì)末端。短RNA序列數(shù)

9、據(jù)讀取在我們的研究中， 我們從茶樹的三個(gè)樣品中采用RNA序列，在CA的過程中代表三個(gè)關(guān)鍵階段的，三個(gè)的樣品包括CA1, CA3和CK我們稱這些數(shù)據(jù)集1。我們的RNA序列數(shù)據(jù)集的訪問代碼是SRA06104&以前的研究報(bào)告了茶樹白轉(zhuǎn)錄組，讀取來自 Illumina格爾平臺(tái) 產(chǎn)生的75 bp的配對(duì)末端，我們稱這個(gè)數(shù)據(jù)集2。它是srx020193的加入代碼，包括七種不同的組織采取樣品：茶樹的嫩枝，嫩葉，成熟葉，莖，年輕的根，花蕾和未成熟種子21。預(yù)處理和從頭組裝原始數(shù)據(jù)從頭組裝之前進(jìn)行預(yù)處理：劣質(zhì)的核甘酸（我們定義的核甘酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)小 于20的低質(zhì)量的核甘酸） 在過去的20個(gè)周期，模糊不清的核甘酸在前

10、五次循環(huán)中被自定義 的Perl腳本修剪。經(jīng)過預(yù)處理后，共獲得 4.96 G堿基（GB）, 1.90 GB和6.86 GB質(zhì)量過濾 短讀取分別為數(shù)據(jù)集 1,數(shù)據(jù)集2和數(shù)據(jù)集3。從頭組裝的這三個(gè)數(shù)據(jù)集分別被“三位一體分開20。去除冗余一些亞型通過三位一體的重建了，使用具有相同的只有小的變化的蛹組件和蝶子組件，如單核甘酸多態(tài)性，小的插入或缺失等變異；裝配結(jié)果冗余。CD-HIT-EST記錄超過99% 的同源性完全覆蓋的時(shí)候用來去除較短的冗余轉(zhuǎn)錄。這套轉(zhuǎn)錄本用于進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)的基本組件和下游分析?；蜃⑨尯头诸愃械姆侨哂嗟霓D(zhuǎn)錄 （R 100 bp）用于搜索和 NR, uniref90 22 , TAIR

11、10, KEGG（58版） 23和KOG 24 的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過 BLASTALL包（釋放2.2.22）與電子W 10顯著閾值5。每一個(gè)已知基因同源的擊中是最好的解析和分配?；虮倔w論（GO）是基于使用Blast2go軟彳nr數(shù)據(jù)庫(kù)達(dá)到最佳比對(duì)分配（版本 2.3.5） 25與10 - 5值閾值記錄每個(gè)轉(zhuǎn)錄本?；?下列順序Blastx分析結(jié)果確定了組裝轉(zhuǎn)錄的ORF： NR, uniref90 , KEGG KOG從對(duì)齊的區(qū)域的兩側(cè)延伸，使用自定義的 Perl腳本的標(biāo)準(zhǔn)密碼表，編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列。對(duì) 于那些沒有任何已知的基因轉(zhuǎn)錄撞到數(shù)據(jù)庫(kù)，利用軟件bestorf訓(xùn)練有素的擬南芥 EST參數(shù)

12、的預(yù)測(cè)是最好的潛在的編碼區(qū)。預(yù)測(cè)的氨基酸序列已提交搜索對(duì)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)域或家庭使用HMMER 3注釋，用最好的比賽級(jí)協(xié)議。優(yōu)化允許重疊匹配的方法是用來解決復(fù)雜的重疊的蛋白結(jié)構(gòu)域。數(shù)字基因表達(dá)三樣品的標(biāo)簽庫(kù)的制備使用Illumina基因表達(dá)的樣品制備試劑盒平行執(zhí)行。簡(jiǎn)單，從每個(gè)樣本總RNA 6 G用于磁寡捕捉 mRNA （ DT）珠。第一和第二鏈 cDNA的合成。珠結(jié)合 cDNA隨后被消化與 NlaIIL cDNA片段3端分別與磁珠純化，和 Illumina適配器1連接到5 末端。實(shí)時(shí)定量 PCR （qRT-PCR分析為了驗(yàn)證 RNA序列和DGE實(shí)驗(yàn)的可靠性，28個(gè)轉(zhuǎn)錄本用于進(jìn)行定量 PCR （

