甜菜M14品系研究進(jìn)展

1、kyoioripopk 15% 一下26號(hào)晚上交稿第1章前言甜菜M14品系研究進(jìn)展國(guó)內(nèi)著名教授郭德棟1-3采用培植甜菜(Beta vulgaris L.)作為母本、禾U用野 生型白花甜菜(B. corolliflora Zoss.)作為父本完成甜菜種間的雜交繁殖，從而收 獲了具有白花甜菜的第九號(hào)染色體中攜帶的M14基因(VV+C9,2n=18+1) 4。通過(guò)后期的深入研究，表明甜菜M14體系具備很多優(yōu)良種植性能，例如抗高溫、耐 低溫、耐倒伏等等，初步猜測(cè)可能是因?yàn)榘谆ㄌ鸩说牡诰盘?hào)染色體的加入，令 甜菜M14體系具有了野生型甜菜的多種優(yōu)良種植性能，所以甜菜 M14體系是研 究與選用甜菜優(yōu)質(zhì)種植基

2、因的最好品種。本課題組在開(kāi)始時(shí)期，針對(duì)基因組序列、DNA轉(zhuǎn)錄能力包括蛋白質(zhì)表達(dá)性在 鹽脅迫條件下甜菜M14體系展開(kāi)了廣泛的研究，篩選出了與鹽脅迫相關(guān)的差異表 達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，主要研究的基因有：半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因(BvM14-Cystatin) 6、咖啡酰輔酶 A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(BvM14-CCoAOMT)、乙二醛酶I基因 (BvM14-glyoxalaseI ) 7、S-腺甘甲硫氨酸翻譯生成酶基因(BvM14-SAMS2)等。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因均對(duì)甜菜M14品系在高鹽、干旱以及氧化脅迫起到重要作用。 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段，采用抑制雜交方法，采用沒(méi)有經(jīng)過(guò)鹽脅迫處理的對(duì)照實(shí)驗(yàn)組甜 菜M14體系

3、彳乍為Driver,經(jīng)過(guò)500mM NaCl處理作用的甜菜 M14體系作為Tester, 成立了鹽脅迫作用下甜菜 M14體系減弱cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)。充分利用生物學(xué)進(jìn)行研 究分析，挑選出完成鹽脅迫作用的 EST基因片段；以第21號(hào)EST為研究基礎(chǔ)通 過(guò)RACE技術(shù)獲得了 S-腺甘甲硫氨酸脫竣酶(S-adenosylmethionine decarboxylase SAMDC)基因的cDNA全長(zhǎng)9。本實(shí)驗(yàn)是在得到BvM14-SAMDC基因全長(zhǎng)后，對(duì) 甜菜M14品系中BvM14-SAMDC基因耐鹽性功能分析的進(jìn)一步研究，為揭示甜菜 M14品系耐鹽的機(jī)制提供了重要依據(jù)。黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文S-腺昔甲硫

4、氨酸脫竣酶基因的研究進(jìn)展S-腺甘甲硫氨酸脫竣酶基因序列特點(diǎn)S-腺甘甲硫氨酸脫竣酶是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的脫竣酶家族，在原核生物和真核生物中得到的SAMDC基因序列幾乎沒(méi)有相似性，但是該酶在植物中有較高的相 似性10,其本身并沒(méi)有很強(qiáng)的酶活性，在催化作用之后產(chǎn)生共價(jià)雙鏈型的丙酮酰， 用作為酶催化輔基11。Toms教授等人12驗(yàn)證了 SAMDC在微生物中的進(jìn)化作用， 探究表明每類SAMDC具備的生理性能都需要依靠丙酮酰酶，采用共價(jià)雙鏈構(gòu)造 的丙酮酸作為酶催化的基團(tuán)，并沒(méi)有采用氨基酸脫水反應(yīng)里通用的磷酸叱哆醛基 團(tuán)。和其他多種生物相比，植物里的SAMDC遺傳序列具備很多顯著的特點(diǎn)。 在植 物里，SAM

