高效液相色譜基礎(chǔ)知識(2012版)

高效液相色譜基礎(chǔ)知識主講侯建軍一、簡介

色譜學是現(xiàn)代分離分析的一個重要領(lǐng)域，也是一門新興學科，在化學、生物學等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的地位。近幾十年來，色譜學各分支，如氣相色譜、液相色譜、薄層色譜等研究方法都得到了深入的研究，20世紀50年代創(chuàng)立了氣相色譜法，它的出現(xiàn)把色譜法從分離技術(shù)提高到分離與“在線”分析的新水平，為色譜法成為現(xiàn)代分離-分析方法奠定了基礎(chǔ)，1957年誕生了毛細管色譜法。20世紀60年代推出了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

（LC-MS），有效的彌補了色譜法定性分析特征性差的弱點，成為最重要的分離分析方法之一，LC-MS在選擇性、靈敏度、分子量測定和提供結(jié)構(gòu)信息方面具有明顯的優(yōu)勢，能夠同時獲得可靠的定性定量結(jié)果，因而被廣泛應(yīng)用于藥物的質(zhì)量控制（雜質(zhì)、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等的鑒定和測定）、藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布和代謝研究（包括代謝物的結(jié)構(gòu)確定及定量）和臨床醫(yī)學研究（如蛋白異常的研究）。LC-MS已成為新藥研究必不可少的手段。20世紀70年代，高效液相色譜法崛起克服了氣相色譜法不能直接用于分析難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子化合物等的弱點，大大擴大了色譜法的應(yīng)用范圍，把色譜法推進到一個新水平。高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是一種高效、快速的分離分析技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好的特點。HPLC具有的同時分離和分析的功能對于體內(nèi)藥物分析和體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的分析及成分復(fù)雜的中藥分析尤其重要。HPLC的分離功能還廣泛用于藥物的純化和制備，如用制備色譜分離

天然藥物的有效成分，或制備手性藥物的單一對應(yīng)體。由于使用各種高靈敏度的檢測器，如熒光、電化學和化學發(fā)光檢測器，再結(jié)合許多衍生化技術(shù)及樣品富集技術(shù)，HPLC對許多藥物的最低檢測限都達到了pg級或更低水平，非常適合于一些微量成分甚至痕量成分的分析。由于色譜條件的可控制性及進樣技術(shù)和在線樣品處理技術(shù)的發(fā)展，HPLC分析的精密度完全能夠滿足醫(yī)藥分析實驗室的要求。HPLC一般在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)即可完成一個樣品分析，而且往往能夠?qū)崿F(xiàn)多組分的同時測

定，這一快速分析的特點使HPLC廣泛應(yīng)用于藥物合成的各部反應(yīng)的監(jiān)控和臨床治療藥物的監(jiān)測。HPLC的柱切換技術(shù)是通過程序控制的切換閥改變流動相的流向和（或）流動相系統(tǒng)的技術(shù)。這一技術(shù)在醫(yī)藥分析中的應(yīng)用越來越多，尤其在藥物分析中的應(yīng)用最為廣泛。利用柱切換技術(shù)可以實現(xiàn)樣品的在線凈化與富集、在線衍生化、在多個色譜柱上進行分離。在復(fù)雜樣品的分析方面有著巨大的潛力。目前，高效液相色譜已成為化學、生化、醫(yī)學、工、

業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢和法檢等學科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)，是分析化學家和生物化學家手中用以解決他們面臨的各種實際分析和分離課題必不可少的工具之一。液相色譜根據(jù)固定相性質(zhì)可分為離子交換色譜、吸附色譜、鍵合相色譜和大小排阻色譜。

離子交換色譜法是流動相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進行可逆交換時，它們對交換劑的基體離子親和力的不同而達到分離的。組分離子對交換劑基體離子親和力越大，保留時間就越長。

吸附色譜法是當組分分子流經(jīng)固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時，不同組分分子、流動相分子就要對吸附劑表面的活性中心展開競爭。這種競爭能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。

鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過化學反應(yīng)鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。采用化學鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。

大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴散進入細孔中，保留時間最長；大分子完全排斥在孔外，隨流動

相很快流出，保留時間最短。在以上四種分離方式中，反相鍵合相色譜應(yīng)用最廣，因為它采用醇—水或腈—水體系作流動相。純水易得廉價，它的紫外吸收極小。在純水中添加各種物質(zhì)可改變流動相選擇性。使用最廣的反相鍵合相是十八烷基鍵合相，即讓十八烷基（C18H37—）鍵合到硅膠表面。這種鍵合相又稱ODS（Octadecylsilyl）鍵合相，如國外的partisil5-ODS、Zorbax-ODS、Shim-packCLC-ODS，國產(chǎn)的YWG-C18等。

二、基本概念和術(shù)語一、色譜圖和峰參數(shù)1、色譜圖(chromatogram)--樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線(elutionprofile)。2、基線(baseline)--經(jīng)流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時間軸?；€反映儀器及操作條件的恒定程度，主要由流動相中的雜質(zhì)等因素決定。

3、噪音(noise)--基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。

4、漂移(drift)--基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產(chǎn)生漂移。5、色譜峰(peak)--組分流經(jīng)檢測器時響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形

正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。6、拖尾因子(tailingfactor，T)，用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子(symmetryfactor)或不對稱因子(asymmetryfactor)。《中國藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。T＜0.95為前延峰，T＞1.05為拖尾峰。7、峰底-基線上峰的起點至終點的距離。

