MALDI-TOF-MS病原體鑒定質(zhì)量保證專(zhuān)家共識(shí)

1、MALDI TOF MS病原體鑒定質(zhì)量保證專(zhuān)家共識(shí)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI - TOF MSM乍為一種新興的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，由于其具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、 自動(dòng)化及高通量等檢測(cè)特點(diǎn)，已成為一項(xiàng)革命性病原體快速鑒定技術(shù)被用 于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，并將逐步取代常規(guī)病原體生化鑒定方法。任何新興 技術(shù)應(yīng)用于臨床都需要建立規(guī)范的質(zhì)量保證體系，以確保檢測(cè)質(zhì)量。本專(zhuān) 家共識(shí)將對(duì)開(kāi)展 MALDI- TOF MS用于病原體鑒定的設(shè)施與安全要求

2、、人員 培訓(xùn)與能力評(píng)估、MALDI- TOFMSW原體鑒定過(guò)程的質(zhì)量控制、檢驗(yàn)程序性 能驗(yàn)證等進(jìn)行建議。設(shè)施與安全要求1 .風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：擬開(kāi)展 MALDI- TOF MS病原體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室需在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估基礎(chǔ)上建立 有效的安全防護(hù)策略，包括設(shè)備的使用、化學(xué)試劑的安全使用和處理丟棄、 感染性病原體和被污染材料的處置等。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估包含確定工作流程和鑒定 步驟中可能發(fā)生的化學(xué)和生物危害，以及降低風(fēng)險(xiǎn)的方法。2 .安全防護(hù)：任何操作臨床病原體樣本或病原體的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)至少需要在二級(jí)生物安 全實(shí)驗(yàn)室（BSL 2）中進(jìn)行。MALDI- TOFMS®安置在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)， 同時(shí)使用 MALDI- TOF

3、 MS檢測(cè)臨床病原體樣本時(shí)除了需考慮生物危害的風(fēng) 險(xiǎn)外還要注意化學(xué)試劑的潛在風(fēng)險(xiǎn)。人員培訓(xùn)與能力評(píng)估各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備 MALDI- TOF MS檢測(cè)過(guò)程中涉及的所有操作人員的初 次培訓(xùn)和定期能力評(píng)估的程序文件，對(duì)涉及的所有操作人員應(yīng)進(jìn)行初次和定期（至少6個(gè)月一次）的培訓(xùn)以及能力評(píng)估，培訓(xùn)考核需遵循制造商的使 用手冊(cè)或?qū)嶒?yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，培訓(xùn)的內(nèi)容包括原理方法、信息技術(shù)、 儀器維護(hù)、結(jié)果報(bào)告與解釋等方面。止匕外，還應(yīng)采用一組形態(tài)和生化特征 典型的菌株對(duì)培訓(xùn)者進(jìn)行人員比對(duì)和/或考核，以確保所有操作者鑒定結(jié)果的一致性。通過(guò)培訓(xùn)，要求每位操作人員對(duì)每種病原體的鑒定結(jié)果必須達(dá) 到本實(shí)驗(yàn)室設(shè)定的每種病原體

4、的最小結(jié)果閾值。保存所有培訓(xùn)、考核和能 力評(píng)估記錄。建議1對(duì)于臨床常見(jiàn)細(xì)菌（非高致病），操作人員的個(gè)人防護(hù)應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)防要求，其病原體分離培養(yǎng)、蛋白提取及靶板點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)在生物安全柜內(nèi) 進(jìn)行，點(diǎn)樣后的靶板轉(zhuǎn)移至 MALDI TOFMS分析過(guò)程中也需注意生物安全 防護(hù)；對(duì)潛在的含生物危害二類(lèi)及以上的高致病病原體如布魯菌、炭疽桿 菌、鼠疫耶爾森菌等的臨床樣本，實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)請(qǐng)示醫(yī)院感染管理部門(mén)并 盡量避免培養(yǎng)檢測(cè)，必要情況下需要在生物安全柜內(nèi)采用經(jīng)滅活程序滅活 后再進(jìn)行質(zhì)譜分析。建議2前期的樣本處理過(guò)程中將會(huì)使用一些有機(jī)溶劑如乙醇、甲酸、 乙月青、三氟乙酸和基質(zhì)液等，這些溶劑具有腐蝕性或可燃性，可引起人