13、qRT-PCR 檢測(cè)。RNA（1G）的每個(gè)樣品用 DNase I處理，然后用實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒進(jìn)行以下參數(shù)： 95 C 時(shí) 30 S, 94 C 15 S 40 次，60 C為 34 秒。使用 Applied Biosystems 7300 序列檢測(cè) 系統(tǒng)測(cè)定熒光強(qiáng)度。 每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行一式三份，為了保證用于qRT-PCR驗(yàn)的參考基因的穩(wěn)定性，我們?cè)诶漶Z化過程分析了4個(gè)常用的管家基因的基因表達(dá)的穩(wěn)定性。正如之前有人報(bào)道，我們的研究結(jié)果還表明，18S RNA基因是最穩(wěn)定的表達(dá)水平不變，最后被選為本研究的參考 基因。在三個(gè)樣本的基因相對(duì)表達(dá)的計(jì)算采用2?A ACT前面描述的方法。CK樣本的實(shí)時(shí)熒光

14、定量PCR的結(jié)果將基因表達(dá)的相對(duì)變化，因此，CK樣本對(duì)CK的相對(duì)值為1,相對(duì)值的CA1和CA3區(qū)樣本進(jìn)行歸一化處理。所有的數(shù)據(jù)都顯示為平均土SD和所有的引物信息。.結(jié)果與討論 3.1CA過程中茶葉植物耐冷性的變化茶樹抗寒性的變化在不同溫度下，可以使用電解液泄漏檢測(cè)的相對(duì)電導(dǎo)率監(jiān)測(cè)。例如一個(gè)完整的CA的自然過程，溫度變化周期從2010十二月至2011三月。在十二月一日之前，室外平均溫度（五天）在 10 C以上，茶樹葉片的相對(duì)電導(dǎo)率（CK在 100%,表明茶樹具有低水平的耐冷性。茶樹經(jīng)過一段時(shí)間后，在相對(duì)低的溫度下 （ 10。C）,其相對(duì)電導(dǎo)率下降，茶樹的抗寒性增強(qiáng)。當(dāng)溫度下降到最低點(diǎn)，相對(duì)電導(dǎo)率

15、也達(dá)到最低水平，耐冷性是在最高水平（CA1）。后來，溫度上升，當(dāng)平均溫度達(dá)到10 C以上，相對(duì)電導(dǎo)率增加到80%,然后保持在較高的水平。茶樹是后來去馴化（CA3）,其耐冷性弱。在CA的過程中獲得的冷環(huán)境的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，我們從三個(gè)階段選擇了茶樹葉片，非馴化（CK）,完全馴化（CA1）和去馴化（CA3）,用于RNA序列和數(shù)字基因表達(dá)（DGE）的研究。RNA序列和從頭組裝我們使用Illumina hiseq2000基因組分析儀進(jìn)行 RNA序列分析海馬 CA1, CA3和CK。完 全，57350000配對(duì)末端長(zhǎng)為90 bp。由于低質(zhì)量的核甘酸從兩端讀可能導(dǎo)致不正確的組件輸 出19,我們削減了劣質(zhì)的或模糊的