8、峰高(peakheight，h)-峰的最高點至峰底的距離。9、峰寬（peakwidth，W)-峰兩側(cè)拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。W＝4σ10、半峰寬（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。Wh/2＝2.355σ11、標準偏差（standarddeviation，σ)-正態(tài)分布曲線x＝±1時（拐點）的峰寬之半。正常峰的拐點在峰高的0.607倍處。標準偏差的大小說明組分在流出色譜柱過程中的分散程度。σ小，分散程度小、極點濃度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。12、峰面積(peakarea，A)-峰與峰底所包圍的面積。二、定性參數(shù)（保留值）1、死時間(deadtime，t0)--不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時間。2、死體積(deadvolume，V0)--由進樣器進樣口到檢測器流動池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測器流動池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過程，其它3部分只起峰擴展作

用。為防止峰擴展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。V0＝F×t0（F為流速）3、保留時間(retentiontime，tR)--從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時間。4、保留體積(retentionvolume，VR)--從進樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時流出溶劑的體積。又稱洗脫體積。VR＝F×tR5、調(diào)整保留時間(adjustedretentiontime，t'R)--扣除死時間后的保留時間。也稱折合保留時間(reduced

retentiontime)。在實驗條件（溫度、固定相等）一定時，t'R只決定于組分的性質(zhì)，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t06、調(diào)整保留體積(adjustedretentionvolume，V‘R)--扣除死體積后的保留體積。三、柱效參數(shù)1、理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)--用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。N取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。

在一張多組分色譜圖上，如果各組分含量相當，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。1.1用半峰寬計算理論塔數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更易準確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。1.2N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的N在1000以上。）1.3若用調(diào)整保留時間(t'R)計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)。

2、理論塔板高度(theoreticalplateheight，H)--每單位柱長的方差。實際應(yīng)用時往往用柱長L和理論塔板數(shù)計算。四相平衡參數(shù)1、分配系數(shù)(distributioncoefficient，K)--在一定溫度下，化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相（Cs）與流動相（Cm）中的濃度之比。K=Cs/Cm分配系數(shù)與組分、流動相和固定相的熱力學性質(zhì)有關(guān)，也與溫度、壓力有關(guān)。在不同的色譜分離機制中，

K有不同的概念：吸附色譜法為吸附系數(shù)，離子交換色譜法為選擇性系數(shù)(或稱交換系數(shù))，凝膠色譜法為滲透參數(shù)。但一般情況可用分配系數(shù)來表示。在同一色譜條件下，樣品中K值大的組分在固定相中滯留時間長，后流出色譜柱；K值小的組分則滯留時間短，先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分的分配系數(shù)相差越大，越容易分離，因此混合物中各組分的分配系數(shù)不同是色譜分離的前提。

在HPLC中，固定相確定后，K主要受流動相的性質(zhì)影響。實踐中主要靠調(diào)整流動相的組成配比及pH值，以獲得組分間的分配系數(shù)差異及適宜的保留時間，達到分離的目的。2、容量因子(capacityfactor，k)--化合物在兩相間達到分配平衡時，在固定相與流動相中的量之比。因此容量因子也稱質(zhì)量分配系數(shù)。

容量因子的物理意義：表示一個組分在固定相中停留的時間（t‘R）是不保留組分保留時間（t0)的幾倍。k＝0時，化合物全部存在于流動相中，在固定相中不保留，t’R＝0；k越大，說明固定相對此組分的容量越大，出柱慢，保留時間越長3、選擇性因子(selectivityfactor，α)--相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比。α又稱為相對保留時間。要使兩組分得到分離，必須使α≠1。α與化合物在固定相和流動相中的分配性質(zhì)、柱溫有關(guān)，與柱尺寸、流速、填充情況無關(guān)。從本質(zhì)上來說，α的大小表示兩組分在兩相間的平衡分配熱力學性質(zhì)的差異，即分子間相互作用力的差異。五、分離參數(shù)分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。當W1＝W2時，R＝0；當R＝1時，稱為4σ分離，兩峰基本分離；R＝1.5時，稱為6σ分離。R≥1.5稱為完全分離。中國藥典規(guī)定R應(yīng)大于1.5。

提高分離度有三種途徑：①增加塔板數(shù)。方法之一是增加柱長，但這樣會延長保留時間、增加柱壓。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加選擇性。當α＝1時，R＝0，無論柱效有多高，組分也不可能分離。一般可以采取以下措施來改變選擇性：a.改變流動相的組成及pH值；b.改變柱溫；c.改變固定相。③改變?nèi)萘恳蜃?。這常常是提高分離度的最容易方法，可以通過調(diào)節(jié)流動相的組成來實現(xiàn)。三、基本分析方法高效液相色譜法在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用非常廣泛，它能用于化學合成藥物的含量測定和雜質(zhì)限量分析，用于中草藥和中成藥的定性鑒別和有效成分或指標成分的測定，也用于制劑分析，還用于藥物代謝和動力學研究。此外，HPLC還廣泛用于天然藥物有效成份的分離制備和純化。這些方法主要分為：定性分析、定量分析、雜質(zhì)分析。對于任何方法都必須進行驗證和評價。

一HPLC分析方法的參數(shù)及驗證1.專一性專一性（specificity）又稱為特效性，是指在可能存在諸多干擾組分時方法明確確定被分析組分的能力，分析含有和不含有干擾組分的樣品，比較分析結(jié)果，其差異即是方法偏差（bias）。如果結(jié)果沒有差異，則說明方法具有專