生物顯微技術(shù)染色和組織化學課件

1、生物顯微技術(shù)染色和組織化學染色 活體染色：無毒染料注入動物體內(nèi)，一定時間后取材，固定切片或鋪片觀察 臺盼藍，臺盼紅，墨汁。 固定后染色：生物顯微技術(shù)染色和組織化學 媒染劑：組織媒染劑-染料 復合體。 增強劑：加強染色的選擇強度。 加速劑：加強染料的滲透作用。生物顯微技術(shù)染色和組織化學蘇木精(hematoxylin)、伊紅（eosin）染色法（染色） 蘇木精將細胞核染成紫藍色，伊紅將細胞質(zhì)（漿）染成紅色。 蘇木精是具有陽離子的堿性染料，可以與具有陰離子基因的組織成分耦合成鹽，凡組織結(jié)構(gòu)對蘇木精起紫藍色反應的稱為嗜堿性（basophil）。 伊紅是具有陰離子的酸性染料，可以與具有陽離子基因的組織伊

2、紅起紅色分耦合成鹽，凡組織結(jié)構(gòu)對伊紅起紅色反應的稱為嗜酸性（acidophil）。對堿性或酸性染料親和力均不強者，則稱為中性。 生物顯微技術(shù)染色和組織化學Delafield 蘇木精液 蘇木精 4g 無水乙醇 25ml（溶解） 10%銨礬水 400ml， 甘油 100ml， 甲醇或95%乙醇 100ml。 陽光空氣中放3-4個月生物顯微技術(shù)染色和組織化學石蠟切片蘇木精染色步驟 切片脫蠟：二甲苯兩次，每次10-20分鐘。 梯度酒精下行入水：100%-90%-80%-70%-60%-50%-水 蘇木精染色10分鐘左右，水洗。 分色：1%鹽酸的70%乙醇中。使核著色，核以外的成分無色。水洗。 1%伊紅

3、的70%酒精復染1分鐘 95%乙醇分色生物顯微技術(shù)染色和組織化學 95%乙醇漂洗，無水乙醇脫水。 無水乙醇：二甲苯=1：1 一次 二甲苯兩次 加膠封片生物顯微技術(shù)染色和組織化學染色結(jié)果 細胞核藍紫色，細胞質(zhì)、膠原纖維、肌纖維呈不同色調(diào)的粉紅色。 生物顯微技術(shù)染色和組織化學 進行性染色： 退行型染色： 分色生物顯微技術(shù)染色和組織化學 組織化學生物顯微技術(shù)染色和組織化學定義 組織化學也稱細胞化學，是在組織的原位上顯示并研究其化學性質(zhì)和功能關(guān)系的一門科學技術(shù)。 組織化學是細胞形態(tài)學與化學、生物化學之間的邊緣科學。根據(jù)已知的化學反應，在細胞原位上以化學反應顯示出該細胞中的化學成分、性質(zhì)、及其變化，從而

4、將結(jié)構(gòu)和機能更緊密的聯(lián)系在一起。生物顯微技術(shù)染色和組織化學借助這一技術(shù)可以： 直接觀察到細胞的形態(tài)特征； 可以觀察到該細胞的化學成分、化學性質(zhì)； 在不同生理狀態(tài)下，組織形態(tài)、化學性質(zhì)的變化研究可以闡明細胞的功能。生物顯微技術(shù)染色和組織化學組織化學的技術(shù)要求 保存細胞的生前結(jié)構(gòu)。 保存細胞生前的化學成分和酶活性。 所用的化學方法是已知的化學反應，具有高度的特異性。 反應產(chǎn)物應是一種能形成穩(wěn)定沉淀的有色物質(zhì)，供光鏡觀察；或電子密度高的物質(zhì)供電鏡觀察。生物顯微技術(shù)染色和組織化學組織化學的特點 定性 定位 相對定量研究細胞或組織中的化學物質(zhì)。生物顯微技術(shù)染色和組織化學研究內(nèi)容 蛋白質(zhì)：酶類、抗原等具有

