淋巴細胞亞群檢測的臨床應(yīng)用（培訓(xùn)調(diào)研）

1、淋巴細胞亞群檢測的臨床應(yīng)用,檢驗科 梁紅萍,2012-5,1,精編課件,主要內(nèi)容,為何要檢測“淋巴細胞亞群”？ 何時檢測？ 如何解讀？ 如何應(yīng)用？（腫瘤、自身免疫、感染、兒科） 案例分析 標(biāo)本要求,2,精編課件,為何要檢測“淋巴細胞亞群”？,3,精編課件,關(guān)鍵詞：免疫（拉丁文，免),免疫基本功能: 識別自己與非己-動態(tài)平衡 免疫系統(tǒng)：由免疫器官、免疫細胞及免疫分子組成，遍布全身、相互制約的 網(wǎng)絡(luò) 免疫相關(guān)疾?。?應(yīng)答過高:變態(tài)反應(yīng)(過敏性疾病,四型) 不平衡: 應(yīng)答不足:感染、腫瘤、放射病、血液病、免疫缺損癥 自身組織應(yīng)答：自身免疫疾?。⊿LE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）,4,精編課件,免疫應(yīng)答類型：二

2、種 1、固有性免疫應(yīng)答：識別多種病原體的共有成分（多糖），非特異性應(yīng)答。 機械性防御機制：皮膚、粘膜（口腔、呼吸道、消化道、泌尿）； 體液免疫機制：補體系統(tǒng)；急性相蛋白（CRP等）；吞噬細胞（單核-巨噬細胞、粒細胞）；NK（腫瘤、病毒感染細胞、異源）；ADCC。感染早期數(shù)分或96h內(nèi)執(zhí)行防衛(wèi)。 2、適應(yīng)性免疫應(yīng)答：識別特異的病原體，特異性應(yīng)答 T及B淋巴細胞，感染后4-5天對識別的病原體進行殺傷清除，發(fā)生在固有性免疫應(yīng)答之后。 B淋巴細胞針對細胞外的細菌病原體，引發(fā)吞噬作用，介導(dǎo)體液免疫 T淋巴細胞抵抗細胞內(nèi)復(fù)制的病原體（病毒、結(jié)核菌），介導(dǎo)細胞免疫,5,精編課件,6,精編課件,何時檢測“淋巴

3、細胞亞群”？,評價免疫功能（血常規(guī)、Ig、補體、淋巴細胞亞群） 術(shù)前； 新生兒篩查（原發(fā)性免疫缺陷?。?； 體檢 診斷免疫相關(guān)疾?。ㄈ鏗IV初篩有反應(yīng)時） 免疫治療療效觀察 出現(xiàn)免疫功能低下癥狀時檢測 1、經(jīng)常感到疲勞； 2、經(jīng)常感冒； 3、傷口容易感染； 4、腸胃功能下降；自身保護能力差； 5、易受到傳染病的侵襲； 6、精神萎靡； 7、易昏睡 8、愛做夢（惡夢） 9、身心憔悴,7,精編課件,Sheep erythrocyte rosetter ( E-rosettes) for T-cells,8,精編課件,Surface immunoglobulin (sIg) for B-cells,9,

4、精編課件,Surface immunoglobulin (sIg) for B-cells,流式細胞儀檢測原理,10,精編課件,11,精編課件,流式細胞術(shù)的特點,流式細胞術(shù)：利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析及分選的技術(shù) 流式細胞術(shù) = 細胞熒光化學(xué)技術(shù)+單克隆抗體技術(shù)+激光技術(shù)+流體力學(xué)+光電測量技術(shù)+計算機技術(shù) 測量速度快：最快可在1秒種內(nèi)檢測上萬個細胞 可進行多參數(shù)測量：可以對同一個細胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量 具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義：提供細胞群體的均值和分布情況 高分辨率(CV2%)、高靈敏度(熒光檢測靈敏度100MESF，前向角散射光檢測靈敏

