我國水生動物病毒病研究進(jìn)展

我國水生動物病毒病研究進(jìn)展

自20世紀(jì)80年代以來，中國的水產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，農(nóng)業(yè)產(chǎn)值占其自身優(yōu)勢的比例逐年增加。它已成為中國農(nóng)業(yè)的主要支柱（糧食、肉類、漁業(yè)、禽蛋）之一。1998年,我國水產(chǎn)品年產(chǎn)量達(dá)3800萬t,但令人遺憾的是水生動物疾病,尤其是因病毒引起的爆發(fā)性流行病明顯增多,危害極為嚴(yán)重。水生動物分類地位相差甚遠(yuǎn),除了魚之外,還包括蝦、貝等無脊椎動物和蛙、鱉等低等脊椎動物。自從Wolf分離到第一株魚類病毒以來,迄今見報(bào)道的魚病毒已超過70種。已知水生動物病毒分類屬于18個(gè)科(表1),在絕大多數(shù)動物病毒科中都有分布。水生動物病毒病已受到人們廣泛關(guān)注,以研討水生動物病毒病為主題、由國際著名專家倡導(dǎo)并組織的“國際低等脊椎動物病毒學(xué)術(shù)會議”每4年召開一次,現(xiàn)已召開過四次。水生動物存在病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲病等。其中病毒病具有潛伏期長短不一、癥狀復(fù)雜多變、傳染性強(qiáng)、導(dǎo)致高死亡率的特點(diǎn),且病原個(gè)體微小,侵染動物后在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,因而抗菌素對病毒的作用小或無;而化學(xué)藥物在殺滅病毒前,就可能使宿主動物受損或致死?？梢姴《臼俏：Ψ浅?yán)重的一類病原,現(xiàn)就我國水生動物病毒病的研究概況作一簡介。1魚類病毒1.1魚類病毒的分離與鑒定我國水生動物病毒學(xué)研究始于70年代后期對草魚出血病病原的分離鑒定。Wolf在對70—80年代國際上魚類病毒學(xué)研究情況進(jìn)行介紹時(shí),也收錄了我國草魚病毒研究的早期資料。近十年來,國內(nèi)外學(xué)者在對早期分離到的、有重要危害性的魚類病毒進(jìn)行研究的同時(shí),又發(fā)現(xiàn)和分離到新的魚類病毒。列舉一些重要的魚類病毒及病毒病如下(表2)。1.2病毒的分離及其功能由呼腸孤病毒引起的出血病是草魚種苗階段危害性大、流行普遍的疾病,也是我國最早發(fā)現(xiàn)和研究得最多的魚類病毒病。超微觀察顯示,在病魚腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有呈球形或六角形、平均直徑為69nm的病毒顆粒。病毒對酸(pH3)和氯仿不敏感,對熱(56℃)穩(wěn)定。經(jīng)丫啶橙染色及DNA合成抑制劑測試,表明該病毒屬雙股RNA類型。對病毒的核酸進(jìn)行電泳分析,出現(xiàn)11個(gè)片段。因此將草魚出血病病毒歸類于呼腸孤病毒。近年對草魚呼腸孤病毒的分子生物學(xué)、干擾素等的研究有較多報(bào)道。在采取隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成病毒各基因片段的cDNA,將其與載體連接、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之后,用PCR測序,獲知病毒RNA第11片段的部分序列。通過細(xì)胞病變抑制法,測定了呼腸孤病毒誘導(dǎo)草魚外周血中干擾素產(chǎn)生的規(guī)律,了解了其活性達(dá)到高峰的條件及干擾素的作用范圍。利用紫外線滅活的病毒,對在幾種鯉科魚培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素的能力及影響也進(jìn)行了研究。將出血病病毒與隨機(jī)噬菌體九肽庫在體外作用,通過對陽性噬菌體克隆插入序列的分析,推導(dǎo)出抗此種病毒多肽的氨基酸序列。