染色質(zhì)免疫沉淀課件

染色質(zhì)免疫沉淀Chromatinimmunoprecipitation1精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀Chromatinimmunoprecipi基因型決定表型2精選ppt基因型決定表型2精選ppt破壞了基因型也就改變了表型3精選ppt破壞了基因型也就改變了表型3精選ppt但是，也有一些無法解釋的現(xiàn)象在相應(yīng)的基因堿基序列沒有發(fā)生變化的情況下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。4精選ppt但是，也有一些無法解釋的現(xiàn)象在相應(yīng)的基因堿基序列沒有發(fā)生變什么是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化并不涉及DNA序列的突變。5精選ppt什么是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺表觀遺傳修飾

在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為“表觀遺傳修飾”，并被認(rèn)為是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)一致的孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。6精選ppt表觀遺傳修飾在不影響DNA序列的情況染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)DNA與其包繞的核心組蛋白之間親和力的變化或相對(duì)位置的改變使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為松散，DNA更易于暴露。染色質(zhì)重塑就是通過這樣的變化來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由ATP提供能量的、通過依賴于ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與DNA的結(jié)合狀態(tài)，在靠近核心組蛋白的DNA表面建立特殊的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因子較易于接近DNA的過程。7精選ppt染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步8精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步8精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟。9精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟實(shí)驗(yàn)原理10精選ppt實(shí)驗(yàn)原理10精選ppt實(shí)驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化準(zhǔn)備一瓶接近長滿的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入37%的甲醛至終濃度為1%，輕輕搖勻，在37℃孵育10分鐘。

①甲醛的作用②細(xì)胞的用量③交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至4℃帶蛋白酶抑制劑PMSF的1×PBS洗細(xì)胞兩次，刮細(xì)胞到一個(gè)2ml離心管，2000rpm，4℃離心4min收集細(xì)胞。

11精選ppt實(shí)驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化11精選ppt

甲醛的作用在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）的應(yīng)用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時(shí)間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團(tuán)之間的交聯(lián)，高效地在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠實(shí)地保留染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，在12-37℃作用30min。但是如果反應(yīng)溫度超過30℃，本底就可能增加。因此，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)減少作用時(shí)間或甲醛濃度。過度交聯(lián)將影響細(xì)胞的裂解，并且在超聲處理時(shí)不能獲得理想長度的DNA片段及影響DNA的溶解。對(duì)于特別容易進(jìn)行交聯(lián)的目的蛋白質(zhì)（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。12精選ppt甲醛的作用12精選ppt細(xì)胞的用量通常2.5×108細(xì)胞足夠進(jìn)行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。（一般分裝1х107細(xì)胞于一個(gè)EP管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。

交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響對(duì)于不同的細(xì)胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長度或者交聯(lián)的溫度都需要調(diào)整。如果交聯(lián)不充分，會(huì)導(dǎo)致不完全固定，則DNA片段的平均長度會(huì)小于500bp。交聯(lián)過度時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長超聲波作用時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致重要原料的丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。13精選ppt細(xì)胞的用量13精選ppt3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸并裂解細(xì)胞，冰浴10分鐘；超聲波處理剪切染色質(zhì)DNA，使其形成300-1000bp即大約相當(dāng)于2-5個(gè)核小體長度的片段；

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)②設(shè)置超聲破碎的條件③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別14精選ppt3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SD

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)

超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫?？偝晻r(shí)間也不要太長，以免蛋白降解。15精選ppt①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)15精選ppt②設(shè)置超聲破碎的條件超聲處理的條件通?？梢栽O(shè)置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時(shí)設(shè)置為最大功率的30%，采用2mm超聲頭。不同的超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時(shí)，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致明顯發(fā)熱，然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個(gè)相對(duì)比較固定的超聲條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。16精選ppt②設(shè)置超聲破碎的條件16精選ppt③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別MicrococcalNuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)DNA和DNA-蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用沒經(jīng)過甲醛固定的NativeChIP（N-ChIP）的研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的MicrococcalNuclease處理的ChIP試劑盒（EZ-Enzyme）提供。17精選ppt③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別17精選pptEnzyme和sonication處理結(jié)果比較18精選pptEnzyme和sonication處理結(jié)果比較18精選ppt