5、DC遺傳序列基本都是開(kāi)放型閱讀框(main-ORF),其中并沒(méi)有內(nèi)含子， 但是在5非編碼區(qū)前端的導(dǎo)序列里具有相應(yīng)的內(nèi)含子。前半部分5端攜帶有開(kāi)放型閱讀框(micro-uORFs),具有三四個(gè)密碼子；下半部分 3端攜帶有微型uORFs (small-ORFs)具有五十多個(gè)密碼子。Schr?der 13教授等人發(fā)表的關(guān)于植物里SAMDC 5端遺傳序列具有傳統(tǒng)意義上的小型、微型閱讀框，攜帶大約五十個(gè)氨基 酸。5前導(dǎo)序列在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，頻繁使用 SAMDC基因序列，但是在哺乳動(dòng)物 里，SAMDC的uORFs對(duì)基因的復(fù)制具有抑制效果。S-腺甘甲硫氨酸脫竣酶的生理功能S-腺甘甲硫氨酸(S-adenosy

6、lmethionine, SAM)處在多胺以及乙烯的生產(chǎn)交 點(diǎn)上1415,同時(shí)，它也是谷胱甘肽生物合成的前體160下圖1-1為一類多胺代謝 反應(yīng)，紅框中就是SAMDC ,我們可以看到生成多胺的第一步就是 SAMDC的脫竣 作用，合成dcSAM之后，剩余的氨內(nèi)基和 Put在亞精胺作用下，反應(yīng)生成酶 (Spermidine synthase SPDS),進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為Spd,并且在精胺生成酶(Spermine synthase SPMS)的催化下反應(yīng)產(chǎn)生Spm。所以，SAMDC是多胺反應(yīng)途徑里的十 分關(guān)鍵的催化酶，而SPDS與SPMS是也是后續(xù)多胺生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。SAMDC是一種高度調(diào)節(jié)酶類

7、,它的調(diào)節(jié)可以通過(guò)基因表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后由多胺水平實(shí)現(xiàn)，無(wú)論是改變SAMDC基因表達(dá)量還是改變SAMDC酶第1章前言活，都會(huì)使植物在生長(zhǎng)過(guò)程中組織或細(xì)胞內(nèi)多胺濃度相比上漲幾倍170Heljasvaar18等人研究過(guò)轉(zhuǎn)SAMDC基因老鼠，研究了老鼠體內(nèi)多胺合成酶超表達(dá) 以及它的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果檢測(cè)到在肝臟和大腦中，SAMDC酶活性上漲2-4倍；與SAMDC催化酶活性實(shí)時(shí)改變酶還有 ODC催化酶，然而Spm與Spd的質(zhì)量并沒(méi)有 產(chǎn)生顯著改變。Alcazar等人研究過(guò)轉(zhuǎn)人類SAMDC基因的煙草，發(fā)現(xiàn)腐胺水平有 所下降，但是Spm和Spd水平上漲2-3倍。Alcazar教授等人還在鹽脅迫作用

8、下的 水稻里復(fù)制出了 SAMDC遺傳基因，表明鹽脅迫作用這類遺傳基因進(jìn)行表達(dá)翻譯， 論證出Put針對(duì)Spd與Spm的變化有助于提高水稻的抗鹽性19。SAMDC可以說(shuō) 是多胺生成代謝作用力最為關(guān)鍵的催化酶之一，所以本試驗(yàn)對(duì)探索植物的抗鹽機(jī) 制具有非常重要的意義。多胺的作用多胺具備很強(qiáng)的陽(yáng)離子效果，因此，它可以和很多帶有負(fù)電荷的大分子相互 結(jié)合在一起，例如DNA、油脂、維生素包括多種磷脂等，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜性能具有 良好的作用效果。多胺也可以和離子發(fā)生反應(yīng)，從而生成離子作用的阻滯劑。多 胺可以采用影響離子蛋白的活性或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來(lái)控制離子通道，進(jìn)而保證K+/Na+在植物細(xì)胞內(nèi)保持平衡狀態(tài)。提高其耐鹽性有