除呼腸孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)外,草魚還有其它病毒分離株(或不同病毒)。如:魚呼腸孤病毒(FishReovirus,FRV),其形態(tài)、大小、核酸類型及致病情況均與GCRV相同,可能是GCRV的不同分離株;呼腸孤病毒(Reovirus,RV),其形態(tài)、核酸類型與GCRV也相同,但直徑較大,使草魚出現(xiàn)以腸出血為主的病癥,并可引起青魚患出血病;小核糖核酸病毒(Picornavirus,PRV),直徑約20—30nm無囊膜的球形病毒,引起草魚以肌肉出血為主的病癥;草魚桿狀病毒(Baculovirusofgrasscarp,GCBV),大小為150×40nm、有囊膜的桿狀RNA病毒,可使某些細(xì)胞形成和胞體。對從患痘瘡病的鯉魚中、瀕死的鱔魚中以及不同地區(qū)的草魚中分離到的呼腸孤病毒進(jìn)行了比較,結(jié)果表明它們的核酸電泳圖譜和抗原性不同。1.3血清學(xué)鑒定及其應(yīng)用傳染性胰臟壞死病是一種在虹鱒稚魚階段流行的急性病毒病,其流行范圍遍及亞、歐、美各國,死亡率極高。1986年在進(jìn)口虹鱒魚中分離到直徑為55—65nm無囊膜的二十面體病毒,該病毒可在RTG—2、R1、PG、CHSE等冷水魚細(xì)胞中繁殖,并引起不同程度的病變;對熱和酸穩(wěn)定,對脂溶劑不敏感。經(jīng)血清學(xué)鑒定為IPNV的Sp株。在制備標(biāo)準(zhǔn)抗血清的基礎(chǔ)上,建立了酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的檢測方法,可在1—2d內(nèi)從病魚組織中檢測病原,并能鑒定出病毒的血清型。還建立了更為靈敏和迅速的生物素標(biāo)記核酸探針檢測IPNV的方法。1.4斑馬魚浚蝦痘瘡病是鯉越冬前后常見、與水環(huán)境密切相關(guān)的傳染性魚病。該病的典型特征是皮膚增生,在患病鯉體表出現(xiàn)石蠟狀的白色增生物斑點(diǎn),即痘瘡。痘瘡與體表結(jié)合緊密,可不斷變多變大,直至遍及體表,患病魚商品價(jià)值降低或喪失。養(yǎng)殖溫度在14℃時(shí),流行最為嚴(yán)重,病魚體表布滿痘瘡,使魚負(fù)載過重,消耗太多而導(dǎo)致死亡。病原是一種皰疹病毒,其直徑約為150nm,外有囊膜,呈球形,能在鯉上皮瘤細(xì)胞(EPC)中增殖并引起病變;在15—18℃條件下,用劃痕或注射的方式感染鯉,能使鯉體表出現(xiàn)痘瘡。1.5及時(shí)感染流行病1.5.1蝦體內(nèi)細(xì)胞超微病變1991年在福建養(yǎng)鰻場,出現(xiàn)了以出血及開口癥為特征的流行病,很快引起鰻鱺的毀滅性死亡。病魚口張開后不能合攏,口腔內(nèi)膜充血,顱內(nèi)、胸鰭和臀鰭出血,腹部有出血斑。經(jīng)解剖可見肝呈灰白色或布滿血絲。經(jīng)電鏡觀察,在自然發(fā)病的鰻白細(xì)胞的胞質(zhì)中有成團(tuán)聚集的病毒顆粒呈晶格狀排列。病毒為直徑40nm的球形顆粒。用病魚心、脾組織的除菌懸液,分別感染健康鰻,前者可引起鰻鱺出現(xiàn)與自然發(fā)病魚一致的病癥;但后者發(fā)病較輕。超微病變的表現(xiàn)是受感染的白細(xì)胞核膜變厚或形成不規(guī)則的褶皺,線粒體腫脹、變圓或空泡化。這是我國對鰻鱺病毒病首次報(bào)道。1.5.2病蝦及病蝦回血后,其病蝦的組織病理學(xué)觀察為原發(fā)病說1995—1997年,在福建歐鰻養(yǎng)殖場中流行“狂游癥”。病鰻在發(fā)病初期無明顯體表癥狀,但呈逆水流或曲線狀快速游動,食量劇減。隨著病情加重,病鰻在水中上下亂竄,并伴有肌肉痙攣,腹部擦傷、甚至穿孔等。解剖僅見肝腫大,而病理檢查可見肝、腎和心的細(xì)胞病變、壞死。經(jīng)人工感染,顯示病鰻比原發(fā)病鰻的組織病理學(xué)變化更嚴(yán)重,等量組織裂解液中的病毒含量為原發(fā)病鰻的10倍。