超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可采用不同的超聲波處理?xiàng)l件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果：a.將超聲處理過的樣品離心收集上清（4℃13000rpm離心10分鐘），加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查。實(shí)驗(yàn)組12345678超聲次數(shù)3691136911超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁內(nèi)容不在正常的ChIP步驟中19精選ppt超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可酚/氯仿抽提步驟

按照1：1體積比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入1/10體積3MNacl，2倍體積無水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心5min20精選ppt酚/氯仿抽提步驟按照1：1體積比加酚/氯仿充分混勻5.將超聲處理過的樣品在4℃13000rpm離心10分鐘收集上清，10倍稀釋，將其移入一新的2mlEP管中；6.按照每2ml稀釋后液體加入75μl的比例加入蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖動(dòng)30分鐘，預(yù)處理，短暫離心(700-1000rpm4℃，小于1分鐘)，收集上清液；

①Beads的選擇②Input的設(shè)置7.向2ml上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白H3的抗體(20μl)，4℃搖動(dòng)過夜，陰性對(duì)照組不加抗體同樣搖動(dòng)過夜；

①抗體的選擇②對(duì)照的設(shè)置二、免疫沉淀染色質(zhì)DNA片段21精選ppt5.將超聲處理過的樣品在4℃13000rpm離心10分鐘

①Beads的選擇利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magnabeads是近年來出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。Millipore公司最新推出的MagnaChIP試劑盒就是采用這種Magnabeads。22精選ppt①Beads的選擇利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前的樣品23精選ppt免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇ChIPValidated24精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇ChIPValidated24精選②對(duì)照的設(shè)置ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照：①未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理樣本（input）；②陽性對(duì)照。一般用組蛋白抗體或anti-RNAPolymeraseII抗體這些比較保守的在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的蛋白的抗體；③陰性對(duì)照。即用一種無關(guān)抗體（或相應(yīng)動(dòng)物的免疫前血清），與抗目的蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；④選擇不與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照，即“基因組對(duì)照”。另外，還應(yīng)根據(jù)對(duì)ChIP的不同的特殊應(yīng)用設(shè)立不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。例如，試圖檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定突變細(xì)胞株中目的蛋白質(zhì)與基因組DNA結(jié)合情況時(shí)，必須用野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。25精選ppt②對(duì)照的設(shè)置ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照8.加60μl蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖1小時(shí)；短暫離心(700-1000rpm，4℃，小于1分鐘)收集沉淀，分別用低鹽免疫復(fù)合物洗液、高鹽免疫復(fù)合物洗液、LiCl免疫復(fù)合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用1ml，搖動(dòng)3-5分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次三、PCR鑒定結(jié)合于乙?；M蛋白H3的DNA片段10.向上步所得沉淀中加入250μl洗脫液(1%SDS,0.1MNaHCO3)，震蕩，室溫孵育15分鐘，離心收集上清；26精選ppt8.加60μl蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混11.加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、和2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；12.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，取1μl作模板，按以下配方加樣，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以及Input組的GAPDH啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增條件95℃1分鐘，95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒、30個(gè)循環(huán)，72℃5分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢查結(jié)果。①此步DNA純化可以選擇適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒②PCR的策略27精選ppt11.加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTrPCR的策略

引物的選擇取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。如若鑒定目的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的位點(diǎn)，除了必須設(shè)計(jì)一對(duì)能使擴(kuò)增片段跨過該位點(diǎn)的引物外，至少還應(yīng)設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增的DNA序列中沒有目的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)照引物。對(duì)于平均長度為500bp的DNA分子，它的大部分片段長度是500-1000bp，以至遠(yuǎn)離真正的結(jié)合位點(diǎn)1000bp處的DNA序列很可能被抗體共沉淀下來。所以，對(duì)照引物擴(kuò)增的DNA區(qū)域與實(shí)驗(yàn)引物擴(kuò)增的DNA區(qū)域之間的距離必須大于1000bp。引物的設(shè)計(jì)依據(jù)通用的引物設(shè)計(jì)原則。有時(shí)為提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，可將引物終濃度降低5-10倍。大多數(shù)引物步需要純化或特殊處理。由于實(shí)際上擴(kuò)增效率較低，擴(kuò)增產(chǎn)物不應(yīng)過長，以75-300bp為宜。