5、體 皮膚黏膜腐蝕、呼吸及循環(huán)系統(tǒng)功能紊亂、多臟器損傷，因此在實(shí)驗(yàn)的過(guò) 程中使用此類(lèi)有機(jī)溶劑試劑時(shí)建議有一個(gè)良好的通風(fēng)環(huán)境，同時(shí)需加強(qiáng)操 作人員的呼吸道、皮膚黏膜尤其是眼面部的個(gè)人防護(hù)。MALDI- TOF MS病原體鑒定過(guò)程的質(zhì)量保證質(zhì)量保證可確保 MALDI- TOF MS病原體鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和及時(shí)性, 其內(nèi)容涵蓋分析前、分析中和分析后。（一）分析前1 .菌株準(zhǔn)備：所有菌株均采用新鮮培養(yǎng) （1648 h）的單個(gè)菌落，推薦細(xì)菌采用血瓊 脂平板培養(yǎng)，真菌采用沙保羅平板培養(yǎng)，凍存菌株傳代兩次后使用。2 .靶板點(diǎn)樣:先將質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)在靶板相應(yīng)孔位，再點(diǎn)待測(cè)菌落。點(diǎn)樣時(shí) 應(yīng)注意菌量適當(dāng)、厚

6、度均勻，不可帶有瓊脂成分。3 .加基質(zhì)液：點(diǎn)樣后加入基質(zhì)液，應(yīng)自然涼干。4 .特殊病原體：如分枝桿菌、絲狀真菌和諾卡菌等需要通過(guò)蛋白提取法進(jìn)行提取前處 理，包括使用甲酸、乙月青、破壁硅珠管等試劑耗材。詳細(xì)處理過(guò)程建議參 考制造商提供的 SOP1行操作。5 .樣本準(zhǔn)備注意事項(xiàng)：（1）靶板點(diǎn)樣加入基質(zhì)液后，需完全干燥形成結(jié)晶方可進(jìn)行檢測(cè)。（2）靶板準(zhǔn)備完成后，如為細(xì)菌或酵母菌，需在 48 h內(nèi)完成檢測(cè)；如為分枝桿 菌，需在4 h內(nèi)完成檢測(cè)；如曲霉菌等絲狀真菌，需立刻完成檢測(cè)。（二）分析中一般情況下，MALDI TOF MS檢測(cè)可以得到以下幾種鑒定結(jié)果：（1）高置信的鑒定結(jié)果；（2）多個(gè)鑒定結(jié)果，且

7、每個(gè)結(jié)果的置信度相似；（3）無(wú)鑒定結(jié)果。1 .結(jié)果判斷：當(dāng)MALDI- TOF MS提供了高置信的結(jié)果時(shí)，無(wú)需對(duì)圖譜進(jìn)行檢查和復(fù) 核；而當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)鑒定結(jié)果或無(wú)鑒定時(shí)，可能出現(xiàn)以下問(wèn)題：（1）低質(zhì)量的圖譜導(dǎo)致無(wú)鑒定結(jié)果：需檢查菌株和試劑耗材的質(zhì)量、儀器性能狀態(tài)以及 具體操作環(huán)節(jié)；（2）圖譜質(zhì)量較好而不符合預(yù)期的鑒定、多個(gè)鑒定結(jié)果或者 無(wú)鑒定結(jié)果：應(yīng)檢查樣本是否分純、是否污染或數(shù)據(jù)庫(kù)不包含待檢菌種。2 .結(jié)果閾值：目前MALDI-TOF MS的結(jié)果閾值通常分為兩種：一種以置信度為閾值， 置信度90%勺單一結(jié)果為優(yōu)質(zhì)鑒定結(jié)果，60%- 90%&具有多個(gè)鑒定結(jié)果為低分辨結(jié)果（需要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分

8、類(lèi) ），60%為不能鑒定；另一種則以分值為閾值，質(zhì)譜評(píng)分2分（9.5分）的結(jié)果可以鑒定到種，1.7至2.0分（9.0 9.5分）之間可以鑒定到屬（需要補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分類(lèi) ），1.7分（9.0分）為不 能鑒定或可能鑒定到屬。（三）分析后1 .結(jié)果復(fù)核：鑒定結(jié)果的復(fù)核是分析后質(zhì)量管理的重要組成部分，是保證檢驗(yàn)結(jié)果 準(zhǔn)確的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。MALDI TOFMS定結(jié)果為以下病原體時(shí)，需通過(guò)相應(yīng)的補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步鑒別。2 .儀器維護(hù)及保養(yǎng)：按照制造商要求定期進(jìn)行維護(hù)及保養(yǎng)。3 .化學(xué)試劑：必須使用儀器制造商要求純度的化學(xué)試劑。質(zhì)量控制4 一）室內(nèi)質(zhì)控建議3需血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)的病原體：大腸埃希菌（疑似志賀菌屬