16、核甘酸在兩端的讀取。使用三位一體從頭組裝和修剪進(jìn) 行讀取20。三位一體”是專門為從頭組裝的短 RNA序列讀取數(shù)據(jù)，這已被證明是最好的單 劑匯編19,20?？偟膩碚f，226026的轉(zhuǎn)錄被重建了。在先前的研究描述中去除小的變化引 起的冗余的轉(zhuǎn)錄后19,獲得了最后一組 216831個(gè)轉(zhuǎn)錄本。平均記錄大小為356 bp,與N50 的平均記錄為529 bp。Shi等人先前的研究報(bào)告了茶樹的轉(zhuǎn)錄組21。他們生產(chǎn)的RNA序列數(shù)據(jù)是使用Illumina的GA IIX （以下簡(jiǎn)稱數(shù)據(jù)集 2）從混合組織茶樹得到的。組合數(shù)據(jù)集的1和2也被生成了，我們稱之為數(shù)據(jù)集的 3,茶樹占所有可用的 RNA序列數(shù)據(jù)。短的讀取數(shù)據(jù)

17、集2和集3按上述程序進(jìn)行處理，然后分別用于從頭組裝。數(shù)據(jù)集的1匯編結(jié)果達(dá)到最長(zhǎng)的平均讀長(zhǎng)和N50,而從數(shù)據(jù)集的3的收益率的成績(jī)單和總的堿基對(duì)數(shù)量是最多的。為了在從頭組裝中分別評(píng)價(jià)短讀的使用效率，我們將RNA序列讀取回到三套重建的成績(jī)單，從數(shù)據(jù)集的1達(dá)到最佳性能生成轉(zhuǎn)錄，并為我們的短最高映射比讀。超過10%的短讀取失敗，只有數(shù)據(jù)集2進(jìn)行從頭組裝，表明冬蟲夏草以前的轉(zhuǎn)錄組序列是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有飽和。雖然越來越多的轉(zhuǎn)錄組序列，使用數(shù)據(jù)集3而不是數(shù)據(jù)集1可以產(chǎn)生從頭組裝，測(cè)繪率無法提高，表明從數(shù)據(jù)集3中的額外轉(zhuǎn)錄是比其他茶植物的葉組織是最有可能轉(zhuǎn)錄的。因此，這些額外的轉(zhuǎn)錄是無法貢獻(xiàn)于研究?；谶@種情況，我們選

18、擇了從數(shù)據(jù)集 1的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行下游分析。 3.1.2茶樹的轉(zhuǎn)錄組功能注釋預(yù)測(cè)和分析裝配的轉(zhuǎn)錄功能，非冗余序列提交到BLASTX（E值 10 - 5）搜索以下數(shù)據(jù)庫(kù)：NCBI的nr數(shù)據(jù)庫(kù)，uniref90 22,擬南芥信息資源（TAIR,版本10）,京都基因與基因 組百科全書（KEGG 58版）23和同源7真核基因組集群（KOG 24。我們發(fā)現(xiàn)所有的有 顯著的同源基因非冗余基因三分之一在 NR或uniref90數(shù)據(jù)庫(kù)中。擬南芥是研究雙子葉植物中，一個(gè)完整的參考基因組和全面的注釋基因序列。一個(gè) BLAST搜索，對(duì)擬南芥的基因產(chǎn)生更多明確的注釋，幫助我們?cè)u(píng)估其質(zhì)量和覆蓋我們的組裝 轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，1

19、6882個(gè)擬南芥基因位于五染色體上被60392個(gè)轉(zhuǎn)錄本均勻覆蓋了。BLAST分析的組裝轉(zhuǎn)錄本與 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)表明，21194轉(zhuǎn)錄本注明相應(yīng)的酶委員會(huì)（EQ的 數(shù)量和分配的參考標(biāo)準(zhǔn)的KEGG通路。針對(duì)KOG數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道41341轉(zhuǎn)錄本有最好的命中時(shí)，e值小于或等于10 - 5的搜索。由于一些轉(zhuǎn)錄本可以分配多個(gè)KOG的功能，共46291功能注釋的生產(chǎn)和所有記錄分為 25大類?？偟膩碚f，72967的轉(zhuǎn)錄得到最好的擊中與已知蛋白在五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)和16430個(gè)轉(zhuǎn)錄本的蛋白質(zhì)相似至少一個(gè)已經(jīng)在所有的五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。組裝轉(zhuǎn)錄的功能分類，基因本體論（GO）24的條款被分配到基于使用25NR數(shù)據(jù)庫(kù)Blast2g。使每個(gè)

