大鼠動情周期抑制與腎上腺軸活化的關(guān)系

大鼠動情周期抑制與腎上腺軸活化的關(guān)系

結(jié)果表明，天麻-垂體-腎上腺軸（hyp-a）與月經(jīng)運動性失衡（pmi）之間有密切關(guān)系。但有關(guān)遞增負(fù)荷訓(xùn)練對腎上腺束狀帶結(jié)構(gòu)與功能影響及其與運動性月經(jīng)失調(diào)關(guān)系的系統(tǒng)研究鮮有報道。本實驗通過建立運動性閉經(jīng)(AthleticAmenorrhea,AA)動物模型,采用透射電鏡(TEM)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光(CLIA)檢測技術(shù),觀察及分析遞增負(fù)荷訓(xùn)練過程中,雌性大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶結(jié)構(gòu)與功能的變化,旨在為探討AMI的發(fā)生機(jī)制提供實驗參考。1材料和方法1.1實驗動物與飼料選用健康、成熟的2月齡雌性純種Sprange-Dawley(SD)大鼠35只,體重229.29±10.37g,由中國科學(xué)院上海實驗動物有限公司提供。國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料分籠飼養(yǎng),每籠7只,自由飲食,室溫20℃~25℃,相對濕度45%~55%,每日光照12小時。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行1周適應(yīng)性訓(xùn)練。1.2大鼠運動負(fù)荷水平將大鼠隨機(jī)分為對照組(C),7周訓(xùn)練組(Ta),7周訓(xùn)練恢復(fù)1周組(Tar),5周訓(xùn)練組(Tb)和3周訓(xùn)練組(Tc),每組7只。參照Bedford的動物運動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn),采用段氏PT98型鼠類跑臺進(jìn)行訓(xùn)練。Ta、Tb和Tc組大鼠分別按表1負(fù)荷訓(xùn)練7周(1~7周)、5周(3~7周)及3周(5~7周)。Tb組大鼠于第3周開始訓(xùn)練,Tc組于第5周開始訓(xùn)練。每天訓(xùn)練2次,上、下午各1次,第7周最后1天晚上加訓(xùn)1次。1.3大鼠正常動情周期的觀察各組大鼠分別于每天上午訓(xùn)練前8∶00~9∶00及晚上21∶00~22∶00行1次陰道脫落細(xì)胞檢查;連續(xù)觀察2個周期,確保被選用大鼠均有正常動情周期。所有訓(xùn)練大鼠訓(xùn)練1周后,隔天行陰道脫落細(xì)胞檢查:制備陰道脫落細(xì)胞涂片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞變化,每只大鼠每次光學(xué)顯微鏡下計數(shù)100個陰道鱗狀上皮細(xì)胞,求得中底層細(xì)胞的平均百分比。1.4肝腎毒性測定所有訓(xùn)練大鼠7周后停訓(xùn)36小時,安靜狀態(tài)下稱重,以2%戊巴比妥納40mg/kg體重腹腔麻醉,迅速打開胸腹腔,右心室進(jìn)針取血5~6ml,左心室連續(xù)灌入生理鹽水250ml(洗去血液),后灌入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液(0.2M,pH7.4)250ml,取出腎上腺,稱重后用PBS(0.01M,pH7.4)洗滌,將左右側(cè)腎上腺分別放入2.5%戊二醛溶液(4℃)和10%甲醛溶液(常溫)中待測。Tc組與C組大鼠于動情間期處死。為避免晝夜節(jié)律對激素水平的影響,所有大鼠均安排在上午8∶00~10∶00處死。1.5樣品的制備和檢測1.5.1活性化合物測定將血液樣本注入預(yù)冷的裝有1%肝素的塑料指形管內(nèi),混勻,低溫離心(3000r/min)10~15min,取上清液置于-20℃冰箱中,待測ACTH。大鼠血漿ACTH的測定采用CLIA法。