根據(jù)形態(tài)觀察,認(rèn)為是鰻鱺冠狀病毒樣病毒,還可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。另有報(bào)道指出,從患“狂游癥”的病鰻腦細(xì)胞中觀察到一種彈狀病毒,病毒顆粒大小為50—80nm×100—250nm,有包涵體;推測發(fā)病原因是病毒在腦內(nèi)大量復(fù)制,引起腦細(xì)胞腫脹壞死,誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,使魚呈興奮狀的“狂游癥”。1.6對病料的病料指導(dǎo)意義1996年有關(guān)于鱖病毒(Sinipercachuatsivirus,SCV)的最早報(bào)道,包括病毒的形態(tài)大小、回接感染、理化性質(zhì)、病癥和組織病理等。隨后水產(chǎn)科學(xué)院珠江水產(chǎn)研究所、廣州中山大學(xué)等對鱖病毒病也作了描述,但觀察到的病原不同,是虹彩病毒。在鑒定了鱖球形病毒(Sinipercachuatsisphericalvirus,SCSV)病原后,研制了SCSV疫苗,并在實(shí)驗(yàn)室取得明顯免疫防治效果。但將SCSV疫苗用于大水面養(yǎng)殖鱖魚的病毒病防治,卻難達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示,這是由于在患病鱖組織中存在不同病毒的緣故,分別觀察到直徑約為280nm的球形病毒、大小分別約為120×250nm和100×200nm的彈狀病毒與桿狀病毒。另外關(guān)于鱖球形病毒的病理、細(xì)胞培養(yǎng)以及純化等研究也有新進(jìn)展。1.7角形病毒種經(jīng)超薄切片電鏡觀察,從患狂游癥的真鯛幼魚脾和腸組織中檢測到大量直徑約120nm的六角形病毒顆料,主要位于細(xì)胞核內(nèi)。感染的細(xì)胞腫脹,有的比正常細(xì)胞增大5—6倍。2達(dá)芬斯特疾病2.1重組病毒的毒力學(xué)人們習(xí)慣按病毒的形態(tài)及引起宿主的發(fā)病癥狀,或按最先觀察到病毒感染宿主的組織、器官以及出現(xiàn)病理變化的部位對病毒進(jìn)行命名。關(guān)于病毒的中文譯名,遵循準(zhǔn)確簡明、約定成俗的原則。據(jù)此見報(bào)道的各種對蝦病毒名列如下:對蝦桿狀病毒(BaculovirusPenaei,BP);斑節(jié)對蝦桿狀病毒(MonodonBaculovirus,MBV);黃頭桿狀病毒(Yellow-HeadBaculovirus,YBV);白斑桿狀病毒(White-striateBaculovirus,WSBV);澳洲對蝦桿狀病毒(PlebejusBaculovirus,PBV);淋巴組織桿狀病毒(LymphoidOrganBaculovirs,LOBV);類呼腸孤病毒(Roe-LikeVirus,RLV);蝦卵致死病毒(SpawnerMortalityVirus,SMS);對蝦虹彩病毒(ShrimpIridoviru,IRDO);淋巴樣器官細(xì)小病毒(Lymphoid-Organparvovirus,LOPV);中腸腺壞死桿狀病毒(BaculovirusofMidgutGlandNecrosis,BMNorBMNV);傳染性皮下組織和造血器官壞死病毒(InfectiousHypodermalandHaemopoieticNecrosisVirus,IHHNV);肝胰腺細(xì)小病毒(HepatopancreaticParvo-LikeVirus,HPV);淋巴組織空泡化病毒(LymphoidOrganVacculizationVirus,LOVV);對蝦血細(xì)胞桿狀病毒(PenaeusHaemocyticRod-ShapedVrius,PHRSV);血細(xì)胞非包涵體桿狀病毒(Hemocyte-InfectionNonoccludedBaculovirus,HNBV);日本對蝦非包涵體桿菌狀病毒(Non-occludedBacilliformVirusInfectioninPenaeusjapanicus,PjNBV);系統(tǒng)性外胚層和中胚層桿狀病毒(SystemicEctodermalandMesodermal,SEMBV);Taura綜合癥(TauraSyndromeVirus,TSV)蝦病毒歸屬7個(gè)病毒科,感染無脊椎動物的病毒種類有80%以上在患病對蝦中可以找到,其中半數(shù)以上屬于桿狀病毒科。