單基因遺傳性疾病的分子診斷課件

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity1單基因遺傳性疾病的分子診斷

溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity2

遺傳性疾病主要分為兩大類：符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的單基因遺傳病(特點(diǎn):病種多、在特定家系中發(fā)病率高、對(duì)群體的影響小)不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律的多基因遺傳病（又稱多因素性疾病，特點(diǎn)：病種相對(duì)較少、不僅在特定家系中發(fā)病率高、而且對(duì)群體的影響大）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity3單基因遺傳病是指受一對(duì)等位基因控制的遺傳病，有6600多種，并且每年在以10-50種的速度遞增，單基因遺傳病已經(jīng)對(duì)人類健康構(gòu)成了較大的威脅。較常見(jiàn)的有紅綠色盲、血友病、白化病等。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity5常染色體顯性遺傳病位于常染色體上的兩個(gè)等位基因中，如有一個(gè)突變，這個(gè)突變基因的異常效應(yīng)就能顯示發(fā)病。特點(diǎn)：遺傳與性別無(wú)關(guān)，男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等；患者雙親往往有一方為患者。家族性多發(fā)性結(jié)腸息肉、多指、并指等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity6常染色體隱性遺傳病致病基因?yàn)槲挥诔Ｈ旧w上的隱性基因，當(dāng)隱性基因純合時(shí)才能發(fā)病。即隱性遺傳病

單基因遺傳病患者，大多是由兩個(gè)攜帶者所生的后代。特點(diǎn)：男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等，發(fā)病與性別無(wú)關(guān)；雙親為無(wú)病攜帶者，子女發(fā)病概率為25%；常是越代遺傳；近親婚配時(shí)，子女中隱性遺傳病患病率大為增高。先天性聾啞、白化病、苯丙酮尿癥等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity7X連鎖顯性遺傳病特點(diǎn)：女性發(fā)病率高，這是由于女性有兩條X染色體，獲得這一顯性致病基因的概率高之故，但病情較男性輕。男性患者病情重，他的全部女兒都將患病?？咕S生素D佝僂病、家族性遺傳性腎炎等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity8X連鎖隱性遺傳病特點(diǎn)：女性攜帶，男性患病。男性的致病基因只能隨著X染色體傳給女兒，不能傳給兒子，稱為交叉遺傳。血友病A。病因：血漿中抗血友病球蛋白減少，AHG即第Ⅷ因子凝血時(shí)間延長(zhǎng)。臨床表現(xiàn)：輕微創(chuàng)傷即出血不止，不出血時(shí)與常人無(wú)異。血友病B。病因：血漿中缺乏凝血酶成份PTC，即第Ⅸ因子。臨床表現(xiàn)同血友病A。色盲。臨床表現(xiàn)：全色盲對(duì)所有顏色看成無(wú)色，紅綠色盲為不能區(qū)別紅色和綠色。進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良。病因：為原發(fā)性橫紋肌變性并進(jìn)行性發(fā)展。臨床表現(xiàn)：初為行走笨拙，易跌到，登梯及起立時(shí)有困難，從仰臥到起立必須先俯臥，雙手撐地，再用兩手扶小腿、大腿才能站起。進(jìn)行性肌肉萎縮，但一般不累及面部及手部肌肉。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity10

遺傳病的診斷方法可以簡(jiǎn)單的分為以下的四類：1.分子水平的診斷：包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的酶切分析、基因型和單體型的連鎖和關(guān)聯(lián)分析、基因的序列分析。2.細(xì)胞水平的診斷：采用細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析，比如熒光原位雜交法。3.蛋白質(zhì)水平的診斷：采用生物化學(xué)方法分析異常表達(dá)的蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物。4.疾病動(dòng)物模型的輔助診斷：建立相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型，輔助診斷或判定人類疾病的致病基因。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity12遺傳性疾病分子診斷的直接策略就是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)直接檢測(cè)導(dǎo)致遺傳性疾病的各種基因突變，如基因的缺失、插入、倍增或者是點(diǎn)突變等遺傳缺陷。因此直接診斷的前提是被測(cè)基因已經(jīng)克隆，其核酸序列和結(jié)構(gòu)已被闡明。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity14

2、片段性突變的檢測(cè)

