慢病毒載體課件

1、病毒載體和慢病毒載體基因轉(zhuǎn)移載體是基因治療的重要組成部分,包括病毒載體和非病毒載體。目前應(yīng)用的病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體等。不同的病毒載體各有利弊。隨著對病毒載體的不斷改造完善,提高其基因轉(zhuǎn)移效率和安全性,病毒載體將在基因治療中繼續(xù)發(fā)揮重要作用逆轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期細(xì)胞,腺病毒載體在體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定的長期表達(dá),且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)。來源于人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒載體由于可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)越來越受到人們的重視逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體：1.逆轉(zhuǎn)錄病毒(ret

2、rovirus vectors ,RV)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括兩部分:一部分是用外源基因替換病毒結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;另一部分是包裝細(xì)胞的基因組DNA中整合了逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因?qū)⑺菪钥谘撞《咎堑鞍?VSV-G)整合于逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜中能加速各種宿主細(xì)胞對其進(jìn)行膜融合和內(nèi)吞,具有廣泛的宿主范圍和更高的轉(zhuǎn)染效率,可高效的轉(zhuǎn)染靜止細(xì)胞,并能抵抗血清補(bǔ)體滅活的作用。王烈. 基因治療病毒載體的研究進(jìn)展J. 醫(yī)學(xué)綜述, 2007, 13(7): 490-492.2.腺病毒(adenovirus, AV)載體 腺病毒是一種二十面體病毒殼體大分子，基因組是一個(gè)線性的雙鏈DNA，其5端與一種末

3、端蛋白（TP）共價(jià)結(jié)合，5端上還具有末端反向重復(fù)序列（ITRs）。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 目前，最主流的腺病毒載體系統(tǒng)有Adeasy系統(tǒng)（ 通過原核重組極大提高了腺病毒的重組效率）和AdMax系統(tǒng)（改造后的真核腺病毒包裝體系，進(jìn)一步增加的操作的便捷，同時(shí)滴度較Adeasy有進(jìn)一步提高）。 第四代腺病毒僅含有反向末端重復(fù)序列(ITRs)和包裝信號,載體容量達(dá)37kb,進(jìn)一步降低了免疫原性,被稱為“高容量”載體。AV載體具有宿主范圍廣、基因轉(zhuǎn)移效率高、對非分裂細(xì)胞也有感染性、比較容易制備和操作、理化性質(zhì)穩(wěn)定、

4、遺傳毒性較低及比較安全等優(yōu)點(diǎn)。3.腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AVV)載體 腺病毒相關(guān)病毒(AAV)是一種缺陷型的單鏈DNA病毒,只有在輔助病毒如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒等存在的情況下,才能進(jìn)行最佳復(fù)制,產(chǎn)生新的病毒顆粒,否則只能進(jìn)行潛伏感染。AAV載體既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞,在宿主體內(nèi)以定向整合的方式存在,70%以上的整合位點(diǎn)位于第19號染色體q13.3-qter區(qū),且對人體無致病性4.單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)載體 單純皰疹病毒是一種雙鏈DNA病毒,作為基因治療載體， HSV載體非常適用于需要基因長時(shí)

5、間表達(dá)的基因治療,但在介導(dǎo)腫瘤基因治療等要求基因短暫高水平表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移是不合適。5.慢病毒(lentivirus)載體在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長期、穩(wěn)定表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中，慢病毒 己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一。P.s shRNA是short hairpin RNA

6、 的縮寫。翻譯為“短發(fā)夾RNA。shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol啟動(dòng)子控制。隨后再連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止子。在活體中輸送“小干擾RNA”（siRNA）的一種辦法是，將siRNA序列作為“短發(fā)夾”克隆進(jìn)質(zhì)粒載體中。當(dāng)送入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，該發(fā)夾序列被表達(dá)出來，形成一個(gè)“雙鏈RNA”（shRNA），并被RNAi通道處理 基本過程由兩部分組成，包裝成分和載體成分 包裝成分：HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合的順式作用序列而構(gòu)建；包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的