2.2具囊膜的桿狀病毒檢測比較健康和感染草蝦桿狀病毒(MBV)的肝胰腺上皮細(xì)胞的超微病理變化,觀察到感染細(xì)胞的核質(zhì)中,隨著包涵體和MBV增多,核染色質(zhì)凝聚、核膜局部擴(kuò)張,直至整個(gè)核崩解,胞質(zhì)水腫,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、線粒體變性。從山東、廈門等蝦場采集患病的中國對蝦和日本對蝦,制備病蝦的組織切片和從病蝦組織中提純病毒,均可見大量桿狀病毒。病毒顆粒直徑為70—100nm,長度為300—360nm,酶解測定病毒核酸為DNA,在日本對蝦和中國對蝦中觀察到的桿狀病毒在形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小上沒有明顯差別。比較了完整病毒顆粒和核衣殼的結(jié)構(gòu)多肽,表明前者至少有9條,其分子量分別為75kD,65kD,60kD,50kD,42kD,32kD,30kD,28kD和15kD,而后者結(jié)構(gòu)多肽較少,為75kD,65kD和15kD這3條。在進(jìn)行對蝦病毒超微觀察時(shí),比較注意病毒的囊膜和包涵體的有無、病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的位置,這是桿狀病毒的重要特征。從河北采集病蝦樣,觀察到桿狀病毒的平均大小為110×250-300nm,無核內(nèi)包涵體,但在肝胰腺和中腸上皮細(xì)胞的胞核內(nèi)出現(xiàn)了病毒發(fā)生基質(zhì)。從上海郊區(qū)采集病蝦樣,經(jīng)過病蝦的腮、肝、胰腺或中腸組織進(jìn)行超薄切片處理及電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)存在有囊膜包裹的桿狀病毒,有時(shí)一個(gè)囊膜還可同時(shí)包裹兩個(gè)病毒核衣殼。經(jīng)有機(jī)溶劑處理、差速離心及密度梯度離心,可獲得部分提純的病毒。超薄切片中病毒粒子和核衣殼的大小分別為170-180×440-500nm,110-140×330-420nm,而提純的核衣殼為70-85×350-400nm;未見該病毒有包涵體。組織病理學(xué)研究表明,桿狀病毒感染的病蝦甲殼上有典型白班,肝胰腺顏色變淡;經(jīng)蘇木精-伊紅染色,在其前腸上皮、后腸上皮、造血組織、腮、血細(xì)胞等的胞核內(nèi)均有典型的核腫大和深染病變。對長毛對蝦(P.penicillatusAlcock)組織切片進(jìn)行電鏡觀察,在病蝦中腸前段、肝胰腺上皮細(xì)胞核和質(zhì)及腹肌纖維間質(zhì)中看到了大量密集和散布的具囊膜的桿狀病毒。這種病毒引起病蝦中腸和肝胰腺上皮細(xì)胞的主要病變?yōu)榧?xì)胞核肥大、畸形,核內(nèi)被病毒占據(jù)、染色體著邊、縮小,核仁解體分離、核膜增厚,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體減少。用提純的對蝦病毒免疫兔子,獲得較高效價(jià)的抗血清,初步建立了酶聯(lián)免疫吸附測定方法,靈敏度達(dá)60ng。參考昆蟲桿狀病毒和MBV的多角體蛋白基因序列,設(shè)計(jì)了兩對PCR引物,一對引物之間的序列包括決定多角體的全基因,另一對引物包括兩個(gè)相對保守區(qū)。