5、度(0.20.5um) 既是細胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)，分選純度可達99%以上,12,精編課件,流式細胞術(shù)的應(yīng)用使得過去應(yīng)用E-玫瑰花結(jié)試驗或EAC-花環(huán)試驗檢測T或B淋巴細胞成為歷史 應(yīng)用抗CD（cluster of differentiation,CD)單抗將免疫細胞區(qū)分得更細、更科學(xué)、更能描述免疫細胞的機能狀態(tài) 由于流式細胞儀將靜態(tài)的、顯微鏡下肉眼觀察改為動態(tài)的、計算機信號處理，因此，在流式細胞儀上T細胞亞群統(tǒng)計方式已從傳統(tǒng)的熒光顯微鏡下計數(shù)200個細胞成為幾秒鐘內(nèi)計數(shù)上萬個，因此，結(jié)果更真實、更具有統(tǒng)計意義。,13,精編課件,淋巴細胞亞群流式術(shù)的基本內(nèi)容,熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體

6、與淋巴細胞表面的抗原結(jié)合，結(jié)合多色熒光分析，即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開來，進而得到各亞群的相對比例。 淋巴細胞為CD45陽性，顆粒度較低的一群細胞 淋巴細胞主要分為T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）和 NK細胞（CD16+56+） T淋巴細胞又分為 T helper/T inducer（CD3+CD4+）， (ThCD29+ /Ti CD45RA+) 、 T suppressor/ T cytotoxic（CD3+CD8+） (TsCD28-/Tc CD28+),14,精編課件,15,精編課件,如何解讀“淋巴細胞亞群”報告,16,精編課件,解讀原則：,1、綜合判斷， C

7、D4+%、CD8+%、CD4+/CD8+：初步評估機體免疫狀態(tài)，快速便利 2、結(jié)合血常規(guī)結(jié)果，同時關(guān)注百分比和絕對數(shù) 3、當(dāng)CD4+/CD8+比例倒置時，一定要確認是CD4+細胞絕對數(shù)降低，還是CD8+細胞絕對數(shù)增加所致，兩種情況的臨床意義不同 4、（CD3+%）+（CD19+%）+（CD16/56+%）=100%5%，如相差過于懸殊，臨床具有一定提示意義。研究表明感染和血液腫瘤最易出現(xiàn)等式嚴重偏離,17,精編課件,5、NK細胞： 天然免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分，約占外周血單核細胞的15-30%，可通過非MHC性限制性途徑識別并在多數(shù)情況下殺傷被病毒感染細胞。 HIV感染時，與CD4+T細胞計

8、數(shù)相關(guān) NK細胞的抗腫瘤免疫比T細胞的抗腫瘤免疫更重要 不明原因流產(chǎn)患者：NK細胞數(shù)量與早孕組相比明顯減少 6、避免將細胞表面標(biāo)志和功能間的聯(lián)系絕對化，原因： 6.1 CD4+T細胞又分為Th1和Th2,Th1主要介導(dǎo)細胞免疫和炎癥反應(yīng)，涉及抗病毒、抗胞內(nèi)寄生菌和移植物排斥；Th2主要參于B細胞增殖、抗體產(chǎn)生和超敏反應(yīng)性疾病。同時兩者互為抑制，它們在免疫調(diào)節(jié)中互相拮抗，起著十分微妙的作用 6.2己有研究表明確實存在CD4+殺傷T細胞，因而不能說CD4+T細胞一定發(fā)揮上調(diào)作用,解讀原則：,18,精編課件,7、 隨著現(xiàn)代免疫學(xué)的發(fā)展，對T細胞表面標(biāo)志及其生物學(xué)作用的分子機制有了更深入的認識。鑒于T