20、轉(zhuǎn)錄本達(dá)到最佳比對(duì)。NR的詮釋源自71289的轉(zhuǎn)錄，30115轉(zhuǎn)錄本分配到80176GO,三個(gè)主要的 GO類別包括生物工藝術(shù) 語(yǔ)注釋，細(xì)胞成分，分子功能。如果一個(gè)基因中的保守結(jié)構(gòu)域，域的信息對(duì)于解釋基因的功 能是有用的。在領(lǐng)域內(nèi)注釋潛在重建的序列，其開放閱讀框（ORF）被每個(gè)記錄（方法）所預(yù)測(cè)，然后所有基因的ORF預(yù)測(cè)用于搜索和對(duì) Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)基于隱馬爾可夫模型的方法。總的來說， 41599的轉(zhuǎn)錄被分配的 PFAM域信息和被分為4504個(gè)領(lǐng)域/家庭。大多數(shù)域/家庭被發(fā)現(xiàn)含有 少量的轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)茶樹包含在每個(gè)PFAM域轉(zhuǎn)錄的發(fā)生頻率，Pfam域進(jìn)行排名和排名前10豐富的域/家庭，命中結(jié)果類似于

21、以前的研究21。這些域/家庭中，蛋白激酶結(jié)構(gòu)域及其類蛋白酪氨酸激酶”是眾所周知的多數(shù)調(diào)節(jié)細(xì)胞通路。富亮氨酸重復(fù)域的蛋白經(jīng)常參與蛋 白-蛋白質(zhì)相互作用，PPR重復(fù)作為多功能植物中一個(gè)大的蛋白質(zhì)家族已經(jīng)被報(bào)道了26。此外，NB-ARC”的蛋白家族，具有很高的代表，其中包括耐藥蛋白。其他的蛋白質(zhì)家族，也在 前十位的發(fā)現(xiàn)，如逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA識(shí)別基序，已在植物中有一些基本功能。三位一體”生產(chǎn)的所有潛在的選擇性剪接異構(gòu)體的從頭組裝過程中，和異構(gòu)體起源于我們選擇了最長(zhǎng)的成績(jī)單中，每個(gè)位點(diǎn)得到單基因組，導(dǎo)致 179753個(gè)。同一基因位點(diǎn)被假定 為共享相同的蛹成分，蝴蝶的子組件和一些在De Bruijn圖的路徑

22、。我們選擇了每個(gè)位點(diǎn) 得到單基因組最長(zhǎng)的成績(jī)單中，得到179753個(gè)結(jié)果。三位一體的潛在的亞型在每個(gè)位點(diǎn)的報(bào)道的陣列/引物定量基因表達(dá)和未來的設(shè)計(jì)選擇性剪接分析會(huì)有用的。冷馴化過程中相關(guān)基因的鑒定重建轉(zhuǎn)錄本的分幅度預(yù)測(cè)被RSEM軟件包決定了，已被證明有效地使用模糊映射讀取并準(zhǔn)確估計(jì)從頭組裝轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體豐度沒有參考的能力27。該DESeq包28和winflat程序被用來進(jìn)行初步鑒定差異表達(dá)基因。冷馴化相關(guān)基因是基于對(duì)每個(gè)基因確定豐度的倍數(shù)變化和相應(yīng)的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率，這導(dǎo)致 1770的差異表達(dá)基因。其中，1168個(gè)基因上調(diào)表達(dá)和 602個(gè)基 因下調(diào)表達(dá)，表明冷馴化過程中更多的基因被激活而不是被抑制。冷調(diào)