5、某種特異功能的蛋白。 核酸：DNA和RNA 糖類 脂類 無機鹽和微量元素生物顯微技術(shù)染色和組織化學糖類顯示最常用于顯示細胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是過碘酸-雪夫反應（periodic acid Schiff，PAS反應)?；驹硎牵禾潜粡娧趸瘎┻^碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者與Schiff試劑中的無色品紅亞硫酸復合物結(jié)合，形成紫紅色反應產(chǎn)物,PAS反應陽性部位即表示多糖的存在。 生物顯微技術(shù)染色和組織化學 脂類顯示 脂類物質(zhì)包括脂肪與類脂。標本可用甲醛固定、冷凍切片、用油紅、蘇丹、蘇內(nèi)、蘇丹黑B、尼羅藍等脂溶性染料染色；亦可用餓酸固定兼染色，脂類呈黑色。 生物顯微技術(shù)染色和

6、組織化學核酸顯示顯示DNA的傳統(tǒng)方法為Feulgen反應。切片先經(jīng)稀鹽酸處理后， 使細胞內(nèi)DNA水解，打開DNA分子中膠氧核糖核酸和嘌呤堿之間的連接按鍵，使其釋放出醛基，再用Schiff試劑處理，形成紫紅色反應產(chǎn)物。如用甲基綠-派若寧反應，可同時顯示細胞內(nèi)的DNA和RNA甲基綠與細胞核中的DNA結(jié)合呈藍綠色，派若寧與核仁及胞質(zhì)內(nèi)的RNA結(jié)合呈紅色。 生物顯微技術(shù)染色和組織化學分類v一般組織化學一般組織化學 它的基本原理是在組織切片上滴加一定試劑，使它與組織細胞內(nèi)某種化學物質(zhì)起反應，并在原位形成有色沉淀產(chǎn)物，通過觀察該產(chǎn)物，可對某種化學物質(zhì)進行定位、定性及定量的研究。 v熒光組織化學熒光組織化學

7、 它的基本原理是用熒光顯微鏡以短光波紫外線作光源，紫外線可激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)，使其呈現(xiàn)熒光圖象，借以了解細胞組織中的不同化學成分的分布。 v免疫組織化學免疫組織化學 是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)。它的基本原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特點，檢測細胞中某種肽類及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的分布生物顯微技術(shù)染色和組織化學生物顯微技術(shù)染色和組織化學酶類的顯色方法酶的分類 水解酶 氧化還原酶 轉(zhuǎn)化酶 連接酶 裂解酶 異構(gòu)酶生物顯微技術(shù)染色和組織化學酶的組織化學反應 偶氮染料法 吲哚酚法 金屬鹽法 氧化-還原反應生物顯微技術(shù)染色和組織化學生物顯微技術(shù)染色和組織化學堿性磷酸酶鈣-鈷顯示法原理：RPO3-ROH+H

8、3PO42H3PO4 +3Ca(NO3)2-Ca3(PO4)2 +6HNO3Ca3(PO4)2 + 3Co(NO3)2 - Co(PO4)2 + 3Ca(NO3)2Co(PO4)2 +3(NH4)2S-3CoS+2 (NH4)3 PO4生物顯微技術(shù)染色和組織化學堿性磷酸酶作用液(pH93) 溶液1：2甘油磷酸納 2巴比妥納 2硝酸鈣 2硫酸鎂(或氯化鎂) 蒸餾水 溶液2： 1硝酸鈣。 溶液3： 1硝酸鉆。 溶液4： 1硫化銨(臨用時現(xiàn)配)生物顯微技術(shù)染色和組織化學方法 切片脫蠟入水 入堿性磷酸酶作用液作用2h，但在切片入作用液前，應將作用液置37c溫箱中30min(注意：對照片在作用液內(nèi)免去甘油磷酸鈉，或進作用液前，放在沸水中煮78min)。 過蒸餾水一次，浸入1的硝酸鈣中2-3min。 過蒸餾水一次，浸入1的硝酸鈷中2-3min。 蒸餾水洗1mm，人1硫化