儀器為拜耳公司提供的ACS180SE全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),試劑為固相磁粉。1.5.2雙氧鈾染色劑取出已固定的一側(cè)腎上腺,用PBS緩沖液洗滌2次,每次10min;再用1%鋨酸PBS固定液于4℃后固定2h;后用PBS緩沖液漂洗2次,每次10min;接著用30%-50%-70%乙醇逐級脫水,每次10min;70%乙醇(含3%醋酸雙氧鈾)染2h;80%-95%-100%乙醇逐級脫水,每次10min;100%環(huán)氧丙烷置換2次,每次10min;浸潤包埋:依次用環(huán)氧樹脂與618包埋劑(1∶1)浸透2h,環(huán)氧樹脂與618包埋劑(1∶2)過夜,純618包埋液浸透(37℃)6小時;然后放入60℃烘箱內(nèi)48小時。切厚片,在光學(xué)顯微鏡下定位,最后用LKBV型超薄切片機(jī)切薄片(厚度700A),經(jīng)枸櫞酸鉛電子染色,采用日本H-500透射電鏡觀察、拍片。1.5.3光刻樣品的制備取中性甲醛固定后的另一側(cè)腎上腺,常規(guī)石蠟包埋切片,取腎上腺直徑最寬部切片脫蠟,HE染色,脫水,樹膠封片后觀察。1.6單因素方差分析采用SAS6.12統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素方差分析檢驗組間差異,顯著性水平為P<0.05,非常顯著性水平為P<0.01。統(tǒng)計數(shù)值均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2結(jié)果2.1底層細(xì)胞抑制光鏡下顯示,從各自訓(xùn)練的第4周開始,Ta、Tb組部分大鼠動情周期出現(xiàn)輕度抑制,表現(xiàn)為陰道脫落細(xì)胞中有少量中、底層細(xì)胞,且無動情期,動情間期及后期延長(圖1)。訓(xùn)練第5周,部分大鼠動情周期出現(xiàn)中度抑制,表現(xiàn)為中、底層細(xì)胞明顯增多,表層細(xì)胞體積變小(圖2)。訓(xùn)練至第6周,Ta組所有大鼠均存在不同程度的動情周期抑制,部分大鼠出現(xiàn)高度抑制,表現(xiàn)為出現(xiàn)大量的底層細(xì)胞(圖3)。隨著運動負(fù)荷的遞增,陰道中、底層細(xì)胞增多,到第7周達(dá)到峰值(表2)。2.2不同周遞增負(fù)荷訓(xùn)練前后血漿acth水平隨著訓(xùn)練負(fù)荷的遞增,大鼠腎上腺重量無明顯變化,但腎質(zhì)比(腎上腺重量與體重的比值)逐漸增大,Ta、Tb、Tc組與C組相比,均有非常顯著性差異(P<0.01)(表3)。在7周遞增負(fù)荷訓(xùn)練中,訓(xùn)練大鼠血漿ACTH呈正性增高,Ta組最高,ACTH水平與C組相比具有顯著差異(P<0.05),其余各組間均無顯著性差異(P<0.05)。Tar組血漿ACTH水平較Ta組有所下降。(表3)。2.3光顯微鏡下各組大鼠腎上腺皮質(zhì)的形態(tài)變化光鏡下Ta組大鼠腎上腺皮質(zhì)較對照組明顯增厚(圖4,圖5)。2.4各組大鼠胞漿內(nèi)東北部不同時點的狀態(tài)變化電鏡下C組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞連接緊密,胞漿內(nèi)線粒體呈橢圓型,形態(tài)規(guī)則,滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富(圖6)。Tc組大鼠胞漿內(nèi)線粒體較C組增多,可見線粒體分裂相(圖7)。Ta、Tb組大鼠細(xì)胞外微絨毛豐富,細(xì)胞間竇狀血管擴(kuò)張,細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富且形態(tài)發(fā)生改變,線粒體多半包裹或全包裹于脂滴周圍(圖8~圖10)。Tar組可見竇狀血管明顯擴(kuò)張,微絨毛稀少,胞質(zhì)內(nèi)有膽固醇結(jié)晶體,胞漿濃縮,輕度核固縮(圖11)。3討論3.1大鼠陰道脫細(xì)胞正常,動情周期規(guī)律雌性大鼠的正常動情周期約為4天左右,分為動情前期、動情期、動情后期和間期。