從對蝦皮下及造血組織壞死桿狀病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得800bp和480bpdDNA片段。2.3病毒含單鏈dna的檢測從感病的中國對蝦中分離到一種球形病毒,其直徑約為20±4nm,人工感染使對蝦死亡率為66%。用脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)作用,二苯胺染色,證實(shí)病毒含單鏈DNA。SDS結(jié)果顯示,該病毒含4條結(jié)構(gòu)多肽,其分子量分別為86kD,79kD,70kD及25.5kD,并將此病毒定名為中國對蝦細(xì)小病毒(PenaeuschinesisParvovirus,PcPV)。通過顯微和超微技術(shù),觀察健康對照組、疾病始發(fā)組和瀕臨死亡組的草蝦、中國對蝦、日本對蝦和長矛對蝦的肝胰腺和中腸,在瀕臨死亡組的4種對蝦中發(fā)現(xiàn)了病毒與細(xì)菌的合并感染,其中有MBV、球形病毒和桿狀病毒。病理變化表現(xiàn)為組織的保護(hù)層受損和壞死。3病毒23.1蛙病毒屬virushvirus在已知虹彩病毒科的5個(gè)屬:蛙病毒(Ranavirus)、淋巴囊腫病毒(Lymphocystivirus)、類金魚Ⅰ型病毒(GoldsishvirusI-likeviruses)、昆蟲病毒(Iridovirus)和綠虹彩病毒(Chloriridovirus)中,已證實(shí)蛙病毒屬是兩棲動物重要的病原,可使蝌蚪、幼蛙和蟾蜍致死,但對于自然宿主中的成年蛙來說,為條件致病病原。在12—32℃條件下,能在多種動物培養(yǎng)細(xì)胞中生長。蛙病毒除蛙類以外,有時(shí)也感染魚、禽、哺乳動物。3.2rgv感染的觀察我國養(yǎng)殖的美國青蛙又稱沼澤綠牛蛙(Ranagrylio),原產(chǎn)于北美,于1987年由國外引進(jìn)。引起牛蛙疾病的病原有的是菌,有的是病毒。已經(jīng)證實(shí)從我國最早分離到的美國青蛙病毒(RanagrylioVirus,RGV)屬虹彩病毒,該病原引起的病害主要流行于變態(tài)不久的幼蛙群中。發(fā)病初期,蛙的體表有出血點(diǎn),繼而擴(kuò)展到腹部和四肢,出現(xiàn)充血、出血或潰爛。解剖觀察,可見腸壁嚴(yán)重充血,腸道內(nèi)空而無物。此病病程短、蔓延極快,一旦發(fā)病,僅2d左右蛙群中的死亡率就可達(dá)90%。用粗提的病毒液接種到長成單層的培養(yǎng)細(xì)胞上,可引起不同魚類細(xì)胞產(chǎn)生病變。培養(yǎng)溫度對RGV擴(kuò)增有明顯影響,在20℃—30℃范圍內(nèi),隨溫度升高細(xì)胞病變時(shí)間縮短,病毒滴度增加。對人工感染RGV的蛙組織切片進(jìn)行顯微觀察,顯示肝、腎、心、脾、腸和肺中的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同程度受損,并喪失功能。經(jīng)電鏡觀察,了解到病毒在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)發(fā)生及與宿主細(xì)胞的相互作用,揭示了RGV的感染機(jī)理。自1995—1998年,已從不同地區(qū)和不同生長期的病蛙中分離到3株虹彩病毒,中國科學(xué)院水生生物研究所的學(xué)者現(xiàn)正與美國學(xué)者合作,對蛙不同虹彩病毒分離株的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較研究。4合成病毒4.1病毒的致病性研究雖然60年前就有綠海龜纖維性乳頭瘤(Greenturtlesfibropapillomas,GTFP)的記載,但直到90年代有關(guān)研究才有明顯進(jìn)展。觀察到其它海龜中也出現(xiàn)類似的病害。