高通量測(cè)序技術(shù)的類型原理及應(yīng)用-ppt

高通量測(cè)序技術(shù)姓名：趙淑莉?qū)W校：吉林大學(xué)主要內(nèi)容類型及原理2應(yīng)用341概述致謝概述高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughputsequencing)

又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)”、深度測(cè)序

以能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短等為標(biāo)志。

這使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。類型及原理

目前，所說的高通量測(cè)序技術(shù)主要是指454LifeSciences公司、ABI

公司和Illumina公司推出的第二代測(cè)序技術(shù)以及HelicosHeliscopeTM和PacificBiosciences

推出的單分子測(cè)序技術(shù)。2005年，454LifeSciences公司(現(xiàn)已被Roche公司收購(gòu))首先推出了革命性的基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)，開創(chuàng)了第二代測(cè)序技術(shù)的先河。第二代測(cè)序技術(shù)原理：酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1.首先將PCR

擴(kuò)增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA

聚合酶、ATP

硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。第二代測(cè)序技術(shù)2.在每一輪測(cè)序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。原理：酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)3.焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP

就會(huì)促使氧合熒光素的合成并釋放可見光，CCD檢測(cè)后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第二代測(cè)序技術(shù)此后，Illumina

公司和ABI公司相繼推出了Solexa和SOLiD(supportedoligoligationdetetion)測(cè)序技術(shù)。第二代測(cè)序技術(shù)

即生成新DNA

互補(bǔ)鏈時(shí)，要么加入的dNTP通過酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標(biāo)記的dNTP

或半簡(jiǎn)并引物，在合成或連接生成互補(bǔ)鏈時(shí)釋放出熒光信號(hào)。通過捕獲光信號(hào)并轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息。原理：與焦磷酸測(cè)序法的類似，核心思想都是邊合成邊測(cè)序(sequencingbysynthesis)。第二代測(cè)序技術(shù)第二代測(cè)序技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：操作極為簡(jiǎn)便：無需進(jìn)行電泳；可以在芯片上進(jìn)行高通量分析；大大節(jié)省了成本和時(shí)間。Illumina公司目前擁有三種測(cè)序平臺(tái)，分別為HiSeq2000、HiSeq1000、GenomeAnalyzerIIx(/)；ABI公司則主要是SOLiD3

和SOLiD4兩個(gè)測(cè)序平臺(tái)。

從通量這個(gè)最直觀的數(shù)字看來，HiSeq2000領(lǐng)先于SOLiD4。

HiSeq2000測(cè)序平臺(tái)單次反應(yīng)可以讀取200G的數(shù)據(jù)，而SOLiD4

僅為100G

左右。第二代測(cè)序技術(shù)

就測(cè)序讀長(zhǎng)來說，454

測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，目前已經(jīng)達(dá)到400nt。因此，454

平臺(tái)比較適合對(duì)未知基因組從頭測(cè)序，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時(shí)準(zhǔn)確度不高。Solexa

測(cè)序讀長(zhǎng)較454短，僅為100nt

左右，但測(cè)序通量高、價(jià)位低，適合基因組重測(cè)序等。SOLiD讀長(zhǎng)也較短，但測(cè)序精度較高，特別適合SNP檢測(cè)等。在第二代測(cè)序平臺(tái)不斷完善和廣泛應(yīng)用的同時(shí)，以對(duì)單分子DNA進(jìn)行非PCR測(cè)序?yàn)橹饕卣鞯母碌臏y(cè)序技術(shù)也初顯端倪。2008年4月HelicoBioScience公司的Harris等在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的基于全內(nèi)反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測(cè)序技術(shù)—單分子測(cè)序技術(shù)。單分子測(cè)序技術(shù)基于全內(nèi)反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測(cè)序技術(shù)原理：1.將待測(cè)DNA樣品隨機(jī)打斷成小片段，在每個(gè)小片段的末端加上poly-dA；2.將小片段DNA模板與固定在檢測(cè)芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位，并逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子；單分子測(cè)序技術(shù)3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團(tuán)；4.洗滌、加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入；5.這樣通過摻入、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時(shí)讀取大量序列。單分子實(shí)時(shí)技術(shù)(SMRT)單分子測(cè)序技術(shù)

該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取測(cè)序產(chǎn)物。SMRT測(cè)序技術(shù)在測(cè)序速度、讀長(zhǎng)和成本方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力。IonPGM測(cè)序技術(shù)原理

基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)，在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，隨著每個(gè)堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個(gè)孔底部時(shí)能被檢測(cè)到。單分子測(cè)序技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)：大大節(jié)省了成本和時(shí)間主要缺點(diǎn)：測(cè)序儀的價(jià)格昂貴單分子測(cè)序技術(shù)

目前HelicoBioScience公司的HeliScope測(cè)序儀售價(jià)近百萬美元，這是一般實(shí)驗(yàn)室和科研單位所不能承受的。LifeTechologies公司推出的IonPersonalGenomeMachine(PGMTM)測(cè)序儀價(jià)格僅為普通測(cè)序儀的1/10，而且研究人員能夠在2h內(nèi)獲取從10Mb到1Gb以上高精確度序列。單分子測(cè)序技術(shù)大規(guī)模平行測(cè)序(massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)：它利用芯片進(jìn)行測(cè)序，可以在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測(cè)序，把平行處理的思想用到極致。高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)成本低廉：利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行人類基因組測(cè)序，耗資不到傳統(tǒng)測(cè)序法的1%。高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)高通量測(cè)序技術(shù)有完美的定量功能：這是因?yàn)闃悠分心撤NDNA被測(cè)序的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度。這一點(diǎn)有望取代以前的基因表達(dá)芯片技術(shù)用于基因表達(dá)的研究。高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用大規(guī)?；蚪M測(cè)序基因表達(dá)分析非編碼小分子RNA的鑒定轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選DNA甲基化相關(guān)研究其他全基因組測(cè)序

高通量測(cè)序技術(shù)在發(fā)展初期由于讀長(zhǎng)較短，使其在對(duì)未知基因組從頭測(cè)序(denovoSequencing)的應(yīng)用受到限制，只能用于基因組重測(cè)序。基因組重測(cè)序是指對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。高通量RNA測(cè)序及其在轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)調(diào)控上的應(yīng)用

最近科學(xué)家們將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析開發(fā)出了RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)，該技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)基因表達(dá)情況，進(jìn)行差異基因篩選分析。

由于RNA-Seq技術(shù)具有通量高、可重復(fù)性高、檢測(cè)范圍寬、定量準(zhǔn)等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉(zhuǎn)錄組的研究。

轉(zhuǎn)錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。但是，多數(shù)研究人員感興趣的是某一特定的生物過程、發(fā)育階段或處理后的基因表達(dá)情況。

建立在高通量測(cè)序基礎(chǔ)上的數(shù)字化基因表達(dá)譜(digitalgeneexpressionprofiling)分析無需預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)任何生物整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，因此應(yīng)用范圍更加廣泛。

高通量RNA

測(cè)序技術(shù)另一個(gè)廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小RNA的研究。

小RNA在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和外界脅迫應(yīng)答等方面具有重要功能。

但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基因芯片檢測(cè)小RNA非常困難。

高通量測(cè)序技術(shù)不但能夠克服這一難題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNA。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)