9、和大腸埃 希菌0157）、沙門(mén)菌屬等；需要其他確認(rèn)試驗(yàn)進(jìn)行鑒定的病原體： 煙曲霉復(fù)合群、 黃曲霉復(fù)合群、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌群等；需要測(cè)序鑒定或報(bào)告到群：蠟樣 芽抱桿菌復(fù)合群、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群、鼻疽伯克霍爾德菌和類(lèi)鼻疽伯克霍 爾德菌、無(wú)色桿菌屬、弗勞地檸檬酸桿菌復(fù)合群和陰溝腸桿菌復(fù)合群等?？祢?yàn)室需按照 MALDI- TOF MS制造商的推薦及相關(guān)管理指南制定質(zhì)控 程序。按照制造商要求評(píng)估質(zhì)量分析器、相關(guān)系統(tǒng)（軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)）、化學(xué)試劑、靶板和用戶(hù)的操作 （靶板點(diǎn)樣、有條件時(shí)萃取 ）。1 .質(zhì)控菌株：質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照菌株種類(lèi)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室擬開(kāi)展的鑒定病原體范圍進(jìn)行選 擇，質(zhì)控菌株可采用制造商建議

10、的標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)實(shí)驗(yàn)室測(cè)序等方法確認(rèn)的臨床菌株。所有質(zhì)控陽(yáng)性對(duì)照菌株進(jìn)行質(zhì)控操作時(shí)需采用新鮮培養(yǎng)（1648h）的單個(gè)菌落，推薦細(xì)菌采用血瓊脂平板培養(yǎng)，真菌采用沙保羅平板培養(yǎng)， 凍存菌株傳代兩次后使用。2 .質(zhì)控操作及頻率：按照制造商的 SOP文件要求，在靶板清洗、基質(zhì)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配 制后需每次進(jìn)行陰性及陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)量控制，每次病原體鑒定時(shí)亦應(yīng)如此。3 .儀器校準(zhǔn)：檢測(cè)前儀器需進(jìn)行自身校準(zhǔn)，校準(zhǔn)通過(guò)后方可進(jìn)行后續(xù)鑒定。4 .陽(yáng)性對(duì)照：使用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 （ATCC8739）鑒定分值必須達(dá)到制造商要求； 如使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)試品，在分子量大于12 000以上的區(qū)域必須出現(xiàn)校準(zhǔn)峰，應(yīng)明確檢測(cè)到 m

11、/z 13 683和16 952兩個(gè)峰，確保高分子量端的準(zhǔn)確性。5 .陰性對(duì)照：檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為"No peak found" 或者”無(wú)鑒定結(jié)果"。陰性對(duì)照需使用空 白試劑，用于排除可能由試劑污染或重復(fù)性靶板（陰性對(duì)照應(yīng)為任意孔位 ）清洗不當(dāng)造成的假陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)質(zhì)控結(jié)果失控或校準(zhǔn)未通過(guò)時(shí)，應(yīng)從各環(huán)節(jié)分析原因并予以糾正。常見(jiàn)原因包括：質(zhì)控菌株 /蛋白標(biāo)準(zhǔn)品污染、使用錯(cuò)誤的質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、使用錯(cuò)誤的試劑、操作人員的操作失誤等。記錄分析失控原因并歸 檔。如果未發(fā)現(xiàn)上述明顯的原因可重復(fù)測(cè)定質(zhì)控菌株/蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果在控，可直接進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)；若不能糾正，應(yīng)聯(lián)系制造商采取相

12、應(yīng)的措施。（二）室問(wèn)質(zhì)評(píng)建議4其他質(zhì)控菌株（標(biāo)準(zhǔn)菌株或經(jīng)驗(yàn)證的臨床菌株 ），包括革蘭陰性 桿菌（建議采用產(chǎn)氣腸桿菌）、革蘭陽(yáng)性球菌（建議采用糞腸球菌）和念珠菌 （建議采用光滑念珠菌）。室間質(zhì)評(píng)：全程參加由組織方提供的室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃。當(dāng)出現(xiàn)室間質(zhì)評(píng) 不符時(shí)，及時(shí)找到失控原因并糾正。保存每次室間質(zhì)評(píng)信息，包括結(jié)果反 饋、糾正措施等。無(wú)第三方組織的室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期自行組 織與其他實(shí)驗(yàn)室同類(lèi)檢測(cè)方法的室間比對(duì)。檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證MALDI TOF MS性能驗(yàn)證包括準(zhǔn)確度和精密度。通過(guò)MALDITOFMS和現(xiàn)用方法或參考方法 （如測(cè)序方法）獲得的病原體鑒定結(jié)果進(jìn)行比較以實(shí)現(xiàn) 準(zhǔn)確度驗(yàn)證。準(zhǔn)確度驗(yàn)