9、文獻(xiàn)曾報(bào)道，多胺被稱為“保護(hù)膜”。 亞精胺的升高使（Spd+Spm） /Put的比值升高對(duì)于植物的抗逆作用是很重要的。在鹽脅迫作用下，植被體內(nèi)的多胺濃度會(huì)產(chǎn)生很大的改變，抗鹽性良好的植被可以 富集濃度很高的Spd與Spm,但是抗鹽性很差的植被在鹽脅迫作用下富集濃度很 高的Put。因此，多胺的濃度提升就能夠增加植被對(duì)鹽脅迫作用的抵抗力。多胺的 合成方式是植被在不利環(huán)境下作用機(jī)制里一個(gè)關(guān)鍵構(gòu)成部分，因此，展開(kāi)多胺催 化酶的實(shí)驗(yàn)研究，是認(rèn)識(shí)多胺的作用效果的主要方式。鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響植物經(jīng)常會(huì)遭受到各種不利生長(zhǎng)環(huán)境的影響，例如嚴(yán)寒、鹽分、干旱以及低 氧等，上述不利生長(zhǎng)環(huán)境會(huì)對(duì)植被正常生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重

10、的威脅甚至破壞。因此鹽脅 迫所導(dǎo)致的滲透作用是造成植物發(fā)育不良的主要環(huán)境問(wèn)題33-35;植被器官在遭受黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文多種不利的生長(zhǎng)環(huán)境脅迫的時(shí)候，植物的細(xì)胞膜將最先受到損壞，細(xì)胞膜的滲透 性提高3637,假如把受損壞的器官放置在無(wú)離子溶液里，外部溶液里電解質(zhì)的濃 度要比植物組織內(nèi)的溶液濃度大，組織會(huì)進(jìn)一步損壞，電解質(zhì)濃度越高損壞程度 越大。使用電導(dǎo)儀檢測(cè)外部電導(dǎo)率的改變，能夠表現(xiàn)出細(xì)胞膜的受損程度。電導(dǎo) 率的數(shù)值越大表明細(xì)胞膜遭受的傷害越多；鹽脅迫還可以阻止植物蛋白質(zhì)的生成， 以及葉綠素減少導(dǎo)致植被葉片變黃3839,植物的光合系統(tǒng)會(huì)受到損傷，植物葉片 中離子平衡及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞，

11、使葉片的潛在活力下降，降低了葉綠素的 活性，進(jìn)而抑制了植物的生長(zhǎng)40;與此同時(shí)，在鹽脅迫作用下，植物會(huì)大量累積 活性氧，活性氧濃度的提升會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生氧化脅迫作用，這就是很多植被針對(duì)外 界環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)激的一個(gè)重要部分41420朱志華43教授曾經(jīng)提出，高濃度的鹽 溶液對(duì)煙草種子的成長(zhǎng)具有非常顯著的抑制作用，這是因?yàn)楦邼舛塞}溶液會(huì)導(dǎo)致 植物細(xì)胞嚴(yán)重縮水，從而嚴(yán)重妨礙種子的生長(zhǎng)發(fā)育，從而妨礙種子的萌芽4445。鹽脅迫針對(duì)植物產(chǎn)生損壞的主要原因是由于高濃度離子的毒性，包括高濃度離子 所產(chǎn)生的滲透壓一級(jí)營(yíng)養(yǎng)損失。Na+與K+的超負(fù)荷累積是造成離子毒性的首要成 因。鹽脅迫作用下的植物體，在自身 Na+富集

12、的過(guò)程中，K+的濃度不斷減少，所以 K+的實(shí)際濃度在植被抗鹽性研究中具有十分關(guān)鍵的作用地位。亞精胺催化酶SPDS刺激腐胺產(chǎn)生亞精胺，精胺催化酶 SPMS刺激亞精胺和 氨內(nèi)基進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生精胺，上述兩類催化酶也正是多胺反應(yīng)過(guò)程里的作用酶。劉 婷婷46教授把蘋果中MdSPDSI遺傳基因轉(zhuǎn)移到煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草中的亞精胺濃 度顯著提升，同時(shí)抗鹽性以及抗病毒水平都大大提升。SPMS和SPDS具有很強(qiáng)的同宗同源性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，SPMS非常有可能是從SPDS47進(jìn)化而來(lái)。 SPMS可以在高濃度鹽溶液以及缺水條件下對(duì)生物起到保護(hù)48,49,當(dāng)植物遭受高溫或者缺水等問(wèn)題的時(shí)候，Spm高濃度富集就非常普遍了

