PCR詳細講解-課件

PCR1ppt課件PCR1ppt課件PCR（PolymeraseChainReaction)技術即聚合酶鏈式反應，又稱DNA體外擴增技術。1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學獎。2ppt課件PCR（PolymeraseChainReactioDNA半保留復制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復性的性質。PCR的基本原理3ppt課件DNA半保留復制的機理；PCR的基本原理3ppt課件PCR擴增體系模板（Template）：基因組、質粒DNA、cDNA，也可以是細菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴增目的序列的特異性；確定擴增產物長度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動PCR反應進行的機器。擴增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強劑4ppt課件PCR擴增體系模板（Template）：基因組、質粒DNA、1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補區(qū)結合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理5ppt課件1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。P6ppt課件6ppt課件7ppt課件7ppt課件高溫變性8ppt課件高溫變性8ppt課件低溫退火9ppt課件低溫退火9ppt課件中溫延伸10ppt課件中溫延伸10ppt課件11ppt課件11ppt課件12ppt課件12ppt課件13ppt課件13ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴增30循環(huán)，目標DNA可增加230也就是109倍。實際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴增產物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實際上進行30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)一般可達106～107。14ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴增30循環(huán)，目標DNAPCR擴增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補序列，并與特定位點雜交。2.中期（M期）：擴增反應順利進行，產物呈指數(shù)型增長。3.晚期（L期）：平臺期，DNA聚合酶過度損耗或者產物的抑制。15ppt課件PCR擴增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互PCR擴增條件預變性94℃5min變性94℃30s退火45~65℃30s延伸72℃30s終延伸72℃7min循環(huán)16ppt課件PCR擴增條件預變性94℃5min變性94℃30s退火4PCR反應條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產物：506bp舉個例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個循環(huán)17ppt課件PCR反應條件PC1-P20：舉個例子PCR體系（10μL1.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應條件3.設置對照組：①PCR空白對照：在反應體系中剔除反應模板。②PCR陰性對照：即反應體系中用無關的基因片段代替目的模板。③PCR陽性對照：即反應體系中以已知能夠成功進行特異性擴增的模板。PCR的注意事項18ppt課件1.避免PCR試劑的污染PCR的注意事項18ppt課件1.為什么完全沒有PCR擴增產物？①試劑質量問題或者加樣時出錯，導致反應體系不完整。②聚合酶失活或反應體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應溫度設計不合理⑥靶片段GC含量過高或擴增對象長常見問題19ppt課件1.為什么完全沒有PCR擴增產物？常見問題19ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見問題20ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？常見問題20ppt課件3.為什么PCR產物很少？①聚合酶活性過低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過低。常見問題21ppt課件3.為什么PCR產物很少？常見問題21ppt課件4.為什么PCR產物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過高。③退火溫度過低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導致非特異擴增。常見問題22ppt課件4.為什么PCR產物出現(xiàn)片狀拖尾？常見問題22ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀23ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀23ppt課件實時熒光定量PCR儀24ppt課件實時熒光定量PCR儀24ppt課件引物設計25ppt課件引物設計25ppt課件為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應的關鍵，同時也與PCR擴增的效率密切相關。引物設計的最重要的原則：最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。引物設計的目的26ppt課件為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板D1、引物應具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復雜的模板中擴增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設計區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過70%或有連續(xù)8個互補堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設計的基本原則27ppt課件1、引物應具有足夠的特異性。引物設計的基本原則27ppt課件2、避開易形成二級結構的模板序列區(qū)域。