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴(kuò)增和重組。對(duì)于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測(cè)點(diǎn)突變的方法，而對(duì)于大的片段突變，則使用Southern印跡技術(shù)和多重PCR技術(shù)。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity15間接診斷策略和方法：采用多態(tài)性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體、相關(guān)基因的等位基因型和單倍體型等，并判定被檢者是否有這條存在基因缺陷的染色體、相關(guān)基因的等位基因型和單倍體型等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity16《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄（2013年版）》檢驗(yàn)項(xiàng)目1462項(xiàng)：一、臨床體液、血液專業(yè)（360項(xiàng)）二、臨床化學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)（347項(xiàng)）三、臨床免疫、血清學(xué)專業(yè)（458項(xiàng)）四、臨床微生物學(xué)專業(yè)（152項(xiàng)）五、臨床分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)（145項(xiàng)）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity17五、臨床分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)1、感染性疾病分子生物學(xué)檢驗(yàn)（89項(xiàng)）2、疾病相關(guān)分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)（25項(xiàng)）3、腫瘤分子生物學(xué)檢驗(yàn)（17項(xiàng)）4、用藥指導(dǎo)的分子生物學(xué)檢驗(yàn)（10項(xiàng)）5、其它（4項(xiàng)）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity182、疾病相關(guān)分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)染色體核型分析染色體熒光原位雜交分析脆性X染色體核型分析羊水細(xì)胞染色體分析高分辨染色體核型分析絨毛組織染色體分析姐妹染色體互換分析染色體分析21三體和性染色體多倍體檢測(cè)單基因遺傳病基因突變檢測(cè)遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良基因分析α地中海貧血基因突變檢測(cè)肝豆?fàn)詈俗冃曰蚍治靓碌刂泻Ｘ氀蛲蛔儥z測(cè)血友病基因分析苯丙酮尿癥的基因突變檢測(cè)脆性X綜合癥基因分析遺傳性耳聾基因檢測(cè)Y染色體性別基因分析HLA低分辨基因分型檢測(cè)脫氧核糖核酸倍體分析HLA中分辨基因分型檢測(cè)血細(xì)胞熒光原位雜交分析HLA高分辨基因分型檢測(cè)未經(jīng)處理的羊水細(xì)胞熒光原位雜交分析

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity20導(dǎo)致單基因病產(chǎn)生的基因突變類型基因突變點(diǎn)突變密碼子插入或缺失移碼突變外顯子缺失或重復(fù)基因倒位基因融合動(dòng)態(tài)突變SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity21針對(duì)單基因病基因突變的分子診斷技術(shù)DNA雜交基因酶譜連鎖分析寡核苷酸探針雜交PCR基因芯片DNA測(cè)序SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity23

一、血紅蛋白病血紅蛋白的構(gòu)成：2條α珠蛋白（141aa）和2條β珠蛋白（146aa）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity24（一）珠蛋白基因簇的結(jié)構(gòu)α珠蛋白基因簇：16Pter-p13.3

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity26（二）鐮狀細(xì)胞貧血癥的分子診斷鐮狀細(xì)胞貧血是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病。臨床表現(xiàn)為慢性溶血性貧血、易感染和再發(fā)性疼痛危象以致慢性局部缺血導(dǎo)致器官組織損害。也是嚴(yán)重危害母子健康的疾病,可使胎兒死亡率達(dá)5%，孕婦死亡率達(dá)4.62%

。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity27因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構(gòu)成鐮狀血紅蛋白(HbS)，取代了正常Hb(HbA)。在氧分壓下降時(shí)HbS分子間相互作用，成為溶解度很低的螺旋形多聚體，使紅細(xì)胞扭曲成鐮狀細(xì)胞（鐮變）。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity28純合子型：SS，完全沒(méi)有正常的HbA,預(yù)后嚴(yán)重，只有14%活到成年，而多死亡于30歲前。雜合子型：AS，即正常HbA與異常HbS相混。在非洲有35%的病人是AS型基因；其變化懸殊，輕者可活至成年，重者可反復(fù)出現(xiàn)危象發(fā)作。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity30鐮狀細(xì)胞貧血的分子診斷方法Mst

IICCTGAGGCCTG

TGG突變型野生型1.15kb0.2kb1.35kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity31限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測(cè)1.35kb1.15kb0.2kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity32（三）地中海貧血的分子診斷地中海貧血又稱海洋性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血，是一組遺傳性溶血性貧血疾病。由于遺傳的基因缺陷致使血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺如或不足所導(dǎo)致的貧血或病理狀態(tài)。本病廣泛分布于世界許多地區(qū)，東南亞即為高發(fā)區(qū)之一。我國(guó)廣東、廣西、四川多見(jiàn)，長(zhǎng)江以南各省區(qū)有散發(fā)病例，北方則少見(jiàn)。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity33根據(jù)所缺乏的珠蛋白鏈種類及缺乏程度予以命名和分類。分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見(jiàn)。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity34α地中海貧血：大多數(shù)是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少數(shù)由基因點(diǎn)突變?cè)斐伞?/p>