13、 50-52。在長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)環(huán)境下，植物逐漸進(jìn)化出了針對(duì)多種不利環(huán)境的抵抗性以及 適應(yīng)性。研究不斷表明，在植物遭受到鹽脅迫作用的時(shí)候，通常會(huì)在自身體內(nèi)生 成一類具有滲透作用從而保護(hù)自身組織的化合物質(zhì)等5354,多胺的主要作用就是保障植物里的電子平衡，從而保障植物細(xì)胞具有正常的溶液濃度、維護(hù)細(xì)胞活性第1章前言以及細(xì)胞組織正常等效果5556。植物體內(nèi)還有一套抗氧化防御系統(tǒng)，這個(gè)氧化防 御系統(tǒng)包括一些抗氧化酶57、類胡蘿卜素58和維生素e59、生育釀60、抗壞血酸 61以及谷胱甘肽62等。最近幾年以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的專家學(xué)者們也不斷提取出了很多 在逆境條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的遺傳基因，這些遺傳基因可以對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)

14、生有效的保 護(hù)，在不利條件下，誘導(dǎo)的遺傳基因進(jìn)行表達(dá)同時(shí)在數(shù)據(jù)信息傳遞過(guò)程里發(fā)揮巨 大作用63 640獨(dú)創(chuàng)性聲明第3章結(jié)果與分析甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因cDNA全長(zhǎng)的獲得甜菜M14品系葉片總RNA的獲得通過(guò)DNA/RNA計(jì)算設(shè)備檢測(cè)可以得知獲得的甜菜 M14體系的葉片中RNA 總濃度是1.94 ug/L, A26Q/A280依次是1.827, A260/A230比值是2.034,這就表明 獲得的RNA總質(zhì)量以及總濃度都滿足接下來(lái)深入研究的需求，使用凝膠處理提 取出葉片中的RNA,處理結(jié)果如下圖3-1所示。根據(jù)下圖3-1可以得知，28S rRNA的亮度比18S rRNA的亮度高出

15、一倍，這 就說(shuō)明獲得的RNA比較完整，效果良好，能夠用在接下來(lái)的反轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中。甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因cDNA全長(zhǎng)的獲得根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的SAMDC基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物SAMDC-1s和 SAMDC-1as進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增生成物在1%瓊脂凝膠實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試結(jié)果如下 圖3-2所示：產(chǎn)生的白帶長(zhǎng)度在2000bp范圍之內(nèi)，與試驗(yàn)前期結(jié)果的1960bp相 符合，能夠把白帶進(jìn)行回收利用，完成測(cè)序。甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因的生物信息學(xué)分析序列全長(zhǎng)及開(kāi)放閱讀框分析通過(guò)基因全長(zhǎng)引物 SAMDC-1s和SAMDC-1as擴(kuò)增出的BvM14-SAMDC基因 全長(zhǎng)共1960bp

16、,將其序列進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析及編碼蛋白質(zhì)結(jié)果如圖3-3:ORF測(cè)試結(jié)果表明：提取到的BvM14-SAMDC遺傳基因cDNA長(zhǎng)度是1960bp, 5非編碼區(qū)長(zhǎng)度是700bp, 3非編碼區(qū)長(zhǎng)度是141bp,開(kāi)放型區(qū)域長(zhǎng)度 是1119bp （含有終止碼），總共有372個(gè)aa,具有S-腺甘甲硫氨酸脫竣酶保守 結(jié)構(gòu)域，相對(duì)分子量是40.7kDa,點(diǎn)位是4.65。下圖里的綠色條框就是起始碼， 紅色條框是終止碼，粉色條框指的是B型折疊，黃色條框指的是a型旋轉(zhuǎn)。蛋白質(zhì)親/疏水性預(yù)測(cè)分析采用ProtScale在線程序預(yù)測(cè)BvM14-SAMDC氨基酸序列的親水性/疏水性， 結(jié)果如圖3-4所示。獨(dú)創(chuàng)性聲明在多肽鏈中

17、的105位達(dá)到最大值2.533,親水性能最差，第366位達(dá)到最小 值-3.344,疏水性最弱。在所有肽鏈分布里，疏水性的氨基酸含量比較少。蛋白質(zhì)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)對(duì)BvM14-SAMDC蛋白推定蛋白質(zhì)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3-5所示。結(jié)果表明，BvM14-SAMDC蛋白無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析利用NCBI網(wǎng)站中的Blastp軟件對(duì)甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因編碼蛋 白序列進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3-6所示，圖中紅色部分代表保守結(jié)構(gòu)域甜菜M14品系BvM14-SAMDC基因組織特異性表達(dá)分析甜菜M14品系根、莖、葉、花cDNA的獲得采用DNA/RNA計(jì)算設(shè)