9、細胞功能亞群的傳統(tǒng)分類已不能反映真實情況，有必要淡化所謂輔助性T細胞/抑制性T細胞等的概念。 實際上，無論是CD4+T細胞或CD8+T細胞，均包括可發(fā)揮正、負調(diào)節(jié)（即輔助或抑制）作用的功能亞群。 8、與時俱進,解讀原則：,19,精編課件,臨 床 應(yīng) 用,20,精編課件,原發(fā)性免疫缺陷病：患者血液淋巴細胞免疫表型可出現(xiàn)多種異常。如嚴重聯(lián)合免疫缺陷?。⊿CID）時，T淋巴細胞缺乏；X連鎖無丙種球蛋白血癥，B淋巴細胞數(shù)量缺乏或減少。 HIV感染和AIDS：CD4+T淋巴細胞是HIV感染的主要細胞。 CD4+T淋巴細胞計數(shù)用于評價HIV感染后免疫系統(tǒng)受損的程度。 CD4+T細胞：下降 CD8+T細胞：

10、HIV感染早期增高，發(fā)展為AIDS時下降 NK細胞：降低，特別是疾病晚期,免疫缺陷病,21,精編課件,淋巴細胞數(shù)量減低，部分患者表現(xiàn)出與AIDS和部分晚期腫瘤患者相似的免疫功能狀態(tài)。 研究發(fā)現(xiàn)： SARS患者淋巴細胞及其各亞群均受到破壞，以T細胞受損為主，而且CD4細胞比CD8細胞受損更為嚴重。 治療后病情好轉(zhuǎn)或治愈后，T淋巴細胞數(shù)量可逐漸恢復(fù)正常。,SARS,22,精編課件,活動期SLE患者外周血CD16CD56細胞百分率明顯降低 SLE、強直性脊柱炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD4細胞百分率顯著降低，CD8+細胞百分率顯著升高，CD4/CD8比值降低或倒置。治療后患者CD4細胞明顯增加，C

11、D8+細胞顯著降低，CD4/CD8+比值顯著升高。 SLE患者活動期和非活動期的淋巴細胞亞群結(jié)果有顯著差異 強直性脊柱炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者活動期和非活動期的淋巴細胞亞群結(jié)果無顯著差異,自身免疫疾病,23,精編課件,干細胞移植后免疫系統(tǒng)將重建，但是極為緩慢。 NK細胞首先開始升高，隨后T、B淋巴細胞開始恢復(fù)。 CD4+比CD8+重建更晚。 倒置CD4+/CD8+兩年才能逆轉(zhuǎn)。,造血干細胞移植后重建,24,精編課件,排斥反應(yīng)和免疫抑制劑治療監(jiān)測。 CD4/CD8低于0.2,則停止使用免疫抑制劑； 若CD4/CD8過高，則提示容易發(fā)生排斥反應(yīng),器官移植后免疫監(jiān)測,25,精編課件,惡性腫瘤治療前CD

12、3+細胞數(shù)量、CD4+/CD8+細胞比值降低，化療或放療有效時則可逐漸恢復(fù)或達到正常水平。 癌轉(zhuǎn)移時，CD3、CD4明顯減少，CD8明顯增多，CD4/CD8明顯減少 腫瘤終末期CD4/CD8比值，可預(yù)測患者存活期,實體腫瘤療效觀察,26,精編課件,病毒性感染的重要標(biāo)志,1、艾滋?。好庖吖δ芷毡榈拖率前滩』颊咦蠲黠@的特征。CD4+細胞顯著低于正常對照組，而CD8+細胞正常，CD4+/CD8+比值下降。 2、慢性乙肝患者：CD3、CD4、CD8均下降，CD4/CD8正常，表明患者T細胞輔助性、殺傷性功能下降，引起病毒清除困難，導(dǎo)致慢性遷延性肝損傷； 3、慢活肝、肝硬化患者：CD3、CD4下降，C

