ELISA方法二、流式細胞分析法三、酶聯(lián)免疫斑點試驗四

1、第十六章細胞因子與細胞粘附因子的測定免疫學(xué)測定方法學(xué)評價第一節(jié)、生物學(xué)測定方法促進細胞增殖和抑制細胞增殖測定法1=1細胞毒活性測定法抗病毒活性測定法趨化活性測定法五、生物學(xué)活性測定方法學(xué)評價第二節(jié)免疫測定方法一、ELISA方法二、流式細胞分析法酶聯(lián)免疫斑點試驗Rd第三節(jié)細胞因子與細胞粘附分子測定的臨床應(yīng)用一、臨床應(yīng)用原則:、特定疾病診斷的輔助指標三、評估機體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后思考題小結(jié)細胞因子是由活化的免疫細胞及某些基質(zhì)細胞表達并分泌的活性物質(zhì)，其主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。細胞粘附因子是介導(dǎo)細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)間粘附作用的分子，其化

2、學(xué)本質(zhì)為糖蛋白，可以細胞膜表面表達和可溶性兩種形式存在。第一節(jié)生物學(xué)測定方法生物學(xué)測定法分類1基于DNA檢測的分子生物學(xué)測定法:DNA擴增法*RNA印跡法*原位雜交法核酸酶保護分析生物活性測定法生物活性測定法原理根據(jù)細胞因子特定的生物學(xué)活性，應(yīng)用相應(yīng)的指示系統(tǒng)，同時與標準品對比測定，從而得知樣品中細胞因子的活性水平，一般以活性單位(U/ml)表示刺激細胞增殖或集落形成的活性有助于細胞因子維持細胞生長和存活的特性檢測的活性作用抑制細胞生長或破壞細胞的效應(yīng)J促進細胞趨化或抗病毒作用一、促進細胞增殖和增殖抑制測定法以細胞因子依賴性細胞株為靶向，通過觀察特定的細胞因子刺激或抑制依賴性細胞株增殖來評估細

3、胞因子的活性水平O細胞增殖檢測方法分類A直接計數(shù)法簡便、直觀，但費時、主觀因素影響大、難以標準化和自動化A細胞代謝活性測定方法3H-TdR、125UdR摻入法或MTT等比色法A細胞代謝產(chǎn)物測定法代謝產(chǎn)物熒光強度測定法和指示細胞表面標記或可溶性分子測定法(1)放射性核素摻入法通過檢測細胞DNA合成的增加或減少來判斷細胞增殖的方法。在細胞的增殖過程中，DNA合成的增加使得指示細胞對核昔或堿基的需求增多，若將核昔標記上可以示蹤的同位素(羽/1呵),通過檢測細胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動化;方法的特異性受依賴細胞適用于大標本量的測定株影響；放射性污染常見細胞因子陽-TdR

4、摻入檢測法所需細胞及參考試驗條件所需濃度（細胞數(shù)/ml）3H-TdR前培養(yǎng)時間3H-TdR后培養(yǎng)時間檢測細胞因子D10G4.12X1054818-20IL-1L9292X1055616IL-1CTLL-2105244-6IL-2FDC-P1,32DCL-275X104244-8IL-3CT.4S1052446IL-4CH125X103486IL-5B135X1043612IL-5T88-M1X1052412IL-5BCL1105726IL-5Clone-K,IXN/2bx105244-6IL-7TS13X10666IL-9T10105726IL-11UT-71.5X105726SCF（干細胞因

5、子）CCL-64*5X108728TGF-PDA3.15,IF5X104244-8GM-CSFM14/NES60.45X104244-8M-CSF/G-CSF(2)MTT比色法特點：不使用放射性核素，以細胞代謝變化為增殖指征指示細胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān)與同位素摻入法相比測定步驟類似摻入物：MTT而非3H-TdR；反應(yīng)條件：選用的細胞及其濃度、培養(yǎng)時間不同細胞增殖或抑制活性檢測的MTT比色法常用靶細胞細胞株/原代細胞細胞終濃度（細胞數(shù)/ml）加入MTT前溫育時間（h）檢測細胞因子B9,MH60,BSF2,TTD15X10V2X10596/48IL-6B9-115X10496IL-11B

6、9-1-35X10496IL-13KYM-1D42X10372MV-3D95X103120TGF-BWEHI-164/clonel32X10372TNF32D/MpllOS1X10344L9292X1O556TNFCTLL-210522-24IL-2小鼠基質(zhì)細胞，32DCL-271.5X10572IL-3二、細胞毒活性測定法基本原理對指示細胞具有破壞作用的細胞因子，若與細胞共育將會導(dǎo)致細胞死亡。因此，待測細胞因子作一系列稀釋后加至指示細胞培養(yǎng)體系，以檢測培養(yǎng)細胞的死細胞數(shù)作為判斷指標，死細胞數(shù)量與細胞因子的活性呈正比。試驗時，與細胞增殖或抑制方法一樣，以已知活性的細胞因子標準品為對照。死、活細