陰道脫落細(xì)胞是指脫落在陰道表層的鱗狀上皮細(xì)胞,其在性激素的作用下,發(fā)生周期性變化。因此,陰道脫落細(xì)胞變化是反映性腺軸功能情況的重要體征之一。正常情況下,低倍光鏡只能觀察到表層細(xì)胞、白細(xì)胞和粘液,極少看到中、底層細(xì)胞。正常生活狀態(tài)和小運動量訓(xùn)練狀態(tài)下,雌性大鼠陰道脫落細(xì)胞正常,動情周期規(guī)律。本實驗中,經(jīng)過4周遞增負(fù)荷訓(xùn)練,部分大鼠陰道脫落細(xì)胞中出現(xiàn)中、底層細(xì)胞,動情周期開始紊亂,分期不明顯;經(jīng)過5周訓(xùn)練,絕大多數(shù)大鼠出現(xiàn)一定程度的動情周期抑制,部分大鼠出現(xiàn)較多的中、底層細(xì)胞;訓(xùn)練6~7周后,Ta組大鼠均出現(xiàn)不同程度的動情周期抑制,陰道脫落細(xì)胞中出現(xiàn)大量底層細(xì)胞,提示長期大運動量訓(xùn)練在一定程度上抑制了雌性大鼠的生殖系統(tǒng)功能。這與長跑運動員有較高的AMI甚至AA發(fā)生率相類似。經(jīng)過1周的休息,Tar組大鼠中、底層細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢,提示性腺軸功能在逐漸恢復(fù)。3.2增加負(fù)荷運動對大鼠腎上腺實質(zhì)梁狀帶的結(jié)構(gòu)和功能的影響3.2.1tb、ta大鼠臟器正常功能及激發(fā)動情周期的大鼠肝腎功能狀態(tài)變化遞增負(fù)荷訓(xùn)練后,大鼠腎上腺重量和腎質(zhì)比均隨訓(xùn)練周期的延長而增大。光鏡下Ta組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶結(jié)構(gòu)與對照組相比明顯增厚,表明運動應(yīng)激刺激了腎上腺皮質(zhì)的增生。電鏡下正常大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)有較豐富的滑面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和呈泡狀嵴的圓型線粒體,依據(jù)不同的功能狀態(tài)胞漿內(nèi)脂滴可多可少,細(xì)胞連接緊密。隨著訓(xùn)練負(fù)荷量增大和周期的延長,Tb、Ta組大鼠腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞與對照組相比較發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)變化。從超微病理學(xué)角度分析,腎上腺一系列的形態(tài)學(xué)改變進(jìn)一步表明在長期大負(fù)荷運動誘導(dǎo)的動情周期抑制過程中,雌性大鼠腎上腺皮質(zhì)明顯增生,且在束狀帶細(xì)胞對底物吸收以及激素合成分泌等方面表現(xiàn)出明顯亢進(jìn)?；謴?fù)1周后,出現(xiàn)胞漿內(nèi)形成膽固醇結(jié)晶體、胞漿濃縮、輕度核固縮等現(xiàn)象,提示運動應(yīng)激停止后,腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞分泌功能下降,細(xì)胞有一定程度受損,可能會走向凋亡,推測這可能是恢復(fù)1周后,大鼠腎質(zhì)比下降的主要原因。3.2.2血漿acth檢測ACTH是腺垂體促腎上腺皮質(zhì)激素細(xì)胞分泌的一種多肽激素,其分泌主要受下丘腦的調(diào)控和糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid,GC)的負(fù)反饋調(diào)節(jié),呈明顯的晝夜節(jié)律性變化規(guī)律。隨著運動負(fù)荷的遞增,大鼠血漿ACTH濃度呈升高趨勢,且Ta組和對照組相比具有顯著性差異?；謴?fù)1周后,大鼠血漿ACTH仍處于較高水平。而前期相同大鼠實驗?zāi)Ｐ徒Y(jié)果也顯示,隨著訓(xùn)練負(fù)荷的遞增,大鼠血漿皮質(zhì)酮含量相應(yīng)增高,而這不符合腎上腺軸的正常功能調(diào)節(jié)規(guī)律。