18、備檢測(cè)可以得知甜菜 M14體系根部、莖部、花葉等 器官中 RNA 的總濃度依次是 1.92、2.03、1.94、2.03 ug/NIA260/A280 分別為 1.952、 1.960、1.827、1.978, A260/A230為 2.136、2.092、2.034、2.086,這充分說(shuō)明 RNA 的總質(zhì)量和總濃度滿足接下來(lái)深入檢測(cè)的需求，使用凝膠提取根部、莖部、花葉中的RNA含量，處理結(jié)果如下圖3-8所示。BvM14-SAMDC基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物特異性檢測(cè)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的溶解曲線分析，可以判定內(nèi)參基因 18S rRNA 和BvM14-SAMDC基因在甜菜M14品系根、莖

19、、葉、花各器官實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 產(chǎn)物的溶解曲線表明特異性良好。BvM14-SAMDC基因的組織特異性表達(dá)定量分析通過(guò)本次試驗(yàn)，檢測(cè)了甜菜 M14體系中BvM14-SAMDC遺傳基因的根部、 莖部、花葉等多個(gè)組織器官含有的 Ct數(shù)值來(lái)針對(duì)BvM14-SAMDC遺傳基因展開(kāi) 定性的分析研究，方程式是斛CT=(Ct.SAMDC- Ct.18S)Timex- (Ct.SAMDC -Ct.18S)Time0,在方程式里，Ct.SAMDC=SAMDC遺傳基因的Ct大小，Ct.18S是實(shí) 際Ct大小，Time 0=根部，Time x=葉片、莖部、花。因此2-ZXZXCT指的是葉片、 莖部、花里遺傳基因相

20、對(duì)于根部的含量改變系數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表3-1:按照下表3-1數(shù)據(jù)信息繪制出柱形圖，如下圖 3-9所示獨(dú)創(chuàng)性聲明根據(jù)上圖3-9分析可得，BvM14-SAMDC遺傳基因在甜菜M14體系的根部、 莖部、花葉等器官中的含量并不完全相同，其中，在葉片里的含量最少，在根部 的含量最多。BvM14-SAMDC基因的組織特異性表達(dá)結(jié)果半定量 PCR的驗(yàn)證BvM14-SAMDC基因組織特異性表達(dá)的結(jié)果已經(jīng)通過(guò)擴(kuò)增效率、溶解曲線、Ct值等用數(shù)學(xué)方法算出，為了再次驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，將實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反 應(yīng)的生成物依次吸收7山產(chǎn)物完成1%瓊脂凝膠實(shí)驗(yàn)。采用一般的半定量RT-PCR 的方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行再次驗(yàn)證，結(jié)果如

21、圖 3-10:根據(jù)下圖3-10分析可得，1%瓊脂凝膠實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表現(xiàn)出一條白帶，并且BvM14-SAMDC基因在根中的亮度高于其他條帶， 從而進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)時(shí)熒光定 量PCR反應(yīng)結(jié)果的真實(shí)性。BvM14-SAMDC基因的原核表達(dá)原核表達(dá)載體pET28a-BvM14-SAMDC的構(gòu)建BvM14-SAMDC基因片段的獲得通過(guò)基因特性引導(dǎo)物質(zhì) S-WL-SAMDC與AS-WL-SAMDC ,采用甜菜M14 體系500mM鹽脅迫作用下遺傳cDNA 一條單鏈作為模板完成 PCR擴(kuò)增擴(kuò)用。 PCR擴(kuò)增完成之后，把PCR擴(kuò)增產(chǎn)物展開(kāi)1%瓊脂凝膠實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖 3-11(a)所示。把PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pM