23、節(jié)或冷相關(guān)在這個(gè)相關(guān)基因差異表達(dá)列表中找到了，包括冷傳感器或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因， 細(xì)胞膜穩(wěn)定相關(guān)基因，化學(xué)應(yīng)答基因和解毒酶基因。冷傳感器或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在低溫的應(yīng)激反應(yīng)中起著舉足輕重的作用29。眾所周知，Ca2 +乍為調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信使在生長(zhǎng)和發(fā)育過程，和脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，即冷應(yīng)激30。冷應(yīng)激可激活的Ca2 + 通道，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2 + 水平，然后觸發(fā)磷脂酶 C和D,分別產(chǎn)生三磷酸 肌醇和磷脂酸。三磷酸肌醇可能進(jìn)一步放大的Ca2麗記，磷脂酸提出了一個(gè)基于膜的第二信使分子31,32 o隨后，許多信號(hào)通路被觸發(fā)，如Ca2 +賴的蛋白激酶（CDPKS ,絲裂原活

24、化蛋白激酶 （MAPK）, calcineurin B-like protein （CBD,鈣調(diào)素等。Doherty 等人33和 Yang 等人34發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子 （camta）和一種新的鈣/鈣調(diào)素調(diào)節(jié)受體激酶（crlk1 ） 對(duì)植物的耐冷性是至關(guān)重要的。Ca 2 +內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞被認(rèn)為是 CBF和COR基因的冷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游的發(fā)生的表達(dá)35,36。在這項(xiàng)研究中，13個(gè)基因，分別標(biāo)注為 CDPK CBL鈣調(diào) 素，camta,絲裂原活化蛋白激酶和磷脂酶，被確定為在低溫脅迫參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在這些基 因中，9 （4的鈣調(diào)素基因，2個(gè)CDPK基因，1個(gè)基因和2 camta磷脂酶基因）在海馬

25、 CA1 區(qū)上調(diào)表達(dá)，而4 （1磷脂酶基因，1的鈣調(diào)素基因，1個(gè)CBL基因和1下調(diào)MAPK基因）是 下調(diào)表達(dá)的。植物蛋白激酶屬于一個(gè)大家族，其中一些在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮核心作用，例如CDPKs和MAPKs。此外，越來越多的證據(jù)表明，受體激酶（ RLKS參與環(huán)境信號(hào)感知。組氨酸激 酶（HKS,是重要的信號(hào)分子被定位于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與了雙組分信號(hào)介導(dǎo)植物感知 的環(huán)境信號(hào)通路和調(diào)節(jié)下游環(huán)境脅迫的反應(yīng)。在這項(xiàng)研究中，27類受體蛋白激酶基因和2對(duì)HKs基因的差異表達(dá)，所有這些都在CA1區(qū)樣品中上調(diào)表達(dá)，暗示蛋白激酶在茶樹的冷馴化過程中發(fā)揮了重要作用。 3.2.2冷反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄因子（TF）在植

26、物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫而t受中發(fā)揮重要作用35。在冬蟲夏草中鑒定了58個(gè)假定的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因。這些轉(zhuǎn)錄因子可分為 9組（AP2/ERF, bHLH, MYB, WRKYNAC, bZIP轉(zhuǎn)錄因子，熱休克，GARS和鋅指蛋白）基于其擬南芥同源基因的分類，據(jù)報(bào)道 其中大部分在植物抗冷性有關(guān)。在這些轉(zhuǎn)錄因子，CA1區(qū)樣品上調(diào)的基因37個(gè)，21個(gè)下調(diào)基因。9組的轉(zhuǎn)錄因子中，鋅指蛋白是最豐富的TF家族，在58冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子中含有 31基因，18個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，13條基因表達(dá)下調(diào)。bHLH家族有5個(gè)基因（4個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)）， 在WRKY家族5個(gè)基因（4個(gè)上調(diào)和1個(gè)下調(diào)），在WRKY家族5個(gè)基因（3個(gè)上調(diào)和2