分子內互補、發(fā)夾結構、分子間互補。

二級結構會增加引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。

用有關軟件預測mRNA的穩(wěn)定二級結構。

引物設計的基本原則28ppt課件2、避開易形成二級結構的模板序列區(qū)域。引物設計的基本原則2829ppt課件29ppt課件3、引物長度一般為18-30個堿基之間。引物長度與反應的特異性和解鏈溫度成正相關。過短：擴增特異性下降過長：引物自身形成二級結構，以及引物二聚體。引物設計的基本原則30ppt課件3、引物長度一般為18-30個堿基之間。引物設計的基本原則34、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會對引物的解鏈溫度產生影響。G+C含量過低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴增條帶。引物設計的基本原則31ppt課件4、G+C含量一般為40%-60%引物設計的基本原則31pp5、Tm值之差應小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對引物的Tm值差過大可直接導致PCR擴增效率下降或失敗。對于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設計的基本原則32ppt課件5、Tm值之差應小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。引物設6、引物中四種堿基最好是隨機分布的避免4個以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復。特別是引物的3’端不應有連續(xù)3個G或C，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)域產生錯配，降低擴增的特異性。引物設計的基本原則33ppt課件6、引物中四種堿基最好是隨機分布的引物設計的基本原則33pp7、引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身互補——發(fā)夾結構

引物之間互補——二聚體

引物自身連續(xù)互補堿基不應超過3個，引物之間連續(xù)互補堿基不應超過4個，尤其避免3’端的互補重疊。引物設計的基本原則34ppt課件7、引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物設計的基本原則38、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴增的特異性。如：加酶切位點、標記生物素、引入點突變等。

由于延伸是從3’端開始的，所以不能進行任何修飾。引物設計的基本原則35ppt課件8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物設計的基本原9、引物的3’端不可以A結尾。引物3’端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設計的基本原則36ppt課件9、引物的3’端不可以A結尾。引物設計的基本原則36ppt課10、引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。引物設計的基本原則37ppt課件10、引物3’端要避開密碼子的第3位。引物設計的基本原則371、避免重復堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個堿基內不能有多于2個的G或C。5、引物的產物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長至300bp）。

Real-TimePCR引物設計原則38ppt課件1、避免重復堿基，尤其是G。Real-TimePCR引物設6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴增產物應跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設計原則39ppt課件6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。Real-PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設計常用軟件40ppt課件PrimerPremier5.0引物設計常用軟件40ppFileNewDNAsequence粘貼模板序列41ppt課件FileNewDNAsequence粘貼模板序42ppt課件42ppt課件引物搜索43ppt課件引物搜索43ppt課件引物位置產物大小引物長度44ppt課件引物位置產物大小引物長度44ppt課件45ppt課件45ppt課件46ppt課件46ppt課件47ppt課件47ppt課件48ppt課件48ppt課件49ppt課件49ppt課件50ppt課件50ppt課件Oligo51ppt課件Oligo51ppt課件52ppt課件52ppt課件53ppt課件53ppt課件54ppt課件54ppt課件55ppt課件55ppt課件PrimerBLAST56ppt課件PrimerBLAST56ppt課件57ppt課件57ppt課件58ppt課件58ppt課件59ppt課件59ppt課件60ppt課件60ppt課件逆轉錄PCR61ppt課件逆轉錄PCR61ppt課件由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA（cDNA）稱作逆轉錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。

逆轉錄PCR的原理62ppt課件由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA（cDNA）稱作逆轉逆轉錄PCR的原理63ppt課件逆轉錄PCR的原理63ppt課件逆轉錄PCR的反應體系1、模板RNA2、逆轉錄酶3、逆轉錄引物64ppt課件逆轉錄PCR的反應體系1、模板RNA64ppt課件65ppt課件65ppt課件66ppt課件66ppt課件67ppt課件67ppt課件變性94℃30s

93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對富含G+C的靶序列而言。68ppt課件變性94℃30s93-96℃，較高的溫度變性更快更退火45~65℃30s

退火溫度與時間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。退火溫度可以通過計算推斷，通常采用溫度梯度PCR的方法進行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火溫度摸索69ppt課件退火45~65℃30s退火溫度與時間取決于引物的堿延伸72℃30s

