酚：氯仿：異丙醇抽提核酸的一些問題_0

1、酚：氯仿：異丙醇抽提核酸的一些問題 酚：氯仿：異丙醇抽提核酸的一些問題2014-01-4 23:19 1. 異丙醇和乙醇沉淀質(zhì)粒的區(qū)別： 異丙醇和酒精都是有機溶劑，一般來講，提取質(zhì)粒的時候一開始都要用異丙醇沉淀，因為異丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因為酒精容易揮發(fā)，對下游的實驗影響小。 異丙醇比較疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去鹽，它比異丙醇更親水，所以能去掉一些鹽離子。有時還用70%的乙醇洗樣品也是為了增加鹽的溶解度。 在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用2倍體積乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙

2、醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。 異丙醇沉淀核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在溶液中，從而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。 異丙醇：優(yōu)點為所需容積小且速度快，適用于濃度低，而體積大dna樣品的沉淀。0.541.0倍體積的異丙醇可選擇性沉淀dna和大分子rrna和mrna；但對5srna、trna和多糖產(chǎn)物不產(chǎn)生沉淀，一般不需要在低溫條件下長時間放置。 缺點：易使鹽類（如nacl、蔗糖）與dna共沉淀；在dna沉淀中異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要用70的乙醇漂洗dna沉淀數(shù)次。 乙醇：沉淀dna乙醇是首選的有機溶劑，對鹽類

3、沉淀少，dna沉淀中所含的衡量乙醇易蒸發(fā)去處，不影響以后的實驗。 在適當?shù)柠}濃度下，2倍樣品容積的95乙醇可有效沉淀dna，對于rna則需要將乙醇量增加至2.5倍缺點是總體積較大。需在-20放置很長時間，30分鐘-1小時。同樣需要70%乙醇洗滌。 2. 一般用的是酚：氯仿：異丙醇為25：24：1（v/v），其中酚是強烈的蛋白質(zhì)變性劑，能有效使蛋白質(zhì)變性而除去，氯仿有強烈的脂溶性，去除脂類雜質(zhì)， 3. 本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質(zhì)步驟：質(zhì)粒用等體積的酚 /氯仿/異丙醇抽提一次，重復此步驟，加入兩倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 mol/l 乙酸鈉溶液后混勻，零下2

4、0攝氏度沉淀30 min后12000 r/min離心10 min，沉淀用75%乙醇洗滌一次，12000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀自然干燥后溶于2040微升去離子水中或者0.5 mol/l ph8.0的te中。 4. 酚/氯仿法提取dna的原理 1)酚：使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了dnase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與dna 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。 使用酚的優(yōu)點：1. 有效變性蛋白質(zhì)；2. 抑制了dnase的降解作用。 缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（a）rna。2. 不能

5、完全抑制rnase的活性。 2）氯仿的作用：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的過量酚。（酚易溶于氯仿中） 3）用酚氯仿抽提細胞基因組dna時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？ 異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含dna的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。 4）用乙醇沉淀dna時，為什么加入單價的陽離子？ 用乙醇沉淀dna時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如nacl 或 naac，na+中和dna分子上的負電荷，減少dna分子之間的同性電荷相斥力，而

6、易于聚集沉淀。 5) 酚氯仿法提取dna的一些試劑的作用酚氯仿法提取dna的原理用酚抽提細胞dna時，有什么作用？ 使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了dnase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與dna 聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而dna溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1. 有效變性蛋白質(zhì)；2. 抑制了dnase的降解作用。缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（a）rna。2. 不能完全抑制rnase的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚氯仿抽

7、提細胞基因組dna時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？ 異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含dna的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。 用乙醇沉淀dna時，為什么加入單價的陽離子？ 用乙醇沉淀dna時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如nacl 或 naac，na+中和dna分子上的負電荷，減少dna分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（dnp）可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/l氯化鈉），但在0.14mol/l氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核

8、酸核蛋白（rnp）則在0.14mol/l氯化鈉中溶解度最大，利用這一性質(zhì)可將其分開。 將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（sds）溶液，使dna與蛋白質(zhì)分離開。 加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/l，使dna溶解。 加氯仿-異戊醇去除蛋白質(zhì)，也可重復該步操作得較純dna。 最后用95%乙醇沉淀dna。 l 沉淀：準確量取上清液體積，加2倍體積95冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現(xiàn)，約10-15分鐘，離心8000 r/min離心7分鐘，得白色沉淀； 溶解：將沉淀物用0.1mol/l naoh約10毫升溶解,得dna溶液。 溶液i溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能

9、水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中ph小于8時，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止dna受機械剪切力作用而降解。 edta：（1）螯合mg2、ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對dna的降解作用（dnase作用時需要一定的金屬離子作輔基）; （2）edta的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。 溶液iinaohsds液： naoh：核酸在ph大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當ph12或ph3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液ii中的naoh濃度為0.2mo1l，加抽提液

10、時，該系統(tǒng)的ph就高達12.6，因而促使染色體dna與質(zhì)粒dna的變性。 sds：sds是離子型表面活性劑。 它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。 （2）解聚細胞中的核蛋白。 （3）sds能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為r-o-so3-r-蛋白質(zhì)的復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是sds能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用rnase去除rna時）受到干擾。 溶液iii-3moll naac（ph4.8）溶液： naac的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)ph至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是naac-hac的緩沖

11、液。用ph4.8的naac溶液是為了把ph12.6的抽提液，調(diào)回ph至中性，使變性的質(zhì)粒dna能夠復性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3moll naac有利于變性的大分子染色體dna、rna以及sds-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與sds蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。 為什么用無水乙醇沉淀dna？ 用無水乙醇沉淀dna，這是實驗中最常用的沉淀dna的方法。乙醇的優(yōu)點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對dna很安全，因此是理想的沉淀劑。 dna溶液 是dna以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙

12、醇會奪去dna周圍的水分子，使dna失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與dna相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而dna在溶液中有一定程度的溶解，因而dna損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀dna時可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀dna。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 在用乙醇沉淀dna時，為什么一定要加naac或nacl至最終濃度達0.10.25mol/l？ 在ph為8

13、左右的溶液中，dna分子是帶負電荷的，加一定濃度的naac或nacl，使na+中和dna分子上的負電荷，減少dna分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成dna鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分dna形成dna鈉鹽而聚合，這樣就造成dna沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的dna中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響dna的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用sds與kac來處理？ 加進去的rnase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化dna，又必須去除之，加sds可使它們成為sds-蛋白復合物沉淀，再加kac使這些復合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的sds-蛋白質(zhì)復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除rnase。在溶液中，有人以kac代替naac，也可以收到較好效果。 7為什么在保存或抽提dna過程中，一般采用te緩沖液？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮dna的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pka7.2）和硼酸系統(tǒng)（pka=9.24）等雖然也都符合細胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(ph)，可作dna的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根