課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) (8)

1、課題2 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),一、課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細菌利用尿素的原因,土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶,你能想一想怎樣能將分解尿素的細菌從土壤中分離出來嗎？,想一想,實例：Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),DNA多聚酶鏈式反應(yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)。此項技術(shù)的自動化，要求使用耐高溫的DNA聚合酶，該去哪里尋找？,科學(xué)家是從水生耐熱細菌 Taq中分離到耐高溫的Taq DNA聚合酶的。,美國黃石國家公園的一個熱泉,（一） 篩選菌株,一、研究思路,啟示：尋找

2、目的菌株時要根據(jù)它對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,1、自然界中目的菌株的篩選,如將細菌接種到以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。在這種情況下其他微生物因缺少氮素而不能生長，只有分解尿素的微生物或者自生固氮微生物才能正常生長繁殖。,2、實驗室中目的菌株的篩選,人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等）,同時抑制或阻止其他微生物生長。,3、選擇培養(yǎng)基,在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,(1)原理：,(2)方法：利用_分離,選擇培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基配方,（1）在左圖的培養(yǎng)基配方中，碳源和氮源分別是什么？,(2)該培養(yǎng)基是

3、否有選擇作用？如果有，又是如何進行篩選的？,有；以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基，可以分離得到含有脲酶的微生物。,碳源：葡萄糖； 氮源：尿素,(參閱三維設(shè)計P19 “點重難”“選擇培養(yǎng)基的選擇作用”內(nèi)容）,（3）如果想分離純化金黃色葡糖球菌和分解泄漏石油的細菌，如何配制選擇培養(yǎng)基？,1、顯微鏡直接計數(shù)：,利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目：,缺點：,不能區(qū)分死菌與活菌； 個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；,2、稀釋涂布平板法（活菌計數(shù)法）,原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。,恰當?shù)南♂尪仁浅晒y(tǒng)計菌落數(shù)目的

4、關(guān)鍵。,每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,樣品稀釋培養(yǎng)示意圖,注意事項 為了保證結(jié)果準確，一般選擇選 30300個菌落的平板統(tǒng)計。 每個稀釋度取3個平板，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。 涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。,1、用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是 ( ) A.涂布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230。 B.涂布了

5、兩個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260， 取平均值238。 C.涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212 和256，取平均值163。 D.涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是2l0、240 和250，取平均值233 。,D,【反饋練習(xí)】,2教材中P22楷體字部分所列舉的兩位同學(xué)對菌落數(shù)的統(tǒng)計，哪位同學(xué)的結(jié)果更接近真實值？,第一位同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)設(shè)置了重復(fù)組，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另 2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。,設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板，

6、作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否基本一致；結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。,是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。,（三）設(shè)置對照：,（1）設(shè)置對照的目的：,（2）對照實驗：,指除了被測試的條件外，其他條件都相同的實驗。,實驗組： 對照組：設(shè)置對照 - 同等條件下，培養(yǎng)空白培養(yǎng)基。,實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學(xué)從對應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。,原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(

7、或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進行實驗,方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A同學(xué)無錯誤；反之則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,小結(jié)：通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,怎樣才能判斷A同學(xué)實驗過程是否正確呢？,二、實驗設(shè)計,（二）制備培養(yǎng)基：,從富含有機物、潮濕、酸堿度適中的土壤中取樣。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。,制備選擇培養(yǎng)基(尿素為唯一氮源)(9個平板培養(yǎng)基) 制備牛肉膏蛋白胨培

8、養(yǎng)基,（對照作用）,思考？為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？,（一）土壤取樣,（三）樣品的稀釋,保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù) 的平板,（1）測細菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液 （2）測放線菌：一般用103、104、105稀釋液 （3）測真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液,應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：,目的：,不同微生物在土壤中含量不同,（四）涂布平板,（1）實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,（2）如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30-30

9、0的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)；如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。,參照三維設(shè)計P19讀教材,按濃度捆成一摞,恒溫37培養(yǎng),（五）微生物的培養(yǎng)與觀察,不同種類的微生物,往往需要不同的_和_。,細菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,1、培養(yǎng)：,培養(yǎng)時間,培養(yǎng)溫度,2、觀察：,（1）在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。 (這樣以防止因_不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目) 。最后選取_時的記錄作為結(jié)果。 （2）以“穩(wěn)定菌落”為觀察對象。 原因：不同種類的細菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤

10、度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，_可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。,培養(yǎng)時間,菌落數(shù)目穩(wěn)定,菌落特征,不同形態(tài)的菌落,三、操作提示,1、無菌操作,2、做好標記,3、規(guī)劃時間,1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,對照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,四、結(jié)果分析與評價,2.樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)。,3.重復(fù)組的結(jié)果是否一致,如果各位同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)

11、該接近。如果結(jié)果相差太遠，則需要從各項操作過程中去分析、尋找可能的原因。,能分解尿素的細菌的鑒定,鑒定的原理： 細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，會使培養(yǎng)基的pH升高。 鑒定方法： 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，利用此培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。,(七)課 題 延 伸,1、用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，其結(jié)果與實際值相比（ ） A.比實際值高 B.比實際值低 C.和實際值一致 D.比實際值可能高也可能低,B,2、下列能選擇出分解尿素的細菌的培養(yǎng)基是( ) A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水 B.KH2PO4、Na2H

12、PO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、瓊脂、水 C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、瓊脂、水 D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、水,A,【反饋練習(xí)】,3.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別,C,4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物 C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,C,5、下圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效果圖。則獲得圖A效果的接種方法是_，圖B效果的接

13、種方法是_，一同學(xué)在純化土壤中的細菌時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上的菌落連成一片，最可能的原因是_（答出一條即可）。,稀釋涂布平板法,平板劃線法,菌液濃度過高,6、配制培養(yǎng)基時，在各成分都溶化后和分裝前，要進行的是_和滅菌。對培養(yǎng)基進行滅菌的常用方法是_。接種以前進行的一系列操作，目的是在培養(yǎng)皿表面形成_。根據(jù)土壤樣品的稀釋倍數(shù)和接種稀釋液的體積，統(tǒng)計平板上的_就能大致推測出樣品中的活菌數(shù)。,調(diào)節(jié)pH值,高壓蒸汽滅菌,單個菌落,菌落數(shù),7下表為兩種微生物的培養(yǎng)基配方。,B培養(yǎng)基：,A培養(yǎng)基：,（1）如果要進行土壤中分解尿素的細菌的分離，則需要選擇上述哪種培養(yǎng)基？_，該培養(yǎng)基能分離尿素分解菌的原因是： （2）

14、在該培養(yǎng)基中可加入_指示劑，根據(jù)指示劑的顏色可鑒定該種細菌能夠分解尿素。 (3)從功能上來看，上述兩種培養(yǎng)基均屬于_培養(yǎng)基。,A培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中尿素為唯一氮源，只有能分解尿素的微生物才能生長繁殖。,酚紅,選擇,(4)把牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基倒入平板，等培養(yǎng)基冷凝后，應(yīng)將平板_放置，這樣做的目的是可防止_造成污染。 (5)微生物接種的方法很多，平板劃線法操作結(jié)束時，為什么仍需要灼燒接種環(huán)？_。 (6)微生物培養(yǎng)過程中還有什么方法或步驟要防止其他微生物污染？ _、_、_。,倒過來,皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,殺死接種環(huán)上殘留菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者,培養(yǎng)基滅菌,接種環(huán)境滅菌,接種過程無菌操作,8.幽門螺桿菌（Hp）感染是急慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素。在患者體內(nèi)采集樣本并制成菌液后，進行分離培養(yǎng)。實驗基本步驟如下： 請回答： （1）在配制培養(yǎng)基時，要加入尿素和酚紅指示劑，這是因為Hp含有 ，它能以尿素為氮源；若有 Hp，則菌落周圍會出現(xiàn) 色環(huán)帶。 （2）步驟X表示 。在無菌條件下操作時，先將菌液稀釋，然后將菌液 到培養(yǎng)基平面上，菌液稀釋的目的是為了獲得 菌落。通常每種稀釋液需涂布_個平板，取其平均值。若將最后一個試管中的菌液每次吸取0