通過多聚酶增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄(Polymeraseenhancedreversetranscriptase,PERT)技術(shù),證明夏威夷群島出現(xiàn)的GTFP是逆轉(zhuǎn)病毒所致。此外爬行動物病毒研究的資料尚不多。4.2tsv的基本原理通過采集患病中華鱉樣品,結(jié)合電鏡觀察及對多種細(xì)胞的感染性測定等,發(fā)現(xiàn)中華鱉病毒;并經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)病毒是引起中華鱉病害流行的重要病原。中華鱉病毒(TrionyxsinersisVirusis,TSV)是直徑為30nm的無囊膜球形病毒。TSV有5條結(jié)構(gòu)多肽,其分子量分別為85kD,60kD,55kD,18kD和12kD,其中18kD和12kD的多肽是該病毒結(jié)構(gòu)蛋白的主要成分。TSV增殖明顯受溫度的影響;TSV可導(dǎo)致宿主細(xì)胞凋亡和壞死。近年,廈門大學(xué)、廈門水產(chǎn)研究所、中山大學(xué)、長江水產(chǎn)研究所、深圳動植物檢疫局等多家研究單位和大學(xué)也相繼開展了有關(guān)研究。應(yīng)用電鏡超薄切片技術(shù),對福建省養(yǎng)鱉場采集的患出血病鱉樣進(jìn)行觀察,見到一種直徑為35-39nm的球形病毒,該病毒分布在病鱉的肺、胃、咽喉粘膜和腹甲皮層,主要靶細(xì)胞是細(xì)小血管的內(nèi)皮細(xì)胞。還從深圳一甲魚場患“紅脖子”病的甲魚中分離到虹彩病毒。5其他水生動物病毒5.1組織病理及分析方法關(guān)于螃蟹病毒病原的研究,國外雖早些時(shí)候已對兩種呼腸孤病毒(P&W)作了報(bào)道,但國內(nèi)近年才開始這方面的研究,包括對中華絨螯蟹顫抖病病原的初步研究和對中華絨螯蟹小核糖核酸病毒及其組織病理等研究。經(jīng)電鏡在病蟹組織的超薄切片中觀察到無囊膜、直徑為28-32nm的球形病毒顆粒,根據(jù)病毒的形態(tài)和染色反應(yīng),推測該病毒為小RNA病毒,并進(jìn)行了回接感染及病理分析。另在蝦池中發(fā)現(xiàn)有蟹帶病毒。5.2角蝶病毒病毒的種類1978年連續(xù)發(fā)生大面積、被稱為“三角蚌瘟病”的傳染性蚌病,1986年確定為病毒病,1987年分離到病原,經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為嵌沙樣病毒(Arenaviridae),并定名為三角帆蚌瘟病毒(HyriopsiscumingiiPlagueVirus,HcPV)。從自然發(fā)病的三角帆蚌中分離到蚌瘟病毒,這是一種呈球形或多形態(tài)、直徑為40—210nm的病毒。病毒基因組由33S、28S、22S、18S和5S等5個(gè)分節(jié)段的單鏈RNA分子。病毒多肽有4個(gè),分子量分別為46kD、41kD、39kD和18kD。5.3球形病毒病1994—1996年對大連地區(qū)患有“裂殼病”的養(yǎng)殖鮑苗種進(jìn)行顯微和超微觀察,并通過人工感染證實(shí),該病的病原是大小為90—140nm的球形病毒,該病毒主要侵染血細(xì)胞。病癥為鮑殼薄,殼緣外翻,殼孔相互串聯(lián),攝食力降低,生長緩慢,逐漸死亡。對外套膜、足、腮、肝、嗉囊及胃腸7個(gè)主要器官的組織病理變化進(jìn)行觀察,結(jié)果表明其病變的共同特征是結(jié)締組織排列紊亂,細(xì)胞壞死。6防止病毒病流行擴(kuò)散及早發(fā)現(xiàn)和確診水生動物是否被病毒感染,并采取相應(yīng)措施防止病毒病流行擴(kuò)散是減少生產(chǎn)中損失最有效的途徑。病毒病的診斷方法雖多種多樣,但可簡要?dú)w納為下述幾類。6.1蝦體表面可受病毒污染利用某些宿主對病毒侵染易感的特點(diǎn),將其作為指示動物,可對水生動物病毒病進(jìn)行初步檢測。