22、D18-T連接在一起，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中之后， 提取出質(zhì)粒，完成EcoR I與Sal I酶切檢測(cè)，把酶切產(chǎn)物展開(kāi)1%瓊脂凝膠實(shí)驗(yàn)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖3-11(b)所示。根據(jù)上圖分析可得，BvM14-SAMDC遺傳基因已經(jīng)加載到了 pMD18-T載體 中，能夠應(yīng)用在接下來(lái)的合成原核翻譯載體中。質(zhì)粒pET28a的提取采用堿裂解法從大腸桿菌中將pET28a質(zhì)粒載體提取出來(lái)，.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖 3-12所示?；蚱伍L(zhǎng)度大約在 5026bp范圍之內(nèi)，滿足pET28a質(zhì)粒載體的長(zhǎng) 度要求。條帶清晰，沒(méi)有雜帶，質(zhì)粒沒(méi)有斷裂現(xiàn)象，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。M14-SAMDC重組質(zhì)粒載體的驗(yàn)證獨(dú)創(chuàng)性聲明分別提取pMD18

23、-T-BvM14-SAMDC 重組載體和pET28a載體質(zhì)粒，依次展 開(kāi)EcoRI與Sall酶切處理之后，把酶切生成物進(jìn)行回收、利用，轉(zhuǎn)移到大腸桿 菌JM109里，對(duì)獲得的大腸桿菌完成基因特性引導(dǎo)物質(zhì)S-WL-SAMDC與AS-WL-SAMDC 的PCR擴(kuò)增、檢測(cè)、載體引導(dǎo)物質(zhì) ETY-S與ETY-AS的PCR擴(kuò) 增包括EcoRI與Sal I的酶切檢測(cè)，如下圖3-13與3-14所示。采用引導(dǎo)物質(zhì)以及特性引導(dǎo)物質(zhì) PCR擴(kuò)增處理之后獲得的基因片段長(zhǎng)度和 預(yù)期長(zhǎng)度基本相同，酶切處理之后產(chǎn)生的條帶長(zhǎng)度也和預(yù)期設(shè)計(jì)的條帶長(zhǎng)度基本 相同，這表明在本次試驗(yàn)中，生成的質(zhì)粒載體有效，能夠應(yīng)用在接下來(lái)的采用熱激

24、法，轉(zhuǎn)移到表達(dá)菌株大腸桿菌BL21 (DE3)中，進(jìn)行BvM14-SAMDC蛋白原 核表達(dá)試驗(yàn)。BvM14-SAMDC 蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)把攜帶有質(zhì)粒片段基因的大腸桿菌 BL21 (DE3)依次采用濃度是0.1mM、 0.5mM、1mM 的IPTG作為轉(zhuǎn)基因菌株的誘導(dǎo)劑，在37 c條件下誘導(dǎo) BvM14-SAMDC蛋白的原核表達(dá)，用超聲波將菌液破碎后離心。分別取上清、 沉淀和菌體總蛋白以空質(zhì)粒載體作為對(duì)照跑SDS凝膠電泳，結(jié)果如圖3-15。由圖3-15可知，和對(duì)照組的菌體對(duì)比，在 IPTG作用影響下，負(fù)載有 pET28a-BvM14-SAMDC的陽(yáng)性菌株在總蛋白以及上清里具有一定的蛋白翻譯表

25、達(dá)差異，在沉淀過(guò)程里更加顯著，長(zhǎng)度大約是 40KDa,與預(yù)期大小一致，其中 在1.0mM的IPTG作為誘導(dǎo)劑時(shí)，條帶顏色最為明顯，誘導(dǎo)效果也最好。BvM14-SAMDC 蛋白的 Western印記鑒定BvM14-SAMDC蛋白濃度的測(cè)定把BvM14-SAMDC蛋白通過(guò)純化處理之后，檢測(cè)在 A595條件下的吸光大小 是0.186,推算可知蛋白濃度是 0.0468 mg/L。BvM14-SAMDC 蛋白的 Western印跡鑒定提取10mg的BvM14-SAMDC 蛋白完成 Western檢測(cè)鑒定，鑒定結(jié)果如下 圖3-16所示。1g據(jù)圖3-16可以得知，通過(guò)IPTG作用三個(gè)小時(shí)之后的菌體蛋白獨(dú)創(chuàng)性

26、聲明在40kDa范圍內(nèi)產(chǎn)生條帶，蛋白長(zhǎng)度和攜帶His標(biāo)記的蛋白長(zhǎng)度基本相同，因此 可以確定這個(gè)條帶就是蛋白 pET28a-BvM14-SAMDC ,說(shuō)明BvM14-SAMDC 蛋 白在基因表達(dá)過(guò)程里可以順利翻譯表達(dá)。BvM14-SAMDC基因在擬南芥中的表達(dá)及功能鑒定植物表達(dá)載體 pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC 的構(gòu)建BvM14-SAMDC基因片段的獲得采用基因特性引導(dǎo)物，通過(guò)甜菜M14體系在500mM鹽脅迫作用下植物cDNA中的一條單鏈作為模板完成 PCR擴(kuò)增。在完成PCR擴(kuò)增作用之后，把PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物展開(kāi)1%瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖 3-17(a)所示。把PC