延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般為72℃；延伸的時間主要取決于目的片段的大小，不同種類的聚合酶的合成效率也不同，因此還與DNA聚合酶的種類有關。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min70ppt課件延伸72℃30s延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的循環(huán)數(shù)：

在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下30-35個循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：會增加非特異擴增產物的數(shù)量和復雜性。循環(huán)數(shù)太少：PCR產量太低。71ppt課件循環(huán)數(shù)：71ppt課件逆轉錄引物：

（1）隨機六聚核苷酸引物

僅長6個核苷酸，每個核苷酸位點上隨機加入4中不同的脫氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合體。

所有RNA分子均可以充當模板，合成的cDNA中有96%來自rRNA。72ppt課件逆轉錄引物：72ppt課件逆轉錄引物：

（2）Oligo（dT）

僅由dTTP構成，長度一般為18-24個核苷酸。

識別mRNA的3’端poly（A）尾，因此僅mRNA可被逆轉錄。73ppt課件逆轉錄引物：73ppt課件逆轉錄引物：

（3）特異性引物

能與目標RNA堿基序列互補的寡核苷酸引物，僅產生待分析基因的cDNA。74ppt課件逆轉錄引物：74ppt課件半定量RT-PCR75ppt課件半定量RT-PCR75ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,SqRT-PCR）是常用的一種簡捷、特異的定量RNA測定方法，通過mRNA反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增，并測定PCR產物的數(shù)量，可以推測樣品中特異mRNA的相對數(shù)量。定量RT-PCR（quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,qRT-PCR）是在用一步法或兩步法，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。76ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatie灰度值（IOD值）

用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析目的條帶的平均密度值，也稱為灰度值。是density和area的乘積。平臺效應

PCR擴增屬于酶促反應，所以，DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當引物-模板/DNA/聚合酶達到一定比值時，酶的促化反應趨于飽和，此時靶DNA產物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺效應。管家基因

持家基因(house-keepinggenes)：又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因,其產物是對維持細胞基本生命活動所必需的。管家基因表達水平受環(huán)境因素影響較小，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。它的表達只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制調節(jié)。77ppt課件灰度值（IOD值）77ppt課件基本原理PCR擴增反應是酶促反應，遵循酶促動力學原理，開始的循環(huán)內擴增產物呈指數(shù)積累，產物與模板呈線性關系。半定量RT-PCR技術正是利用產物與模板量的這一線性關系，通過擴增產物來對比總RNA中目的基因的表達。78ppt課件基本原理PCR擴增反應是酶促反應，遵循酶促動力學基本流程79ppt課件基本流程79ppt課件注意的問題RNA的提取做RT前必需測RNA濃度，常用500ng或1ug。A260/A280和A260/A230A260/A280在1.8-2.0時，認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，當用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯；當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。如果RNA樣品的260/280=1-1.5,260/230=1-1.5，那么污染原因就應該考慮是酚殘留。如果RNA樣品的260/280>=2，260/230<1，那么污染原因就應該考慮是胍鹽殘留。80ppt課件注意的問題RNA的提取80ppt課件注意的問題RNA的電泳圖譜一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是如果僅僅是為了檢測RNA的質量，用普通的瓊脂糖膠就可以了。電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，RNA的質量是好的。注意的問題81ppt課件注意的問題RNA的電泳圖譜注意的問題81ppt課件注意的問題引物設計所設計引物的擴增效率和特異性要好，一般選擇在基因的cds區(qū)域設計引物，在可能的情況下將PCR引物置于基因的不同外顯子上以消除基因和mRNA的共線性。注意的問題82ppt課件注意的問題引物設計注意的問題82ppt課件注意的問題內參的選擇為了客觀地比較不同樣本中目標基因表達量的相對多少，消除由于反轉錄時總RNA濃度差異造成的誤差，要選擇合適的Control基因。經常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、β-actin、18SrRNA、28SrRNA等83ppt課件注意的問題內參的選擇83ppt課件注意的問題同管擴增或異管擴增的選擇同管擴增的優(yōu)點：保證擴增效率一致。缺點：兩種基因相互競爭，會影響擴增的進程。分管擴增的優(yōu)點：保證每個基因的擴增進程優(yōu)化。缺點：擴增效率不能保證一致。注意的問題84ppt課件注意的問題同管擴增或異管擴增的選擇注意的問題84ppt課件注意的問題PCR循環(huán)數(shù)的確定最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。actin和GAPDH<28-30，否則增加模板量注意的問題85ppt課件注意的問題PCR循環(huán)數(shù)的確定注意的問題85ppt課件注意的問題其他擴增條件固定（時間）循環(huán)數(shù)、循環(huán)時間、變性時間、退火和延伸、升降溫的速度體系固定（PCRmix）dNTPs、引物、反應模板、DNA聚合酶PCR儀固定凝膠濃度EB濃度梳子的選擇掃膠（曝光）注意的問題86ppt課件注意的問題其他注意的問題86ppt課件結果分析將要比較的兩個樣品的內參調成一樣的亮度；根據(jù)擴增內參時加入的cDNA量，進行目標基因的PCR擴增；電泳掃描后，計算灰度值，先用一個標本的目標和內參進行比較，然后用這個相對值再去和其他你所要比較的平行組進行比較，一般每組3個樣本以上。結果分析87ppt課件結果分析將要比較的兩個樣品的內參調成一樣的亮度；結果分析87實時熒光定量PCR技術介紹(RealtimeQuantitativePCR)88ppt課件實時熒光定量PCR技術介紹88ppt課件實時熒光定量PCR定義