如藍(lán)對蝦感染病毒后,癥狀很明顯。當(dāng)把懷疑帶病毒的對蝦組織投喂給它,或?qū)⑦@種對蝦組織勻漿后的上清液注射到指示蝦體內(nèi),觀察反應(yīng)。如果被檢者帶有病毒,則可傳染指示蝦,在實(shí)驗(yàn)2—3周將出現(xiàn)相應(yīng)的病癥,據(jù)此可診斷樣蝦是否被病毒感染。又如,在中國科學(xué)院院士曹文宣研究員的指導(dǎo)下,王劍偉博士養(yǎng)殖的稀有鯽,是一種對草魚出血病病毒很敏感的魚,用含有病毒的勻漿液注射或浸泡后1—2周后,就可產(chǎn)生出血癥。因此,可用稀有鯽作為草魚出血病病毒的指示動物。6.2病蝦組織病理學(xué)觀察從大量的鏡檢觀察中,人們發(fā)現(xiàn)和總結(jié)出一些特征性的數(shù)據(jù)或指標(biāo),使顯微鏡技術(shù)成為用于對某種水生動物病毒鑒定和診斷的重要方法之一。顯微鏡觀察既可采用光鏡,也可通過電鏡進(jìn)行。以患病對蝦鏡檢為例,在普通光鏡下可見感染病毒的對蝦組織甚至細(xì)胞發(fā)生病理變化,再配合使用適當(dāng)?shù)娜旧夹g(shù),還可觀察到包涵體。如對HPV輕度感染的病蝦組織切片進(jìn)行觀察,可見細(xì)胞核膨大,核內(nèi)有包涵體。包涵體在形成早期為輕度嗜堿性,HE染色呈紫紅;而在后期包涵體為嗜酸性,HE染色呈紫藍(lán)。其它水生動物病毒,包括草魚出血病病原、鯉魚痘瘡病病原、鰻鱺開口病和狂游病病原、對蝦爆發(fā)性流行病多種病原、牛蛙病毒病原、中華鱉流行病不同的病毒病原,還有貝、蟹等的病毒病原,其中有相當(dāng)多的資料是來自電鏡觀察?，F(xiàn)在電鏡用于研究水生動物病毒的研究,其視野已不局限于觀察細(xì)胞病變、病毒的形態(tài)大小和分類,而且擴(kuò)展到用于了解病毒的感染和復(fù)制機(jī)理、病毒的形態(tài)發(fā)生等。病毒囊膜的有無是水生動物病毒的基本結(jié)構(gòu)及分類特征之一,對此電鏡觀察能提供直接證據(jù)。如通過電鏡觀察和結(jié)構(gòu)多肽分析表明,斑節(jié)對蝦桿狀病毒可以有囊膜和無囊膜兩種形式存在,它們的結(jié)構(gòu)多肽有差異,密度也不同,可通過密度梯度離心將它們分離。詳細(xì)觀察牛蛙病毒(RGV)的吸附、入侵、脫殼、復(fù)制與裝配等全部增殖過程也是借助電鏡完成的。6.3抗氧化物歧化酶在對淡水螯蝦研究時(shí)發(fā)現(xiàn):在對異物識別等免疫反應(yīng)中,起關(guān)鍵作用的是其血細(xì)胞的酚氧化酶原系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中當(dāng)酶原被激活后,則可促進(jìn)血細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒應(yīng)答反應(yīng)。在研究感染病毒的中國對蝦肝胰臟病理變化時(shí),檢測到病蝦肝胰臟的酯酶(Esterase,EST)和超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)的活性顯著減弱,表明病蝦代謝功能與免疫功能明顯衰退。由此可見:通過對某些特定生化物質(zhì)的檢測,可了解宿主動物被病毒感染與否及其應(yīng)答情況。6.4細(xì)胞敏感度差異細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是病毒學(xué)研究的基礎(chǔ),也是用于病毒病診斷的經(jīng)典方法之一(表4)。當(dāng)然,不同病毒的敏感宿主細(xì)胞有可能不同。因此,在試圖通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法鑒定和分離病毒時(shí),需事先了解某種細(xì)胞對病毒的敏感性。6.5病毒、核酸和耐藥藥物的應(yīng)用建立敏感可靠的方法,以用于病毒病原