27、個(gè) 下調(diào)）和3基因NAC家族（1個(gè)上調(diào)和2個(gè)下調(diào)）。此外，在bZIP家族2個(gè)基因，在 GARS 家族3基因，2個(gè)編碼熱休克蛋白的基因均上調(diào)，而在CA1區(qū)樣品中AP2/ERF家族2個(gè)基因下調(diào)。發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因在 AP2/ERF家族是有趣的，這表明在冷馴化過程中的光照和溫度的相互 作用對(duì)植物有特殊的重要性。Catal a等人Jurczyk等人報(bào)道光照在擬南芥和羊茅草地早熟禾全冷馴化中是需要的?；蚺c細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和化學(xué)反應(yīng)質(zhì)膜被認(rèn)為凍結(jié)植物中一個(gè)主要的受傷部位。冷馴化過程能穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)和防止損傷。 在凍結(jié)溫度下，膜必須保持流體以維持膜蛋白和膜本身的功能活性。發(fā)生改變的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的組合物（例如膜脂的不

28、飽和度水平的增加）質(zhì)膜對(duì)冷馴化過程的反應(yīng)，這些都與抗凍性的增加有關(guān)。在我們的研究中，我們確定了3個(gè)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LTP）基因和1個(gè)脂肪酸去飽和酶（FAD）基因。其中，2個(gè)LTP基因和FAD基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)LTP基因表達(dá)下調(diào)。這 些基因被認(rèn)為調(diào)節(jié)不飽和脂肪酸的水平，進(jìn)而介導(dǎo)膜流動(dòng)性。此外，為了在冷馴化過程中維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，一些蛋白質(zhì)的功能是作為抑制劑， 抑制冰核活性。這些蛋白質(zhì)是所謂的抗凍蛋白（AFP）,如3 - 1, 3-glucanase-like蛋白（GLP）,幾丁質(zhì)酶樣蛋白（CLP,索馬甜樣蛋白（TLP）,多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（ PGIPS和胚 胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA。在

29、CA1樣本中，編碼這些蛋白質(zhì)的很多基因與非馴化的樣品中的基因相比是上調(diào)表達(dá)的36。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)7個(gè)甲胎蛋白相關(guān)基因，包括4個(gè)位置，1 TLP, 1 PGIP和1 LEA，分別在CA1樣品中上調(diào)表達(dá)，表明在冷馴化過程中， 茶植物變得能夠忍受嚴(yán)寒，膜的穩(wěn)定性增強(qiáng)。質(zhì)膜的穩(wěn)定性也與滲透平衡有關(guān)。為了維持滲透平衡，植物積累一系列的相容性溶質(zhì)， 包括可溶性糖（蔗糖，海藻糖，蜜子糖），糖醇（核糖醇，肌醇，山梨糖醇），和在冷脅迫的 響應(yīng)不同的冷凍保護(hù)劑分子的低分子量的化合物（如脯氨酸，甜菜堿，谷氨酸）。因此，在CA過程中這些與代謝相關(guān)基因的表達(dá)也在變化29,36。我們從1770的碳水化合物中確定

30、了 13個(gè)差異表達(dá)基因的代謝途彳5相關(guān)的基因，包括4半乳糖甘酶（3個(gè)上調(diào)表達(dá)和1個(gè)下調(diào)表達(dá)調(diào)節(jié)），5個(gè)淀粉酶（所有上調(diào)），1半乳糖昔合成酶（上調(diào)），和1個(gè)棉子 糖合酶（上調(diào)），1個(gè)海藻糖-6-磷酸合成酶（所有上調(diào)）。這些基因是碳水化合物代謝途徑的 關(guān)鍵基因，并與 CA過程密切相關(guān)63 。三個(gè)單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因也已經(jīng)被確定（2個(gè)上調(diào)表達(dá)-和1個(gè)下調(diào)表達(dá)），單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物中的糖運(yùn)輸和分布起著重要的作用。單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)也受冷脅迫調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明，碳水化合物的代謝途徑在茶樹白C CA的過程中起著關(guān)鍵的作用。通過DGE和qRT-PC曲術(shù)3證RNA序列結(jié)果數(shù)字基因表達(dá)（DGE）文庫(kù)測(cè)序用于驗(yàn)證