28精選pptPCR的策略引物的選擇取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。如若鑒Co-IP和ChIP的區(qū)別Co-IPChIP相互作用蛋白-蛋白蛋白-DNA檢測(cè)對(duì)象蛋白質(zhì)DNA序列檢測(cè)方法Westernblot/質(zhì)譜PCR/芯片裂解方式裂解液超聲；酶解固定劑不需要固定劑甲醛對(duì)抗體的要求比較高更高（交聯(lián)對(duì)抗原表位的破壞）29精選pptCo-IP和ChIP的區(qū)別Co-IPChIP相互作用蛋白-蛋30精選ppt30精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀Chromatinimmunoprecipitation31精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀Chromatinimmunoprecipi基因型決定表型32精選ppt基因型決定表型2精選ppt破壞了基因型也就改變了表型33精選ppt破壞了基因型也就改變了表型3精選ppt但是，也有一些無法解釋的現(xiàn)象在相應(yīng)的基因堿基序列沒有發(fā)生變化的情況下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。34精選ppt但是，也有一些無法解釋的現(xiàn)象在相應(yīng)的基因堿基序列沒有發(fā)生變什么是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化并不涉及DNA序列的突變。35精選ppt什么是表觀遺傳學(xué)?是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺表觀遺傳修飾

在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅可以影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為“表觀遺傳修飾”，并被認(rèn)為是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)一致的孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。36精選ppt表觀遺傳修飾在不影響DNA序列的情況染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)DNA與其包繞的核心組蛋白之間親和力的變化或相對(duì)位置的改變使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為松散，DNA更易于暴露。染色質(zhì)重塑就是通過這樣的變化來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由ATP提供能量的、通過依賴于ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與DNA的結(jié)合狀態(tài)，在靠近核心組蛋白的DNA表面建立特殊的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因子較易于接近DNA的過程。37精選ppt染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步38精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步8精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟。39精選ppt實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟實(shí)驗(yàn)原理40精選ppt實(shí)驗(yàn)原理10精選ppt實(shí)驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化準(zhǔn)備一瓶接近長滿的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入37%的甲醛至終濃度為1%，輕輕搖勻，在37℃孵育10分鐘。

①甲醛的作用②細(xì)胞的用量③交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至4℃帶蛋白酶抑制劑PMSF的1×PBS洗細(xì)胞兩次，刮細(xì)胞到一個(gè)2ml離心管，2000rpm，4℃離心4min收集細(xì)胞。

41精選ppt實(shí)驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化11精選ppt

甲醛的作用在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）的應(yīng)用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時(shí)間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團(tuán)之間的交聯(lián)，高效地在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠實(shí)地保留染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為1%，在12-37℃作用30min。但是如果反應(yīng)溫度超過30℃，本底就可能增加。因此，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)減少作用時(shí)間或甲醛濃度。過度交聯(lián)將影響細(xì)胞的裂解，并且在超聲處理時(shí)不能獲得理想長度的DNA片段及影響DNA的溶解。對(duì)于特別容易進(jìn)行交聯(lián)的目的蛋白質(zhì)（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。42精選ppt甲醛的作用12精選ppt細(xì)胞的用量通常2.5×108細(xì)胞足夠進(jìn)行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。（一般分裝1х107細(xì)胞于一個(gè)EP管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。

交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響對(duì)于不同的細(xì)胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長度或者交聯(lián)的溫度都需要調(diào)整。如果交聯(lián)不充分，會(huì)導(dǎo)致不完全固定，則DNA片段的平均長度會(huì)小于500bp。交聯(lián)過度時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長超聲波作用時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致重要原料的丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過短，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。43精選ppt細(xì)胞的用量13精選ppt3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸并裂解細(xì)胞，冰浴10分鐘；超聲波處理剪切染色質(zhì)DNA，使其形成300-1000bp即大約相當(dāng)于2-5個(gè)核小體長度的片段；