7、胞情況可用同位素5iCr釋放法判斷，或應(yīng)用臺盼蘭染色死細胞后直接計數(shù)。也可通過結(jié)晶紫、蔡酚藍黑、MTT、NBB等著染活細胞，再用脫色液脫出染料后酶標儀比色測定吸光值。死細胞數(shù)、釋放量越高或比色測定的吸光值越低，表明待測細胞因子的細胞毒活性則越高。應(yīng)用系列稀釋的細胞因子標準品，制作其活性與劑量關(guān)系的標準曲線，以此作為待測品活性的定量測定的基礎(chǔ)。本法常用于TNF等的測定/Wish、Hep2/c/L929/Ratec/A549人干擾素小鼠干擾素大鼠干擾素/MDBK多種族的IFN-a和IFNy常用于攻擊細胞的病毒VSV、EMCV及Sindbisvims等A細胞病變效應(yīng)(CPE)、A抑制病毒蝕斑形成或抑

8、制病毒的產(chǎn)量本法常用于IFN等的測定，IFN可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護細胞不受病毒感染，產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)(CPE)。細胞病變抑制法結(jié)果判斷舉例*/細胞病變程度分為5個等級，即:“0”，表示無明顯CPE；CPEW25%；CPE為2550%；“3+”，CPE為5075%；“4+”，CPE為75100%。根據(jù)病變程度找出CPEI50的標本稀釋范圍,并以此計算出距離比例和確定IFN效價。標本稀釋度log4兩孔平均CPE細胞病變抑制程度細胞病變抑制積累細胞病變積累細胞病變抑制率30416016/16(100%)40412012/12(100%)504808/8(100%)61.5

9、2.541.54/5.5(73%)72.51.51.541.5/5.5(27%)800080/8(0%)該法操作復(fù)雜、影響因素較多，在試驗前應(yīng)對所用的病毒進行滴定。結(jié)果：CPEI50稀釋度介于4-6-4-7之間，距離比例為(73-50)/(73-27)=0.50,效價為46.5；同法計算IFN標準品的CPEI50稀釋度,將IFN效價換算成國際單位，IFN國際單位二樣品CPEL50的稀釋度/標準品CPEI50稀釋度X標準品的單位。四、趨化活性測定法趨化因子誘導(dǎo)細胞移動的方式A趨化性(chemotaxis)：誘導(dǎo)細胞向由固的國殍曜底冏趨化因子高濃度處作定向移動的特性，可釆用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗

10、?；瘜W(xué)增活性(chemokinesis)：細胞因子增強細胞的隨機運動能力的特性，可釆用瓊脂糖小滴化學(xué)動力學(xué)試驗檢測。五、生物學(xué)活性測定方法學(xué)評價敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾第二節(jié)免疫學(xué)測定法細胞因子（或受體）與相應(yīng)的特異性抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）結(jié)合，通過同位素、熒光或酶等標記技術(shù)加以放大和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子（或受體）的水平。、ELISA方法ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標免疫分析技術(shù)，一步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISA的基本步驟,可作定性或定量分析。ELISA法不僅可以用于細胞因子檢測,也可用于可溶性細胞因子受體或可溶性粘附因子的測定根據(jù)抗

11、體性質(zhì)和特異性不同，夾心法ELISA可分為:1.PcAb與McAb夾心法2McAb與PcAb夾心法3.雙McAb夾心法4細胞、McAb夾心法ELISA特異、簡便易于推廣和標準化等優(yōu)點可同時檢測大量標本且試驗廢棄物便于處理細胞因子測定的首選方法敏感性偏低不能判斷細胞因子的生物學(xué)活性。、流式細胞分析法流式細胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細胞內(nèi)細胞因子和細胞表面粘附分子的檢測，通過特異性的熒光抗體染色，能簡單、快速地進行單個細胞水平的細胞因子或粘附因子的檢測,精確判斷不同細胞亞群細胞因子和膜分子的表達情況。1.分離和培養(yǎng)待檢細胞基本步驟2.細胞

12、固定封閉非特異性結(jié)合位點染色與分析使用流式細胞分析法，可以:區(qū)分不同分泌特性的細胞亞群:Thl細胞IFN-丫Th2細胞IL-4A細胞表面的粘附分子或細胞因子受體:單克隆抗體技術(shù)直接或間接熒光抗體染色無需作細胞固定和非特異性結(jié)合位點的封閉待測細胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細胞，保持良好狀態(tài)三、聲聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT或ElisaSpot)基在包被有待測細胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細胞因子的待測細胞，經(jīng)在有或無刺激物存本在的條件下培養(yǎng)，待測細胞分泌細胞因子于其周圍，原并被板上的特異性抗體捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA,理即在洗去細胞后視用于試驗的酶標抗體為一抗或二抗，分別作直接或間接法