27、R擴(kuò) 增產(chǎn)物和pUCm-T相互連接起來(lái)，轉(zhuǎn)移到大腸桿菌 JM109基因片段之后，取出 質(zhì)粒，展開(kāi)EcoR I與BamH I的檢測(cè)，把驗(yàn)證產(chǎn)物展開(kāi)1%瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖3-17(b)所示。圖片中片段在1100bp左右符合BvM14-SAMDC基 因的大小，證明擴(kuò)增產(chǎn)物正確，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。由圖3-17可知，BvM14-SAMDC基因片段已成功連接 pUCm-T載體。質(zhì)粒 pCAMBIA1305.1 的提取采用堿裂解法提取pCAMBIA1305.1質(zhì)粒載體，.如下圖3-18所示?；蚱?段長(zhǎng)度基本都是在12000bp范圍內(nèi)，符合pCAMBIA1305.1質(zhì)粒載體的大小。條 帶清

28、晰，沒(méi)有雜帶，質(zhì)粒沒(méi)有斷裂現(xiàn)象，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC 重組載體的驗(yàn)證分別提取pUCm-T-BvM14-SAMDC 載體和pCAMBIA1305.1載體質(zhì)粒，依次 展開(kāi)EcoR I與BamH I雙酶切作用之后，把酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收利用，轉(zhuǎn)移到大 腸桿菌的基因JM109里，對(duì)獲得到的基因片段展開(kāi)基因特征引導(dǎo)物的驗(yàn)證作業(yè)， 如下圖3-19與3-20所示。由圖3-20可知，通過(guò)特異引物PCR篩選及雙酶切驗(yàn)證，確定 pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC重組載體構(gòu)建成功，就能夠開(kāi)始接下來(lái)的轉(zhuǎn)基 因農(nóng)桿菌EHA105的測(cè)試。3.5.2.3利用花絮

29、侵染法獲得轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株利用轉(zhuǎn)化pCAMBIA1305.1-BvM14-SAMDC 的陽(yáng)性農(nóng)桿菌，花絮侵染法轉(zhuǎn) 化的擬南芥突變株以及野生型，獲得所有的種子。把采集到的種子放置在1/2MS10獨(dú)創(chuàng)性聲明培養(yǎng)基中（添加Kan 60mg/L）如圖3-25。篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，獲得了大量抗 性植株，將平板中綠色植株移入土中，以供下一步轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子生物學(xué)檢 測(cè)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的基因組PCR篩選采用CTAB大規(guī)模小量法提取轉(zhuǎn)基因擬南芥恢復(fù)植株基因組，以 S-WL-SAMDC和AS-WL-SAMDC為引物，完成PCR擴(kuò)增處理，選擇結(jié)果如下 圖3-26所示。挑選出轉(zhuǎn)基因型植物葉片中多有的 RNA片段，完

30、成反轉(zhuǎn)錄作用生成 cDNA 一條鏈，利用特異引物 S-WL-SAMDC 和AS-WL-SAMDC 進(jìn)彳T RT-PCR反應(yīng)， 結(jié)果如圖3-27所示。根據(jù)上圖可以得知，基因序列 PCR與RT-PCR的檢驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測(cè)結(jié)果基本 相同，這就說(shuō)明BvM14-SAMDC遺傳基因已經(jīng)順利添加到擬南芥野生型（WT）、擬南芥突變型（KO）,并且生成了擬南芥充分表達(dá)型植物（OX）、擬南芥突變 體恢復(fù)植株（CO）。T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性鑒定對(duì)擬南芥植株鮮重、根長(zhǎng)的測(cè)定將擬南芥野生型植株（WT）、SAMDC基因突變株（KO）、SAMDC遺傳 基因突變植株（CO）、SAMDC遺傳基因過(guò)表達(dá)型植株（OX）在1/2M