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)②設(shè)置超聲破碎的條件③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別44精選ppt3.用500μl預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SD

①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)

超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫?？偝晻r(shí)間也不要太長，以免蛋白降解。45精選ppt①超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)15精選ppt②設(shè)置超聲破碎的條件超聲處理的條件通?？梢栽O(shè)置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時(shí)設(shè)置為最大功率的30%，采用2mm超聲頭。不同的超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時(shí)，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致明顯發(fā)熱，然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個(gè)相對(duì)比較固定的超聲條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。46精選ppt②設(shè)置超聲破碎的條件16精選ppt③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別MicrococcalNuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)DNA和DNA-蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用沒經(jīng)過甲醛固定的NativeChIP（N-ChIP）的研究方法。因?yàn)镹-ChIP沒經(jīng)過甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司有商品化的MicrococcalNuclease處理的ChIP試劑盒（EZ-Enzyme）提供。47精選ppt③酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別17精選pptEnzyme和sonication處理結(jié)果比較48精選pptEnzyme和sonication處理結(jié)果比較18精選ppt

超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可采用不同的超聲波處理?xiàng)l件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果：a.將超聲處理過的樣品離心收集上清（4℃13000rpm離心10分鐘），加入10μl0.5MEDTA、20μl1MTris-HClpH6.5、2μl20mg/ml蛋白酶K，45℃孵育0.5-1小時(shí)；b.酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查。實(shí)驗(yàn)組12345678超聲次數(shù)3691136911超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁內(nèi)容不在正常的ChIP步驟中49精選ppt超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可酚/氯仿抽提步驟

按照1：1體積比加酚/氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入1/10體積3MNacl，2倍體積無水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心5min50精選ppt酚/氯仿抽提步驟按照1：1體積比加酚/氯仿充分混勻5.將超聲處理過的樣品在4℃13000rpm離心10分鐘收集上清，10倍稀釋，將其移入一新的2mlEP管中；6.按照每2ml稀釋后液體加入75μl的比例加入蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液)，4℃搖動(dòng)30分鐘，預(yù)處理，短暫離心(700-1000rpm4℃，小于1分鐘)，收集上清液；

①Beads的選擇②Input的設(shè)置7.向2ml上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白H3的抗體(20μl)，4℃搖動(dòng)過夜，陰性對(duì)照組不加抗體同樣搖動(dòng)過夜；

①抗體的選擇②對(duì)照的設(shè)置二、免疫沉淀染色質(zhì)DNA片段51精選ppt5.將超聲處理過的樣品在4℃13000rpm離心10分鐘

①Beads的選擇利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarosebeads或Magnabeads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magnabeads是近年來出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像Agarosebeads那樣容易破裂，所以在操作過程中更簡單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。Millipore公司最新推出的MagnaChIP試劑盒就是采用這種Magnabeads。52精選ppt①Beads的選擇利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前的樣品53精選ppt免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇ChIPValidated54精選ppt染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇ChIPValidated24精選②對(duì)照的設(shè)置ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照：①未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理樣本（input）；②陽性對(duì)照。一般用組蛋白抗體或anti-RNAPolymeraseII抗體這些比較保守的在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的蛋白的抗體；③陰性對(duì)照。即用一種無關(guān)抗體（或相應(yīng)動(dòng)物的免疫前血清），與抗目的蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；④選擇不與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照，即“基因組對(duì)照”。另外，還應(yīng)根據(jù)對(duì)ChIP的不同的特殊應(yīng)用設(shè)立不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。例如，試圖檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定突變細(xì)胞株中目的蛋白質(zhì)與基因組DNA結(jié)合情況時(shí)，必須用野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。55精選ppt②對(duì)照的設(shè)置ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照8.加60μl蛋白A-瓊脂糖/鮭精DNA(50%混懸液