13、。一個斑點代表一個細胞因子分泌細胞，斑點的顏色深淺程度與細胞分泌的細胞因子量相關(guān)四、免疫學(xué)測定方法學(xué)評價優(yōu)點：特異性高操作簡便、快速，無需依賴細胞株影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標準化。A缺點：所測定的只是細胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比結(jié)果與所用的抗體來源及親和力有很大的關(guān)系敏感性相對較低標本中細胞因子的可溶性受體，會影響特異性抗體對細胞因子的結(jié)合第三節(jié)細胞因子與細胞粘附分子測定的臨床應(yīng)用細胞因子的測定主要應(yīng)用于:A特定疾病的輔助診斷A機體免疫狀態(tài)的評估A臨床疾病治療效果的監(jiān)測和指導(dǎo)用藥一、臨床應(yīng)用原則細胞因子和粘附分子的異質(zhì)性、功能交叉性和多樣性、來源的復(fù)雜性和組織細

14、胞的非特異性，決定了在進行這些分子檢測時，必須對方法選擇和結(jié)果判斷作出綜合考慮。（一）方法的聯(lián)合應(yīng)用細胞因子的檢測方法多種多樣,各有利弊。高敏感性方法：特異性的降低、廢棄物難處理活性測定方法：定性試驗基因分析法：利于細胞內(nèi)定位分析、操作煩瑣（二）標本的適當(dāng)選取A常用臨床標本：抗凝全血，并分離獲得單個核細胞A炎癥局部細胞因子的水平：局部分泌液A細胞因子或粘附分子的細胞內(nèi)定位檢測：相應(yīng)細胞A相應(yīng)細胞因子的基因和mRNA表達：相應(yīng)細胞A療效觀察和預(yù)后判斷：疾病急性期和恢復(fù)期雙份標本進行動態(tài)觀測A免疫熒光染色和流式細胞分析：注意待檢細胞的活性和狀態(tài)，以保證結(jié)果的特異性（三）細胞因子的聯(lián)合檢測細胞因子具

15、有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的狀調(diào)節(jié)的特點級聯(lián)效應(yīng)或相互抑制作用的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。有助于提供有效的疾病診斷和機體免疫狀態(tài)信息T細胞、巨噬細胞和上皮樣細胞分泌相應(yīng)細胞因子的功能：IL-1、IL-2、IFN-丫和GM-CSFThl/Th2細胞平衡狀態(tài)：IL-2、IL-4、IL-10和IFN-丫二、特定疾病診斷的輔助指標（一）細胞因子檢測在特定疾病診斷中的意義.許多疾病過程均可出現(xiàn)粘附分子和細胞因子表達的異常改變，高表達、低表達或是缺陷均可與某些特定疾病密切關(guān)聯(lián)，同時還可反映疾病的進程（二）粘附分子檢測在特定疾病診斷中的意義粘附分子有可溶性和膜結(jié)合性兩種形式，均與機體的免疫狀態(tài)和疾病的發(fā)生有關(guān)，在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移和器官移植排

16、斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用0相關(guān)粘附分子的檢測有助于此類疾病的診斷。三、評估機體的免疫狀態(tài)、判斷治療效果及預(yù)后|=:機體免疫應(yīng)答的強弱可通過細胞因子或粘附分子的表達水平來反映，其過高或過低表達均系免疫調(diào)節(jié)異常的結(jié)果細胞因子和粘附分子的水平，作為觀察治療效果和判斷預(yù)后的重要指標接受治療的患者進行細胞因子水平的監(jiān)測，對保證治療效果具有指導(dǎo)意義思考題1.細胞因子和細胞粘附分子的特性是什么？可分為幾類?2基于促進細胞增殖生物學(xué)活性，檢測IL-l、IL-2、IL-3、TNF等方法所使用的細胞依賴株與檢測原則是什么？細胞因子生物活性測定法的種類，各用于哪些細胞因子的檢測，主要優(yōu)缺點?ELISA法在細胞因子和粘附分子檢測可應(yīng)用于哪些方?ELISPOT的原理、用途、與ELISA的異同是什么?在應(yīng)用流式細胞術(shù)分析細胞因子時，需要哪些靶細胞活化劑？各自的作用是什么？與細胞因子的生物活性測定法相比，免疫測定法的優(yōu)勢是什么？如何看待其現(xiàn)有的劣勢？試推測解決現(xiàn)存的不足和