13、D8增高，CD4/CD8下降，患者免疫自穩(wěn)功能下降，從而引起自身免疫損傷，肝細胞持續(xù)性、大量損傷； 4、傳染性單核細胞增多癥、巨細胞病毒感染、流行性出血熱、麻疹急性期、水痘、猩紅熱和一些上呼吸道感染患者均可表現(xiàn)CD4下降、CD8升高能及CD4/CD8比值下降。,27,精編課件,牛皮癬,牛皮癬患者血液中T淋巴細胞各亞群的數(shù)量常無明顯的差別 但患者皮膚病變的部位浸潤淋巴細胞卻以輔助/誘導(dǎo)性T細胞（TH）占優(yōu)勢,28,精編課件,案 例 分 析,29,精編課件,1、邢某，男，左上肺癌 2010年1月15日入院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 51% 20% 26% 12% 21% 2010年3

14、月22日出院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 55% 27% 24% 11% 18%,30,精編課件,1、邢某，男，左上肺癌 2010年1月15日入院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 51% 20% 26% 12% 21% 2010年3月22日出院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 55% 27% 24% 11% 18%,31,精編課件,2、曹某，男，胃癌 2010年3月24日入院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 43% 30% 15% 4% 29% 2010年4月23日治療后檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 53% 35% 21% 4% 31%,32,精

15、編課件,3、唐某，男，慢淋 2010年8月25日入院檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 17% 6% 9% 79% 4% 2010年9月21日治療后檢測： CD3 CD4 CD8 B NK 53% 17% 34% 36% 9% 2010年10月25日治療后監(jiān)測： CD3 CD4 CD8 B NK 80% 14% 60% 13% 10%,33,精編課件,淋巴細胞亞群的新指標(biāo),34,精編課件,需要進一步細分的淋巴細胞亞群,T helper/T inducer（CD3+CD4+）， (ThCD29+ /Ti CD45RA+) T suppressor/ T cytotoxic（CD3+CD8+

16、） (TsCD28-/Tc CD28+),35,精編課件,根據(jù)T淋巴細胞分泌細胞因子的不同還可將CD4+、CD8+分為：,CD4+：Th1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL+ Th0:CD4+IFNr+IL+ CD8+：Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD4+IFNr+IL4+,36,精編課件,調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T,Treg):淋巴細胞亞群中的新成員。,是一群具有負調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)的淋巴細胞。 通常起著維持自身耐受和避免免疫反應(yīng)過渡損傷機體的重要作用 也參與腫瘤細胞逃避機體免疫監(jiān)視和慢性感染。 誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞： 1、TR1細胞：以分泌IL

17、-10為特征，負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 2、TH3細胞：最早在口腔耐受性動物模型中發(fā)現(xiàn)，以分泌轉(zhuǎn)化生長因子beta（TGF-beta）作為其功能性細胞激素。研究顯示可能與口腔耐受性、黏膜免疫機制有關(guān)。 CD特征：CD4+ CD25+ Foxp3+ 臨床應(yīng)用： 1、診斷：腫瘤患者增高，類似NK（5-10%） 2、療效觀察：化療前9%，化療后3%，時效性強，是腫瘤科醫(yī)生重點關(guān)注指標(biāo) 3、口腔耐受性、黏膜免疫機制有關(guān),37,精編課件,Naive/Memory T 細胞亞群:淋巴細胞亞群中的新成員。,Memory T細胞：記憶T細胞，CD45RO+ T細胞分裂和分化后，會分別形成記憶T細胞和效應(yīng)T細胞，而記憶T細胞則會在下一次抗原入侵時再次將記憶中的殺毒方法再次調(diào)動出來，再次殺滅抗原。 記憶T細胞活著，病毒也就活著；記憶T細胞死亡，病毒也就死亡；病毒增殖也完全依賴于記憶T細胞的分裂。因此，摧毀記憶T細胞，也就可以摧毀“躲藏”起來的艾滋病病毒。 腫瘤特異性記憶T細胞 Nave T細胞： 純真/幼稚T細