在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法89ppt課件實時熒光定量PCR定義在PCR反應體系中加入熒光基團實時熒光定量PCR原理實時原理常規(guī)PCR技術：

對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測實時定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析90ppt課件實時熒光定量PCR原理實時實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念：擴增曲線、熒光閾值、Ct值如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析91ppt課件實時熒光定量PCR原理定量原理介紹三個概念：如何對起始模板定實時熒光定量PCR原理-----------擴增曲線擴增曲線圖：

橫坐標：擴增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標：熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集熒光基團熒光檢測元件92ppt課件實時熒光定量PCR原理-----------擴增曲線擴實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾值（threshold）：

前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段

真正的信號:熒光信號超過域值93ppt課件實時熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號閾實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t)value94ppt課件實時熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號量Ct值的特點：相同模板進行96次擴增，終點處產物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性95ppt課件實時熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸實時熒光定量PCR原理---------標準曲線

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量96ppt課件實時熒光定量PCR原理---------標準曲線非特異性熒光標記：

1、SYBRGreen特異性熒光標記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

實時熒光定量PCR原理---------DNA產物的熒光標記97ppt課件非特異性熒光標記：實時熒光定量PCR原理-------實時熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法98ppt課件實時熒光定量PCR方法1---------SYBRGSYBRGreen法工作機理SYBRGreen能結合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBRGreen99ppt課件SYBRGreen法實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理100ppt課件實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工實時熒光定量PCR方法2---------Taqman探針法101ppt課件實時熒光定量PCR方法2---------Taqman實驗方法RealTimePCR嚴格上可以區(qū)分為DNA起始的RealTimePCR和RNA起始的RealTimeRT-PCR。102ppt課件實驗方法RealTimePCR嚴格上可實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析103ppt課件實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔SYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準確非特異性產物104ppt課件SYBRGreen法CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量105ppt課件CyclenumberFlourescencCk102SYBRGreen法------------引物設計106ppt課件SYBRGreen法------------引物SYBRGreen法------------PCR反應的建立反應體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產物反應Buffer體系的優(yōu)化反應溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同107ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法------------PCR反應性的確認108ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法------------PCR條件優(yōu)化109ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

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