各種表型的α地中海貧血的基因型表型基因型正常人αα/αα靜止型α地中海貧血α—/αα標(biāo)準(zhǔn)型α地中海貧血—

—/ααHbH病（β4）α—/—

—HbBart’s（胎兒水腫綜合癥，γ4）—

—/—

—ζψζψα2ψα1α2α1θ1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity35基因突變：缺失為主遺傳方式：不完全顯性遺傳？--/αα

--/αα--/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity36α地中海貧血的基因診斷BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα基因簇限制性酶切片段和分子雜交探針SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity37限制酶切片段電泳后，經(jīng)SouthernBlot檢測(cè)14kb10kbaa/aaaa/a-aa/--a-/----/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity38β地中海貧血：主要是由于基因的點(diǎn)突變，少數(shù)為基因缺失。

LCRεGγAγψβ1δβIVS-IIVS-IIβ基因簇和β基因的結(jié)構(gòu)SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity39基因缺失和有些點(diǎn)突變可致β鏈的生成完全受抑制，稱為β0地貧；有些點(diǎn)突變使β鏈的生成部分受抑制，則稱為β+地貧。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity40β地貧基因突變較多，迄今已發(fā)現(xiàn)的突變點(diǎn)達(dá)100多種，國(guó)內(nèi)已發(fā)現(xiàn)28種。其中常見(jiàn)的突變有6種：①β41-42（-TCTT)，約占45%；②IVS-Ⅱ654(C→T)，約占24%；③β17(A→T)；約占14%；④TATA盒-28(A→T)，約占9%；⑤β71-72（+A),約占2%；⑥β26(G→A)，即HbE26，約占2%。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity41

突變類型

分子缺陷

人群1．核苷酸取代(1)β-28核苷酸A→CTATA區(qū)轉(zhuǎn)錄信號(hào)突變，β+中國(guó)人(2)βIVS-1第1核苷酸G→A拼接接頭突變，導(dǎo)致RNA加工缺陷，β0地中海地區(qū)人(3)βIVS-1第5核苷酸G→C共有順序突變導(dǎo)致RNA加工缺陷，β+印第安人(4)βIVS-2第654核苷酸C→T內(nèi)含子變化導(dǎo)致RNA加工缺陷，β0中國(guó)人(5)β第17密碼子A→T無(wú)義突變導(dǎo)致無(wú)功能RNA，β0中國(guó)人(6)HbKnossos(β27丙→絲)編碼區(qū)突變導(dǎo)致RNA加工缺陷，β+地中海地區(qū)人2．

核苷酸插入β密碼子71-72間插入1bp移碼突變導(dǎo)致無(wú)功能mRNA，β0中國(guó)人3．

核苷酸缺失β密碼子41／42(-4)缺失移碼突變導(dǎo)致無(wú)功能mRNA，β0中國(guó)人SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity42遺傳方式：不完全顯性遺傳β/β0

β/β0β0/β0SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity43在b珠蛋白基因第2內(nèi)含子第654位核苷酸C→T突變（IVS-II-654C→T，簡(jiǎn)稱b654），是中國(guó)人所特有的，而且是最常見(jiàn)的b地貧基因突變之一。654*ABCmRNA(N)mRNA(M)IVSIIVSII579↓73bpIVSIIVSIIb-globingeneb654mRNA的剪接模式SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity44β654基因突變的分子診斷－RT-PCR法診斷剪切異常NormalββPatientββ０

β０

β０254bp181bp輕型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity45β654基因突變的分子診斷－PCR-ASO方法雜交不雜交不雜交雜交正常雜合子輕型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity46反向點(diǎn)雜交同時(shí)診斷β基因多個(gè)點(diǎn)突變M1M2M3M4M5M6

正常探針突變探針

基因芯片技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種診斷β地貧的芯片檢測(cè)閱讀系統(tǒng)，系統(tǒng)多采用國(guó)際先進(jìn)的PCR體外擴(kuò)增結(jié)合DNA芯片反向點(diǎn)雜交檢測(cè)技術(shù)，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)全血樣本中β珠蛋白基因上多個(gè)基因位點(diǎn)的突變

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity47二、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）肌營(yíng)養(yǎng)不良癥由于遺傳方式的不同大致可分為以下幾類：X染色體隱性遺傳的Duchenne型和良性的Becker型常染色體顯性遺傳的面-肩-肱型常染色體隱性遺傳的肢帶型在各型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中，Duchenne型發(fā)病率最高，病情也嚴(yán)重，常早年致殘并導(dǎo)致死亡，是遺傳性肌萎縮癥中最有代表性的疾病。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity48杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是一種X染色體隱性遺傳疾病，主要發(fā)生于男孩。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球平均每3500個(gè)新生男嬰中就有一人罹患此病。患者在學(xué)齡前就會(huì)因骨骼肌不斷退化出現(xiàn)肌肉無(wú)力或萎縮，導(dǎo)致不便行走。大概在7歲到12歲時(shí)，會(huì)徹底喪失行走能力，通常到20多歲就會(huì)因?yàn)樾募?、肺肌無(wú)力而死亡。針對(duì)該病，醫(yī)學(xué)界尚無(wú)有效療法。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity49（一）遺傳方式和DMD基因突變