13、證盡可能包括臨床菌株而不限于是質(zhì)控菌株或標(biāo)準(zhǔn) 菌株。精密度驗(yàn)證應(yīng)包括所有主要可能存在的變量，如不同的培養(yǎng)基、培 養(yǎng)條件和提取技術(shù)，通常用標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)控菌株進(jìn)行精密度驗(yàn)證，應(yīng)評(píng)估 批內(nèi)、批問(wèn)，操作者之間以及連續(xù)幾天的重復(fù)性或再現(xiàn)性。在適用的情況 下，還應(yīng)評(píng)估病原體 MALDI- TOF MS與LIS或其他儀器系統(tǒng)之間接口的正 常運(yùn)行。（一）適用范圍1 .實(shí)驗(yàn)室引入 SFDA批準(zhǔn)的MALDI- TOF MS檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，使用前應(yīng)進(jìn) 行全面驗(yàn)證。2 .實(shí)驗(yàn)室使用 MALDI-TOF MS時(shí)，若對(duì)病原體種類(lèi)、試劑、數(shù)據(jù)庫(kù)、 分析軟件和硬件等進(jìn)行更換或升級(jí)以及擴(kuò)大檢測(cè)范圍（即在原有檢測(cè)病原譜基礎(chǔ)上增加新的

14、病原體 ）后，應(yīng)進(jìn)行部分驗(yàn)證。建議5性能驗(yàn)證符合要求后投入臨床常規(guī)使用，在設(shè)備狀態(tài)、環(huán)境、檢測(cè) 方法、人員等維持穩(wěn)定的情況下，可采用文件和數(shù)據(jù)審核等定期評(píng)審分析系統(tǒng)狀 態(tài)，無(wú)需每年實(shí)施性能驗(yàn)證。（二）驗(yàn)證方案MALDI- TOFMS驗(yàn)證所用菌株按優(yōu)先順序依次選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株、質(zhì)控菌株 或經(jīng)參考方法確認(rèn)的臨床菌株，選擇的菌種應(yīng)盡量覆蓋MALDI- TOF MS制造商公布的可鑒定菌譜，包括革蘭陽(yáng)性及陰性球菌、革蘭陽(yáng)性及陰性桿菌、厭氧菌、酵母菌、苛養(yǎng)菌、分枝桿菌等，同時(shí)還應(yīng)覆蓋驗(yàn)證本地區(qū)、本實(shí)驗(yàn)室以往檢出的特殊病原體種類(lèi)1 .全面驗(yàn)證: 準(zhǔn)確度：常見(jiàn)病原體如革蘭陽(yáng)性及陰性球菌、革蘭陽(yáng)性及陰性桿菌、酵母菌

15、每種類(lèi)別至少驗(yàn)證 30株，厭氧菌、苛養(yǎng)菌、分枝桿菌（如開(kāi)展）、絲狀真菌（如開(kāi)展）每種至少10株，并覆蓋本地區(qū)、本實(shí)驗(yàn)室檢出的重要病原 體。比較MALDI TOF MS鑒定結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)用方法或參考方法（如測(cè)序方法）之間的符合率。精密度：選擇 10株代表性菌株，每天重復(fù)檢測(cè)3次，連續(xù)3 d。2 .部分驗(yàn)證:見(jiàn)表1。適用范圍舉例推薦方案擴(kuò)大病原譜補(bǔ)充某一種病原體準(zhǔn)確度：選¥ 10株以上該 種類(lèi)病原體，與現(xiàn)用方法或參 考方法（如測(cè)序方法）比較精密 度：1日內(nèi)重復(fù)檢測(cè)質(zhì)控菌株3 次試劑種類(lèi)改變商品化試劑改為自配試劑設(shè)備重大修理更換離子檢測(cè)器或激光源按照上述方案進(jìn)行檢測(cè)性能和LIS數(shù)據(jù)傳輸驗(yàn)證表1常見(jiàn)情況下驗(yàn)證方案（三）可接受標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照制造商使用說(shuō)明的要求進(jìn)行結(jié)果判讀（參考環(huán)節(jié)控制中的結(jié)果閾值）。1 .準(zhǔn)確度要求:驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)/質(zhì)控菌株符合率應(yīng)為 100%臨床菌株的符合率應(yīng)在90%乂上。2 .精密度要求：菌株鑒定結(jié)果符合率應(yīng)為 100%若未能滿(mǎn)足上述驗(yàn)證要求，則MALDITOF MS不能通過(guò)驗(yàn)證。制造商和/或使用者須采取相應(yīng)措施，修正后的檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)再次進(jìn)行驗(yàn)證。以上專(zhuān)家共識(shí)內(nèi)容僅限于MALDI- TOF MS用于臨床病原體鑒定的質(zhì)量保證要求，MALDI- TOFMS乍為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支柱技術(shù)，在醫(yī)學(xué)及生命 科學(xué)領(lǐng)域有更多的應(yīng)用前景和價(jià)值，其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用的質(zhì)量保證