31、 RNA序列冷調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的鑒定。在我們的研究 中，三個(gè) DGE圖書館測(cè)序：CA1, CA3和CR生成的原標(biāo)簽分別為其中3.69, 3.68 3.62。去除低質(zhì)量的標(biāo)簽后，清潔標(biāo)簽 /圖書館總數(shù)為3.533.60。從3個(gè)DGE圖書館標(biāo)簽清潔被映 射到我們的組裝轉(zhuǎn)錄組序列。DGE標(biāo)簽檢測(cè)有高達(dá)24.25%的轉(zhuǎn)錄本。對(duì)1770個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄的 RNA測(cè)序鑒定，1460例DGE測(cè)序檢測(cè)，但870被不確定 的標(biāo)簽映射（映射到至少兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽）和另一個(gè)192的轉(zhuǎn)錄沒有足夠的標(biāo)簽 （V 1標(biāo)簽的每百萬(wàn)（TPM）的所有三個(gè)樣本數(shù)）的分化表達(dá)在CA1, CA3和CK樣本。這一結(jié)果表明，DGE測(cè)序通過在轉(zhuǎn)錄

32、譜的滿刻度被限制鑒定差異表達(dá)，這對(duì)于同源基因或多個(gè)亞型， 共享相同的標(biāo)記基因（CATGh 17）。其余的398個(gè)轉(zhuǎn)錄本，他們中的絕大多數(shù)（ 376/398） 展示了 DGE的表達(dá)模式和 RNA序列之間的一致性，與相應(yīng)的皮爾森 R, CA1/CA3和CA1 / CK, 分別為0.77和0.81,表明DGE和RNA序列平臺(tái)之間的一致性。值得注意的是，一些轉(zhuǎn)錄（雖然不是很多），從RNA序列和DGE中表現(xiàn)出不同的表達(dá)模 式分析結(jié)果。確定哪種方法更穩(wěn)定，為什么這兩種方法產(chǎn)生不同的結(jié)果在這個(gè)研究中正確的 結(jié)果將是有用的識(shí)別，而且易于其他研究人員在今后的學(xué)習(xí)中選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。為了解決這個(gè)問題，這些轉(zhuǎn)錄本中的

33、10個(gè)記錄表明從 RNA序列和DGE平臺(tái)隨機(jī)選才i用定量 RT-PCR亍法在CK, CA1和CA3評(píng)估他們的相對(duì)差異表達(dá)不一致的結(jié)果。對(duì)于大多數(shù)的這些，相似的 表達(dá)模式與RNA測(cè)序結(jié)果相比進(jìn)行觀察，而在其他2個(gè)轉(zhuǎn)錄本只有部分與 RNA序列或DGE結(jié)果有一致性。在一般情況下，RNA序列執(zhí)行DGE基于這10種情況下的結(jié)果。用DGE方法 的基因表達(dá)水平的不準(zhǔn)確的估計(jì)可能是由于一些未知的原因（S）或事實(shí)上相同的標(biāo)簽可以在其它的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行部分重建從頭轉(zhuǎn)錄組件后，缺乏完整的標(biāo)簽序列存在。自從DGE方法計(jì)數(shù)所有標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄與完全匹配的標(biāo)簽序列，這可能會(huì)導(dǎo)致一些轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的不正確的估計(jì)。從三種方法的結(jié)果觀察剩下的兩個(gè)基因的表達(dá)模式不一致。這些基因的表達(dá)水平相對(duì)變量可以通過其他的因素影響而不是一個(gè)寒冷的環(huán)境，這些種類的誤報(bào)可能在很大程度上是更多的生物復(fù)制，包括避免影