遺傳方式：XRDMD基因定位于Xp21.2，是目前已知人類最大的基因，包括79個(gè)外顯子基因缺失是DMD發(fā)生的主要原因（約占60%~70%）

Xp21.2-p21.1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity51（二）杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的分子診斷多重PCR技術(shù)診斷DMD基因缺失Chamberlain設(shè)計(jì)了9對(duì)引物，可同時(shí)擴(kuò)增第4、8、12、17、19、44、45、48和51號(hào)外顯子Beggs設(shè)計(jì)了9對(duì)引物，可同時(shí)擴(kuò)增啟動(dòng)子、第3、6、13、43、47、50、52和60號(hào)外顯子18對(duì)引物的多重PCR擴(kuò)增可以檢測(cè)出DMD基因的98%缺失患者

5’3’PatientsSt(-)(+)12345DMDGENEagfbhcdeabcdefghSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity54多重PCR診斷DMD基因外顯子缺失I：外顯子45缺失II：外顯子48缺失III：正常對(duì)照

多重探針連接擴(kuò)增Multiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA)測(cè)序：Sanger雙脫氧鏈末端終止法二代基因測(cè)序技術(shù)，如雜交測(cè)序法（SBH）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity56血友病為一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時(shí)間延長(zhǎng)，終身具有輕微創(chuàng)傷后出血傾向，重癥患者沒(méi)有明顯外傷也可發(fā)生“自發(fā)性”出血。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity57三、Ａ型血友病1.血友病A（血友病甲），即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏癥，也稱AGH缺乏癥，是X染色體隱性遺傳疾病。2.血友病B（血友病乙），即因子Ⅸ缺乏癥，又稱PTC缺乏癥、凝血活酶成分缺乏癥，亦為X染色體隱性遺傳。3.血友病C（血友病丙），即因子Ⅺ（FⅪ）缺乏癥，又稱PTA缺乏癥、凝血活酶前質(zhì)缺乏癥。為常染色體不完全隱性遺傳。15～20/10萬(wàn)男孩中有發(fā)病，此發(fā)病率在所調(diào)查的不同的種族和地域之間沒(méi)有差異。發(fā)病率以血友病A最多占85%，血友病B占15%，血友病C罕見(jiàn)。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity58（一）FⅧ的基因結(jié)構(gòu)

FⅧ基因位于X染色體長(zhǎng)臂末端（Xq28），包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)186kb。包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，其mRNA全長(zhǎng)約為9kb，cDNA為9009bp。其翻譯產(chǎn)物為2351個(gè)aa殘基的多肽鏈。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity59（二）Ａ型血友病的遺傳方式和基因突變遺傳方式：XR已報(bào)道FⅧ基因點(diǎn)突變174種，缺失117種，插入10種。由于導(dǎo)致HAFⅧ基因的點(diǎn)突變多，故在實(shí)際工作中不可能對(duì)每一病人作點(diǎn)突變的檢測(cè)，所以DNA多態(tài)性的連鎖分析仍然是Ａ型血友病基因診斷的常用手段。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity60A型血友病的分子診斷－PCR-RFLP連鎖分析法SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity61血友病A（HemophiliaA,HA）99bp43bp142bpBcl

IBcl

I142bpSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity63Amp-FLP

在FVⅢ區(qū)內(nèi)尚有兩個(gè)VNTP區(qū)，一個(gè)位于DXS52，另一個(gè)位于DX102內(nèi)，它仍均具有復(fù)雜的多態(tài)性，亦可用于連鎖分析。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity64其他診斷方法PCR-SSCPPCR-DGGESchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity65SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity66四、苯丙酮酸尿癥（PKU）（一）苯丙氨酸羥化酶（PAH）基因突變編碼PAH的基因發(fā)生突變，致使PAH活性降低或喪失

PAH突變種類達(dá)440余種，涉及13個(gè)外顯子，突變的80%發(fā)生在外顯子5~12編碼區(qū)

中國(guó)人的PAH基因突變類型30余種，已確定20多種，大約占所有基因突變類型的80%

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity67苯丙酮酸尿癥的遺傳方式：ARaaAaAaSchoolofLaboratoryMedic