31、S培養(yǎng)基 中，正常生長(zhǎng)7d后，把植株依次轉(zhuǎn)移到具有100mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基里， 14個(gè)小時(shí)后檢測(cè)植物的重量、根部長(zhǎng)度，檢測(cè)結(jié)果如下圖3-28所示。由圖3-28可知，在100mM NaCl處理下SAMDC基因擬南芥突變株 KO根的 伸長(zhǎng)明顯受到了抑制，但是野生型擬南芥 WT、轉(zhuǎn)基因型植物CO都可以正常發(fā) 育，擬南芥植物OX的根部相對(duì)來(lái)說(shuō)比較長(zhǎng)。 在100mM NaCl處理下SAMDC基 因擬南芥突變株KO的植株鮮重比其它植株小，轉(zhuǎn)基因恢復(fù)植株 CO、野生型擬 南芥WT比KO植株稍重，可以正常生長(zhǎng)，擬南芥過(guò)表達(dá)植株 OX最重。說(shuō)明 BvM14-SAMDC基因可以減小鹽脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)

32、育的抑制作用。3.5,4,4擬南芥植株K+、Na+離子含量的測(cè)定按照3.5,4,2處理擬南芥植株，檢測(cè)擬南芥型植物里的 K+、Na+實(shí)際含量。 按照鉀、鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的擬南芥植株葉片中的鉀鈉離子濃度結(jié)果如圖3-31所11獨(dú)創(chuàng)性聲明示。由圖3-31可知，在100mM NaCl處理前后植物葉片內(nèi)的鉀離子含量稍有變 化，其中KO的變化最大，OX的變化最小最穩(wěn)定，表明在OX之植物里K+是性 對(duì)較為穩(wěn)定的。當(dāng)遭受脅迫的時(shí)候，植物中的 K+會(huì)大大減少，Na+會(huì)大大增多， 從而產(chǎn)生K+/Na+比例失衡。同時(shí)，如果 K+/Na+比例越低，那么植物遭受的破壞 就會(huì)越嚴(yán)重。如圖所示Na+在處理前四種植株的含量相差

33、不大，在完成鹽脅迫作 用之后，四類植物中的Na+含量大大提升，并且在KO型植物里的Na+增高最為 顯著，也就是說(shuō)KO植株中K+/Na+比值是最低的，受到的損傷也是最大的。OX植株的Na+增加相對(duì)來(lái)說(shuō)較小，K+/Na+比值也比KO的比值大，說(shuō)明OX植株受 到的損傷是較小的。K+、Na+的穩(wěn)態(tài)在植物耐鹽性中有重要的意義， BvM14-SAMDC基因?qū)Ρ３种仓曛蠯+、Na+的穩(wěn)態(tài)有幫助。第4章討論BvM14-SAMDC基因編碼一個(gè)有功能的 S-腺昔甲硫氨酸脫竣 酶BvM14-SAMDC基因在鹽脅迫中的響應(yīng)植物對(duì)于鹽害的調(diào)節(jié)作用主要可以分為生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、滲透作用調(diào)節(jié)、細(xì)胞 膜防護(hù)物質(zhì)以及溶解氧的平衡調(diào)

34、節(jié)。 多胺具備有效的陽(yáng)離子作用，因此它可以與 很多帶有負(fù)電荷的大分子結(jié)合在一起，例如DNA、油脂、維生素包括多種磷脂等，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜性能具有良好的作用效果。多胺也可以和離子發(fā)生反應(yīng)，從而生成離子作用的阻滯劑。多胺可以采用影響離子蛋白的活性或細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)來(lái)控制 離子通道，進(jìn)而保證 K+/Na+在植物細(xì)胞內(nèi)保持平衡狀態(tài)， 提高其耐鹽性。在鹽脅迫下不同物種中的多胺對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是不一樣的，多胺積累的情況也不同，如菠菜、茵苣、冬瓜、辣椒、西蘭花、番茄這些植物的幼苗在鹽脅迫下 的腐胺濃度都很低，但是鹽脅迫作用導(dǎo)致所有植株里的精胺、亞精胺比重顯著提升?？果}性良好的植物可以富集更高濃度的Spd與Spm,同時(shí)抗鹽性很差的植物就會(huì)在鹽脅迫作用下富集高濃度的 Put。在本試驗(yàn)中，擬南芥植株在鹽脅迫下積累