導(dǎo)致血漿ACTH升高的原因可能是:(1)運動引起中樞內(nèi)環(huán)境的變化,激活下丘腦腎上腺中樞促腎上腺釋放激素(CorticotropinReleasingHormone,CRH)神經(jīng)元,通過釋放CRH,促進(jìn)ACTH的分泌。(2)長時間大負(fù)荷訓(xùn)練引起下丘腦和腺垂體處糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor,GR)表達(dá)下調(diào),從而減弱了GC的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。上述結(jié)果進(jìn)一步驗證了長期大負(fù)荷訓(xùn)練可激活整個HPA軸。3.3大負(fù)荷訓(xùn)練與gc-ms條件的作用機(jī)制本實驗結(jié)果表明,雌性大鼠遞增負(fù)荷訓(xùn)練的過程是逐漸出現(xiàn)動情周期抑制的過程,也是HPA軸不斷活化的過程。HPA軸活化到一定水平之后出現(xiàn)動情周期抑制,提示HPA軸可能在AMI形成中發(fā)揮重要作用。一些人體實驗也得出了同樣的結(jié)論。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),運動性閉經(jīng)患者和單純性下丘腦性閉經(jīng)患者的血漿HPA軸激素均處于高水平,且應(yīng)激停止后,HPA軸激素水平的恢復(fù)明顯有利于生殖系統(tǒng)功能的恢復(fù),提示防止HPA軸的過度活化及盡快恢復(fù)其正常是防治AMI的重要環(huán)節(jié)。在下丘腦部位,CRH神經(jīng)元和促性腺激素釋放激素(GonadotropinReleasingHormone,GnRH)神經(jīng)元之間存在著直接的突觸聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn),GnRH分泌具有CRH劑量依賴性,即體外補(bǔ)充CRH能直接抑制GnRH的釋放,并導(dǎo)致促性腺激素分泌下降。在腺垂體部位,ACTH細(xì)胞分泌的ACTH可直接刺激腎上腺皮質(zhì)增生和GC的釋放,前期和本次實驗結(jié)果均證實了這一點,大負(fù)荷訓(xùn)練引起了大鼠腎上腺皮質(zhì)明顯增厚,血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高,腎質(zhì)比、皮質(zhì)酮與負(fù)荷量呈正相關(guān)。此外,ACTH細(xì)胞分泌的促脂激素(LDH)降解產(chǎn)物β內(nèi)啡肽(β-Endorphin,β-EP)是公認(rèn)的大腦強(qiáng)抑制劑,遞增負(fù)荷運動中,血漿β-EP成倍增加,β-EP對性腺中樞GnRH細(xì)胞分泌有直接抑制作用。在高水平ACTH的刺激下,腎上腺皮質(zhì)增生并產(chǎn)生大量GC。正常情況下,GC參與調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、生長發(fā)育、免疫以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等幾乎所有生理過程。運動狀態(tài)下,一方面,GC能直接抑制GnRH細(xì)胞的分泌脈沖,影響LH的合成釋放;另一方面,GC還可能通過影響訓(xùn)練中機(jī)體的能量代謝過程,從而引發(fā)運動性閉經(jīng)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)機(jī)體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)時,即能量攝入低于一定的閾值時易發(fā)生閉經(jīng)。這一過程與機(jī)體內(nèi)GR的下調(diào)有關(guān),并得到了動物實驗的支持。在運動過程中,尤其是過度訓(xùn)練中,產(chǎn)生高濃度GC的